陽(yáng) 剛，楊第芹，曹文濤,2，王曉丹

白酒糟纖維素降解菌的優(yōu)選及酒糟降解工藝

陽(yáng) 剛1，楊第芹1，曹文濤1,2※，王曉丹1

（1. 貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2. 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025）

白酒釀造行業(yè)產(chǎn)生的酒糟含有大量纖維素，不僅原料利用率低，而且丟棄的酒糟會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染。為了獲得酒糟纖維素降解能力強(qiáng)的微生物并進(jìn)行應(yīng)用，從醬香型酒醅、清香型酒醅、濃香型大曲、竹林里的土壤腐殖質(zhì)中分離篩選酒糟纖維素降解菌，并對(duì)菌種分類(lèi)、理化特征和降解酒糟的特性進(jìn)行研究。pH值、溫度和酒精脅迫性試驗(yàn)進(jìn)一步確定了最佳酒糟纖維素降解菌為B2菌株，該菌株在pH值3.0、溫度44 ℃、酒精含量為體積分?jǐn)?shù)4%環(huán)境中生長(zhǎng)良好。基于形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)分析，鑒定B2菌株為枯草芽孢桿菌（）。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，確定了B2菌株降解酒糟的最佳工藝條件為酒糟添加量71 g/L、溫度37 ℃、pH值6.4、接種量8%，此時(shí)酒糟降解率為15.23%。該研究豐富了酒糟纖維素降解菌的微生物資源庫(kù)，同時(shí)為酒糟的資源化利用提供技術(shù)參考。

纖維素；降解；廢棄物；白酒糟；纖維素酶；枯草芽孢桿菌；篩選；酒糟處理

0 引 言

白酒糟是糧谷物和糠殼等混合物經(jīng)固態(tài)發(fā)酵、蒸餾制得白酒后的副產(chǎn)物，并富含纖維素、蛋白質(zhì)等有機(jī)物[1]。中國(guó)每年能產(chǎn)生3 000萬(wàn)t左右的白酒糟[2-4]，由于缺乏有效的處理方法，不僅造成了酒糟浪費(fèi)，而且丟棄的酒糟會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染[5-6]。目前，對(duì)白酒糟進(jìn)行資源化利用的主要方式是動(dòng)物飼料原料，但是對(duì)酒糟進(jìn)行脫毒等處理會(huì)使成本增加，也沒(méi)有直接證據(jù)表明酒糟飼料具有良好品質(zhì)。此外中國(guó)白酒釀造基地分布廣，也有很多是小作坊，對(duì)酒糟實(shí)現(xiàn)集中收集和處理尚存在難度。因此，開(kāi)發(fā)酒糟處理方式，實(shí)現(xiàn)酒糟就地處理，提高經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益，顯得十分重要。

白酒糟的纖維素含量占白酒糟干質(zhì)量的20%左右[1,7]，酒糟中纖維素的降解成為了酒糟資源化利用的關(guān)鍵一步。纖維素是多個(gè)葡萄糖分子通過(guò)-1,4-糖苷鍵連接而成的一種多糖，廣泛存在植物中[8-9]。而纖維素酶是一種包括內(nèi)切葡聚糖酶（Endoglucanase）、外切葡聚糖酶（Exoglucanase）、-葡萄糖苷酶（-glucosidase）的復(fù)合酶，它可以將纖維素水解成葡萄糖供酵母菌等微生物利用。實(shí)際上微生物纖維素酶在造紙、紡織、生物燃料、食品與飼料工業(yè)、農(nóng)業(yè)等行業(yè)都有潛在的應(yīng)用前景[10]。然而，長(zhǎng)期以來(lái)，缺乏纖維素酶高產(chǎn)菌株是纖維素酶大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的瓶頸[11]。

目前，各國(guó)研究者已經(jīng)從溫泉[12]、牛糞[13]、土壤[14]、腐爛木材[15]等篩選產(chǎn)纖維素酶菌，結(jié)果表明產(chǎn)纖維素酶菌有細(xì)菌中的芽孢桿菌、熱桿菌、熱酸菌、纖維弧菌等，真菌中的木霉、黑曲霉、青霉等，放線菌中的小單孢菌、鏈霉菌等，古菌中的嗜熱菌等[10,16]。有學(xué)者從酒醅[17-18]、大曲[19]、白酒糟[20]中篩選產(chǎn)纖維素酶菌，但纖維素酶活不高?？紤]到酒醅和大曲中的微生物，尤其是醬香型白酒中的，是經(jīng)過(guò)了高溫、高酸、高濃度酒精等因素脅迫，從中篩選到優(yōu)良菌株具有潛力，然而醬香型白酒作為重要的產(chǎn)纖維素酶菌生物資源庫(kù)，卻沒(méi)有相關(guān)研究報(bào)道。關(guān)于微生物降解白酒糟的研究，其中蘭小艷等[21]利用白腐菌使酒糟中的纖維素降解率達(dá)到了9.5%，從而提高酒糟的利用價(jià)值；何頌捷等[22]從酒醅和泥窖中篩選到一株羧甲基纖維素鈉酶活為49.31 U/mL的貝萊斯芽孢桿菌，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵酒糟的降解率為22.1%，雖然指出該菌株存在潛在應(yīng)用價(jià)值，但是并沒(méi)有報(bào)道該菌株對(duì)環(huán)境的耐受性以及溫度、pH值等因素對(duì)降解酒糟的影響，尚不足指導(dǎo)菌株的實(shí)際應(yīng)用?？傮w來(lái)看，目前研究集中在產(chǎn)纖維素酶菌篩選、鑒定與特性研究，對(duì)所篩選菌進(jìn)行白酒糟降解應(yīng)用研究較少，尚未有白酒糟降解工藝研究報(bào)道。

本研究結(jié)合剛果紅染色與酶活力復(fù)篩試驗(yàn)，從酒醅、大曲和土壤中分離篩選產(chǎn)纖維素酶菌，結(jié)合菌株鑒定結(jié)果和脅迫性試驗(yàn)，最終確定酒糟降解微生物。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法評(píng)價(jià)了酒糟降解處理?xiàng)l件，旨在獲得優(yōu)良菌株，為酒糟的無(wú)害化處理和資源化利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

醬香型酒醅、清香型酒醅、濃香型大曲分別于2019年3月從貴州省某酒廠、重慶某酒廠、四川某酒廠采集，土壤采集于貴陽(yáng)市十里河灘風(fēng)景區(qū)的小竹林。

1.2 培養(yǎng)基

1）富集培養(yǎng)基：CMC-Na 10.0 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 5.0 g，CaCl20.1 g，KH2PO41.0 g，(NH4)2SO42.0 g，MgSO4?7H2O 0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值 6.8。

2）分離培養(yǎng)基：CMC-Na 10.0 g，NaCl 5.0 g，CaCl20.1 g，KH2PO41.0 g，(NH4)2SO42.0 g，MgSO4?7H2O 0.5 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.8。

3）純化培養(yǎng)基：CMC-Na 10.0 g，NaCl 5.0 g，CaCl20.1 g，KH2PO41.0 g，(NH4)2SO42.0 g，MgSO4?7H2O 0.5 g，蛋白胨3.0 g，酵母浸粉3.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.8。

4）液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基：純化培養(yǎng)基不添加瓊脂。

5）濾紙條液體培養(yǎng)基：(NH4)2SO41.0 g，MgSO4?7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，酵母膏0.1 g，蒸餾水1 000 mL，另外在培養(yǎng)基中加入濾紙條（1 cm × 6 cm），每個(gè)三角瓶放3條。

6）產(chǎn)酶培養(yǎng)基：CMC-Na10.0 g，蛋白胨3.0 g，酵母膏0.2 g，(NH4)2SO44.0 g，KH2PO44.0 g，MgSO4?7H2O 0.3 g，蒸餾水1 000 mL，pH值 6.8。

7）酒糟降解培養(yǎng)基：將產(chǎn)酶培養(yǎng)基的CMC-Na換為酒糟。

以上培養(yǎng)基均采用濕熱滅菌方式，121 ℃，20 min。

1.3 主要試劑與儀器

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、微晶纖維素、水楊苷、剛果紅均來(lái)自上海源葉生物公司；DNA提取試劑盒、瓊脂糖及引物，北京擎科生物技術(shù)公司；UV754N分光光度計(jì)，上海儀電公司；離心機(jī)，上海菲恰爾公司；恒溫水浴鍋，鞏義予華儀器公司；PCR儀，美國(guó)ABI公司；電泳儀，北京六一儀器廠；凝膠成像儀，上海培清科技公司。

1.4 方法

1.4.1 分離與純化

1）樣品預(yù)處理

分別稱(chēng)取10.0 g樣品于裝有玻璃珠的100.0 mL無(wú)菌水中，搖床振蕩（150 r/min）30 min以獲得菌懸液。

2）富集培養(yǎng)

取5.0 mL菌懸液的上清液于盛有95.0 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，搖床（28 ℃、150 r/min）培養(yǎng)48 h以獲得富集培養(yǎng)液。

3）稀釋涂布

用無(wú)菌水進(jìn)行10倍梯度稀釋富集液，分別取100L的10-3～10-7稀釋度的菌液涂布于分離培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)5 d。

4）純化與保藏

從涂布平板上挑取單個(gè)菌落在純化培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線，并把純化好的菌株置于4 ℃冰箱進(jìn)行斜面保藏。

1.4.2 定性初篩

1）水解圈試驗(yàn)（剛果紅染色試驗(yàn)）

將純化過(guò)的菌株點(diǎn)種在CMC-Na分離培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5 d。菌株培養(yǎng)結(jié)束后，將8～10 mL的1 g/L的剛果紅溶液從培養(yǎng)皿邊緣緩慢倒入，輕輕搖動(dòng)以使剛果紅溶液覆蓋整個(gè)平板，靜置30 min后，倒掉培養(yǎng)皿中液體，用4～5 mL的1 mol/L的NaCl溶液潤(rùn)洗平板一次，然后向培養(yǎng)皿加入8～10 mL的1 mol/L的NaCl溶液，靜置“脫色”30 min后倒掉培養(yǎng)皿中的液體，觀察并測(cè)量菌落和水解圈的直徑。

2）濾紙條崩解試驗(yàn)

將菌株接種到盛有10 mL液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基的試管中，28 ℃培養(yǎng)1 d以獲得種子液，再分別將5 mL種子液接種于裝有95 mL濾紙條液體培養(yǎng)基中，搖床（28 ℃、150 r/min）培養(yǎng)2 d，第3 天將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，然后每天定期觀察并記錄濾紙條降解情況。

1.4.3 酶活力復(fù)篩

1）粗酶制備

將菌株接種到液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)3 d后，取發(fā)酵液進(jìn)行離心處理（8 000 r/min、10 min），所得上清液為粗酶液。

2）酶活力單位定義

1個(gè)酶活力單位（1U）是在50 ℃、pH值 4.8的條件下，底物每分鐘被分解產(chǎn)生1mol葡萄糖所對(duì)應(yīng)的酶量[23]。

3）酶活測(cè)定與計(jì)算

分別以羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、水楊苷作為內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、-葡萄糖苷酶的分解底物，還原糖作為檢測(cè)指標(biāo)，并采用DNS法[24]測(cè)定。酶活計(jì)算如式（1）所示：

式中為酶活力，U/mL；為粗酶體積，mL；為酶解時(shí)間，min；為酶實(shí)際水解生成的還原糖量，mol；123分別為初始底物溶液中還原糖量、初始粗酶液中還原糖量、酶解后總體系還原糖量，mol。

1.4.4 酒糟降解及降解率測(cè)定

同1.4.2節(jié)中制備種子液，將種子液以5%接種量接種到酒糟降解培養(yǎng)基中作為試驗(yàn)組，對(duì)照組不接種，均設(shè)置3個(gè)平行，先于28 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)2 d，后于28 ℃靜置培養(yǎng)8 d。參照文獻(xiàn)[25-26]將發(fā)酵瓶中的樣品用蒸餾水全部洗滌出來(lái)，再做抽濾處理，最后將酒糟置于烘箱烘干至恒質(zhì)量。酒糟降解率的計(jì)算如式（2）所示：

1.4.5 形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定

參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[27]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[28]對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定。

1.4.6 分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)細(xì)菌基因提取試劑盒方法提取菌株的DNA；細(xì)菌擴(kuò)增引物（27F:5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）；PCR擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于4 ℃保存，并當(dāng)天送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)定的基因序列在GenBank中進(jìn)行BLAST相似性比對(duì)，采用MEGA5.05中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位，并將序列提交至GenBank，獲得GenBank accession number（基因庫(kù)登入號(hào)）。

1.4.7 pH、溫度及酒精脅迫性試驗(yàn)

pH脅迫性試驗(yàn)：將菌濃度為1×102～2×102CFU/mL的菌懸液涂布于pH值不同的純化培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d，然后觀察菌的生長(zhǎng)情況，以pH值6.8的平板為對(duì)照，給出生長(zhǎng)良好、生長(zhǎng)一般、生長(zhǎng)弱或不生長(zhǎng)3個(gè)評(píng)價(jià)等級(jí)，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行，下同。溫度脅迫性試驗(yàn)：將菌懸液涂布于純化培養(yǎng)基（pH值6.8）平板上，于不同溫度下培養(yǎng)3 d，以28 ℃的平板為對(duì)照。酒精脅迫性試驗(yàn)：將菌懸液涂布于乙醇終濃度不同的純化培養(yǎng)基（pH值6.8）平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d，以不添加乙醇的平板為對(duì)照；其中乙醇添加到平板中的方式是待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，后用過(guò)濾除菌方式把乙醇添加到培養(yǎng)基中。

1.4.8 酒糟降解單因素試驗(yàn)

根據(jù)酒糟添加量、培養(yǎng)溫度、pH值、接種量先后順序進(jìn)行試驗(yàn)，靜置培養(yǎng)10 d，酒糟降解率為檢測(cè)指標(biāo)。經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)，初始條件設(shè)為：28 ℃，pH值 6，接種量為1%；進(jìn)行酒糟添加量單因素試驗(yàn)時(shí)，在初始條件基礎(chǔ)上，酒糟添加量設(shè)為因變量（20、40、60、80、100、120 g/L）；進(jìn)行溫度單因素試驗(yàn)時(shí)，在酒糟添加量單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上（取最佳酒糟添加量），溫度設(shè)為因變量（23、28、31、34、37、40、43 ℃），以此類(lèi)推，再分別考查pH值(4、4.5、5、6、7、8)和接種量（1%、2%、4%、6%、10%、15%）對(duì)酒糟降解率的影響。

1.4.9 酒糟降解響應(yīng)面優(yōu)化

利用Design -Expert 11軟件進(jìn)行響應(yīng)面法（RSM）中的Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以酒糟降解率為響應(yīng)值，并利用該軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合和方差分析，并得到多元回歸方程模型；最后利用該軟件對(duì)方程模型進(jìn)行求解，以確定最佳條件，預(yù)測(cè)最佳響應(yīng)值，根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，以檢查模型準(zhǔn)確性。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理

用R語(yǔ)言的ggplot2包（3.2.1版本）繪圖；基于R語(yǔ)言的agricolae包（1.3-2版本）中的LSD.test函數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（方差分析、多重比較），采用Bonferroni校正的LSD法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)；Design-Expert 11軟件（Statease, Inc., Minneapolis, MS,USA）用于響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)（Box–Behnken Design）；Adobe illustrator CC 2014軟件用于矢量圖形處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離與篩選

2.1.1 分離與定性初篩

從醬香型酒醅、清香型酒醅、濃香型高溫大曲、竹林里的土壤腐殖質(zhì)樣品中，共分離出39株疑似產(chǎn)纖維素酶的菌株，經(jīng)過(guò)剛果紅染色法檢測(cè)，有19株菌能夠產(chǎn)生水解圈，其中A5、A9、B1、B2、C2、D12水解圈相對(duì)大且清晰（圖1a、1b）。剛果紅染色法檢測(cè)產(chǎn)纖維素酶菌原理是通過(guò)在培養(yǎng)基中添加纖維素或纖維素衍生物，若微生物能夠產(chǎn)生纖維素酶并能夠分解一定量底物，那么經(jīng)過(guò)剛果紅染色檢測(cè)就能在菌落周?chē)纬赏该魅Γㄋ馊蚯宄齾^(qū)），通常可以根據(jù)透明圈直徑大小或透明圈與菌落的直徑比來(lái)揭示微生物產(chǎn)纖維素酶能力相對(duì)強(qiáng)弱。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)透明圈直徑大小可能與其所產(chǎn)生的CMC-Na酶活力無(wú)明顯的相關(guān)性[26]，僅通過(guò)剛果紅染色法選擇以上6株菌作為最佳產(chǎn)纖維素酶?jìng)溥x菌存在一定風(fēng)險(xiǎn)。由于濾紙條崩解試驗(yàn)可以反映菌株所分泌各種纖維酶的綜合酶活力水平[29]，因此結(jié)合濾紙崩解試驗(yàn)進(jìn)一步定性判斷19株菌產(chǎn)纖維素酶能力。濾紙崩解試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明A5、A9、B1、B2、C2、D12菌株崩解濾紙形成段數(shù)較多，與剛果紅染色結(jié)果基本一致。C2菌株來(lái)自C系列樣品（濃香型高溫大曲），其在C系列中表現(xiàn)最好，所以暫時(shí)保留C2菌株進(jìn)行下一步研究。

圖1　剛果紅染色定性篩選結(jié)果

表1 菌株分解濾紙條情況

綜上因素，選擇A5、A9、B1、B2、C2、D12菌株進(jìn)一步進(jìn)行酶活力復(fù)篩。

2.1.2 酶活力復(fù)篩

酶活力復(fù)篩結(jié)果如表2所示，B1、B2菌株的3種纖維素酶活均顯著高于其他菌株（<0.05），而C2菌株酶活顯著低于其他菌株，這與剛果紅染色定性結(jié)果基本一致。

表2 復(fù)篩時(shí)6株菌纖維素酶活力值

注：同列不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（<0.05），下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significantdifferences (<0.05), and the following is the same.

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定，如圖2所示。菌株A5、C2的菌落呈圓形，質(zhì)地光滑，C2菌落呈黃色；A9菌株的菌落呈放射狀，菌落表面濕潤(rùn)； B1、B2菌株的菌落表面干燥帶有褶皺；D12菌株的菌落周?chē)纬伞昂谏亍保囵B(yǎng)3 d后，明顯能聞到強(qiáng)烈的泥腥味。在1 000倍油鏡觀察下，A5、A9、B1、B2、C2菌株的細(xì)胞形態(tài)為桿狀，細(xì)胞長(zhǎng)約為1～6m，細(xì)胞寬約為0.5～2m，D12菌株與一般桿狀細(xì)菌相比，細(xì)胞長(zhǎng)度明顯偏長(zhǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)約為5～15m，D12菌株與霉菌相比細(xì)胞寬度偏短。革蘭氏染色結(jié)果顯示，A5、A9、B1、B2菌株為陽(yáng)性，C2、D12菌株為陰性。生理生化鑒定，如圖3所示。參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，初步鑒定A5、A9、B1、B2為芽孢桿菌屬，C2為鞘氨醇單胞菌屬，D12為放線菌中的鏈霉菌屬。

圖2 6株菌的菌落和細(xì)胞形態(tài)

圖3 6株菌的生理生化特征

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

將菌株的16S rDNA序列測(cè)定結(jié)果提交至GenBank做BLAST比對(duì)（表3）。利用MEGA 5.05的鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖4所示。

表3 菌株相似性比對(duì)結(jié)果

圖4 基于菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定，A5菌株鑒定為（地衣芽孢桿菌），A9菌株初步鑒定為（臺(tái)中類(lèi)芽孢桿菌），B1菌株初步鑒定為（解淀粉類(lèi)芽孢桿菌），B2菌株初步鑒定為（枯草芽孢桿菌）、C2菌株鑒定為（嗜溫鞘氨醇桿菌），D12菌株鑒定為（暗產(chǎn)色鏈霉菌）。根據(jù)鑒定結(jié)果，將基因序列及相關(guān)信息提交至GenBank，獲得基因庫(kù)登入號(hào)，見(jiàn)圖4括號(hào)中的編號(hào)。

2.3 pH、溫度及酒精脅迫性分析

為了篩選產(chǎn)纖維素酶能力強(qiáng)，且具有良好耐受性的菌株，結(jié)合篩選試驗(yàn)和菌株鑒定結(jié)果，選取A9、B2、D12菌株進(jìn)行脅迫性分析，結(jié)果如圖5所示。因A5、C2菌株產(chǎn)纖維素酶能力較差，而B(niǎo)1與B2菌株來(lái)自同一個(gè)樣品，故本試驗(yàn)不考慮A5、B1、C2菌株。在pH脅迫性試驗(yàn)中，可以發(fā)現(xiàn)B2菌株在pH值4.0環(huán)境中生長(zhǎng)良好，考慮到白酒糟酸度高問(wèn)題，雖然酸度與pH值并不能等同，但是對(duì)pH值具有良好耐受的菌株在酒糟中更容易生存和繁殖，這將利于微生物進(jìn)行分解代謝等活動(dòng)。在溫度脅迫性試驗(yàn)組中，3株菌在40 ℃下生長(zhǎng)良好，而B(niǎo)2菌株仍能在44 ℃下良好生長(zhǎng)。在乙醇耐受性試驗(yàn)中，3株菌在乙醇體積分?jǐn)?shù)為4%的培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)已經(jīng)受到限制，體積分?jǐn)?shù)為2%的乙醇對(duì)B2和D12菌株的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯限制。綜上分析，選擇B2菌株作為酒糟降解試驗(yàn)菌。

圖5 菌株對(duì)pH值、溫度、乙醇的脅迫性

2.4 單因素試驗(yàn)

如圖6a所示，酒糟添加量對(duì)酒糟降解率影響顯著，酒糟添加量較少時(shí)或較高時(shí)，酒糟降解率均偏低，這可能是培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)失衡造成的，在酒糟添加量為60 g/L時(shí)，酒糟降解率達(dá)到最大值。如圖6b所示，在28～37 ℃內(nèi)，溫度對(duì)酒糟降解率的影響差異不顯著，在溫度為34 ℃時(shí)，酒糟降解率達(dá)到最大值。與Chang研究相似，Chang等在30 ℃培養(yǎng)條件下從土壤中篩選產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌，結(jié)果表明在30～37 ℃內(nèi)，芽孢桿菌對(duì)木質(zhì)纖維素降解率差異不明顯，在37 ℃時(shí)降解率最大[30]。如圖6c所示，較低pH值或較高pH值都不利于酒糟降解，pH值為6時(shí)，酒糟降解達(dá)到最大值。如圖6d所示，接種量對(duì)酒糟降解率的影響隨接種量增加而呈現(xiàn)先增加后減少趨勢(shì)，但是增加和減少的幅度均較小，在接種量為6%時(shí)，酒糟降解率達(dá)到最大值。

注：圖6a中，溫度28 ℃，pH值6，接種量1%；圖6b中，酒糟添加量60 g·L-1，pH值6，接種量1%；圖6c中，酒糟添加量60 g·L-1，溫度34 ℃，接種量1%；圖6d中，酒糟添加量60 g·L-1，溫度34 ℃，pH值6。

Note: In fig.6a, temperature is 28 ℃, pH value is 6, inoculation size is 1%; In fig.6b, added amount of distiller's grains is 60 g·L-1, pH value is 6, inoculation size is 1%; In fig.6c,added amount of distiller's grains is 60 g·L-1, temperature 34 ℃, inoculation size 1%; In fig.6d, added amount of distiller's grains is 60 g·L-1, temperature 34 ℃, pH value is 6.

圖6 B2菌株降解酒糟的單因素條件優(yōu)化

Fig.6 Optimization of single factor conditions for lees degradation by strain B2

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇最大響應(yīng)值及鄰近的水平，或拐點(diǎn)及鄰近水平作為響應(yīng)面分析的各因素的3個(gè)水平[31]。采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表4。

2.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

采用四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，酒糟的的降解率作為響應(yīng)值，試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

2.5.3 模型構(gòu)建及分析

利用Design-Expert 11軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸方程模型構(gòu)建，以編碼因子表示的方程（Coded Equation）為

=13.920 0+0.335 8+0.264 2+2.070 0+

0.285 8+0.122 5+0.295 0+0.810 0?

0.237 5?0.087 5+0.025 0?0.819 02?

0.061 52?2.900 02?0.801 52（3）

式中各項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值表示單因素對(duì)酒糟降解率的影響程度，正負(fù)反映影響方向。模型的方差分析結(jié)果，如表6所示。

模型的值<0.001，說(shuō)明該擬合模型極顯著。失擬項(xiàng)值為0.102 6（>0.05），表明失擬檢驗(yàn)不顯著，說(shuō)明該模型可用于酒糟降解的優(yōu)化[32-33]?；貧w模型的決定系數(shù)2=0.971 9，說(shuō)明此方程對(duì)試驗(yàn)擬合度結(jié)果比較好，誤差小；回歸模型的調(diào)整決定系數(shù)2Adj=0.943 8，說(shuō)明該模型能解釋94.38%響應(yīng)值的變化[34]。變異系數(shù)CV=4.06%，表明試驗(yàn)的重復(fù)性好，試驗(yàn)結(jié)果可靠[35]。綜上所述，可以采用該模型的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，以及確定酒糟降解的最優(yōu)參數(shù)條件。另一方面，由模型中的回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)對(duì)酒糟降解率影響顯著（<0.05），一次項(xiàng)對(duì)酒糟降解率影響極顯著（<0.001）；交互項(xiàng)對(duì)酒糟降解率影響高度顯著（<0.01）；二次項(xiàng)2、2和2對(duì)酒糟降解率影響極顯著（<0.001）。值可以反映各試驗(yàn)因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的重要性，值越大，表明對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大[31]。比較4個(gè)因素的值大小可知，>>>，進(jìn)而可知各因素對(duì)酒糟降解率的影響主次順序?yàn)? pH值、酒糟添加量、接種量、溫度，這與上文對(duì)模型方程各項(xiàng)系數(shù)分析結(jié)果一致。

表6 響應(yīng)面模型方差分析

注：* 差異顯著（<0.05）；** 差異高度顯著（<0.01）；*** 差異極顯著（<0.001）。2=0.971 9，2Adj=0.943 8，CV=4.06%。

Note: * significant difference,<0.05; ** highly significant difference,<0.01;*** extremely significant difference,<0.001.2=0.971 9,2Adj=0.943 8, CV=4.06%.

響應(yīng)面分析3D圖（圖7），可直觀地看出各因素之間的相互作用。各3D響應(yīng)曲面圖均表現(xiàn)出某2個(gè)因素對(duì)酒糟降解率的相對(duì)影響，其余因素均保持在0水平[32]。結(jié)合表6中交互項(xiàng)的顯著性分析，可知酒糟添加量與接種量的交互作用高度顯著。等高線是響應(yīng)面在水平方向的投影，在圖7a或7b或7c中做酒糟添加量所在軸的平行線，以方便分析，可以發(fā)現(xiàn)酒糟添加量對(duì)降解率的影響是：降解率先隨酒糟添加量增加而增加，后當(dāng)酒糟添加量繼續(xù)增加時(shí)，降解率反而減少，但是變化的幅度不是很大，這與單因素試驗(yàn)結(jié)果大致相同。同理，分析溫度、pH值、接種量對(duì)降解率影響，結(jié)果均與單因素試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

圖7 各因素交互作用對(duì)降解率影響的響應(yīng)面圖

2.5.4 最佳條件確定及RSM模型驗(yàn)證

利用Design-Expert 11軟件且基于單因素編碼水平為[-1,1]定義域?qū)貧w方程求最大值，結(jié)果表明酒糟添加量為70.817 9 g/L，溫度為37.000 0 ℃，pH值為6.345 0，接種量為8.203 1%，此時(shí)酒糟降解率為14.600 4%。為驗(yàn)證RSM模型可靠性，采用上述條件作為酒糟降解最佳工藝條件，考慮到實(shí)際操作的便利，將工藝條件修正為酒糟添加量71 g/L、溫度37 ℃、pH值6.4、接種量8%。以修正過(guò)的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)6次，實(shí)際測(cè)得的酒糟降解率平均值為15.23%，相對(duì)誤差為4.31%，表明該模型可以指導(dǎo)實(shí)踐。

3 討 論

目前關(guān)于白酒糟降解與利用的研究較少，很多酒糟被丟棄或是被填埋在地下，這對(duì)環(huán)境產(chǎn)生了一定污染[5]。雖然目前對(duì)酒糟進(jìn)行處理存在成本高問(wèn)題，但是在綠色發(fā)展大背景下，實(shí)現(xiàn)白酒糟合理處理、保護(hù)環(huán)境與節(jié)約資源卻十分必要。

由微生物生產(chǎn)的纖維素酶在工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用，盡管前人已經(jīng)篩選出了較多的纖維素降解菌，但能真正用于酒糟處理的菌株卻很少。明紅梅等[20]從白酒糟中篩選出一株CMC-Na酶活為13.71 U/g的地衣芽孢桿菌和一株酶活為9.25 U/g的枯草芽孢桿菌；李永博等[18]從濃香型酒醅中篩選出一株枯草芽孢桿菌，產(chǎn)酶條件優(yōu)化后CMC-Na酶活為38.84 U/mL；何頌捷等[22]從酒醅和窖泥中篩選出1株CMC-Na酶活為49.31 U/mL的貝萊斯芽孢桿菌和一株CMC-Na酶活為31.81 U/mL解淀粉芽孢桿菌；宋麗麗等[11]從白酒糟中篩選出一株CMC-Na酶活為36.73U/mL的巨大芽孢桿菌。由于產(chǎn)酶條件不同，尤其是一些文獻(xiàn)的酶活測(cè)定方法不太合理，因此通過(guò)對(duì)比CMC-Na酶活來(lái)評(píng)價(jià)篩選出來(lái)的B2菌株產(chǎn)酶能力，并不太合理。纖維素水解是基于內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、-葡萄糖苷酶協(xié)同作用，一些研究者僅以CMC-Na為底物來(lái)測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶活，進(jìn)而來(lái)評(píng)價(jià)菌株的產(chǎn)纖維素酶能力，這種做法應(yīng)該值得商榷。基于單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)控制體系中的pH值對(duì)酒糟降解十分重要，對(duì)指導(dǎo)酒糟降解或處理具有較大參考意義。

真菌具有水解酶體系完善、纖維素酶分泌量大等優(yōu)點(diǎn)[25]。木霉菌屬與曲霉菌屬作為產(chǎn)纖維素酶真菌的主要代表，研究得比較多。關(guān)于酒糟降解或者是從釀酒環(huán)節(jié)中的樣品篩選產(chǎn)纖維素酶真菌的研究相對(duì)較少。蘭小艷等[21]采用白腐菌使酒糟纖維素含量降低了9.5%，提高酒糟的利用價(jià)值。洋河酒廠將從大曲中篩選的產(chǎn)纖維素酶霉菌進(jìn)行甲基磺酸乙酯（EMS）誘變處理，然后與糖化酶、活性干酵母混合使用，出酒率提高了3.89%[36]。細(xì)菌由于具有較高的生長(zhǎng)速度、對(duì)基因工程具有較高的相容性和可行性等優(yōu)點(diǎn)[8]，產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌也受到了重視。然而，細(xì)菌水解纖維素效率低的問(wèn)題也很突出，基于纖維素降解需要眾多酶協(xié)同作用的機(jī)制，構(gòu)建復(fù)合菌系降解纖維素成為了研究熱點(diǎn)。李靜等[26]構(gòu)建由3種菌組成的復(fù)合菌系，結(jié)果較單菌株秸稈降解率提高了50.71%。王海濱等[29]構(gòu)建由5種菌組成的復(fù)合菌系，結(jié)果顯著提高了濾紙酶活力和對(duì)苦參殘?jiān)暗径挼慕到庑Ч?。日本學(xué)者Chang[30]用芽孢桿菌和乳酸菌聯(lián)合處理水稻秸稈，結(jié)果發(fā)現(xiàn)纖維素酶活性顯著提高，木質(zhì)素和半纖維素含量相應(yīng)降低。目前纖維素降解機(jī)制并不清楚，其中協(xié)同作用模型被更多學(xué)者接受。根據(jù)協(xié)同作用理論[37]，纖維素的降解過(guò)程大致分為4個(gè)步驟，首先是纖維素酶分子吸附到纖維素表面，接著是內(nèi)切葡聚糖酶在葡聚糖鏈的隨機(jī)位點(diǎn)水解底物產(chǎn)生寡聚糖；然后是外切葡聚糖酶從葡聚糖鏈的非還原端進(jìn)行水解，形成纖維二糖主要水解產(chǎn)物；最后是-葡萄糖苷酶將纖維素二糖水解為葡萄糖。此外，真菌分泌的多為胞外纖維素酶，不用依附于纖維素表面后才降解纖維素[38]。一些研究表明植物中含有的木質(zhì)素會(huì)對(duì)纖維素酶產(chǎn)生不可逆吸附，使一部分酶失活[39]。綜上所述，本文后期可以通過(guò)構(gòu)建復(fù)合菌系來(lái)模擬真菌完善的酶體系和減少纖維素酶產(chǎn)生的不可逆吸附，為協(xié)同作用提供有利條件，進(jìn)而提高酒糟的降解效果。

4 結(jié) 論

1）采用剛果紅平板篩選法，從醬香型酒醅、清香型酒醅、濃香型大曲、竹林里的土壤腐殖質(zhì)中共分離出39株菌。結(jié)合菌株產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、-葡萄糖苷酶的酶活，復(fù)篩出6株菌?；谛螒B(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)分析，6株產(chǎn)纖維素酶菌分別被鑒定為地衣芽孢桿菌、臺(tái)中類(lèi)芽孢桿菌、解淀粉類(lèi)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜溫鞘氨醇桿菌、暗產(chǎn)色鏈霉菌。pH、溫度和酒精脅迫性試驗(yàn)表明枯草芽孢桿菌（B2）具有良好的耐受性，在pH值3.0、溫度44 ℃、酒精體積分?jǐn)?shù)為4%環(huán)境中生長(zhǎng)良好。

2）將枯草芽孢桿菌B2菌株應(yīng)用于酒糟降解工藝研究，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken響應(yīng)面法進(jìn)行工藝優(yōu)化，確定了酒糟降解最佳工藝條件為：酒糟添加量71 g/L、溫度37 ℃、pH值 6.4、接種量8%；在此條件下，酒糟降解率為15.23%。

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Screening of cellulose degrading bacteria in distiller’s grains and degradation technology of distiller's grains

Yang Gang1, Yang Diqin1, Cao Wentao1,2※, Wang Xiaodan1

(1.,550025,; 2.,550025,)

Distiller’s grains serve as the important by-products in ethanol production, particularly on white spirits in China. Normally, the key grain can be processed in a solid-state fermentation, thereby to distill a mixture of grains and bran husks. After the processing, the distiller's grains can be remained readily available rich in organic matter, such as cellulose and protein. China can produce about 30 million tons of distiller's grains every year, as the consumption of white spirits increases. The discarded distiller's grains have become the waste of raw materials, further to pollute the environment, due to the lack of effective treatment methods. It is necessary to explore much more efficient disposal of distiller's grains. This study aims to explore the decomposition of distiller's grains, in order to obtain microorganisms with strong capacity of cellulose degradation in distillates. 39 strains of bacteria were isolated from in Chinese maotai-flavor fermented grains, Chinese mild-flavor fermented grains, Chinese strong-flavor Daqu starter and the soil of bamboo forest, using sodium carboxymethyl cellulose as the only carbon source. Six strains were quantitatively screened using Congo red staining and filter paper strip disintegration experiments for qualitative preliminary screening, combined with the endoglucanase, exoglucanase, and-glucosidase enzyme activities produced by the strains. Based on morphological, physiological, biochemical, and molecular biological characterization, six cellulase-producing bacteria were identified as,,, and,,. The optimum lees cellulose-degrading strain was further determined the B2 strain () inthe tests of pH, temperature, and alcohol stress. Specifically,B2 strain has demonstrated a good tolerance, while grew well in an environment of pH value 3.0, at the temperature of 44 ℃, and the alcohol content of 4% by volume. According to the single-factor test, a Box-Benhnken response surface method was used to optimize the processing parameters in the treatments. The optimal process conditions were determined to be 71 g/L distiller's grains, the temperature of 37 ℃, pH value 6.4, and the inoculation size of 8%, for the degradation of distiller's grains. In addition, the degradation rate of distiller's grains can reach 15.23% in this case. The findings demonstrated that the selectedcan effectively decompose distiller's grains, and thereby be expected to provide a promising application potential in the disposal of distiller's grains.

cellulose; degradation; wastes; distiller's grains; cellulase;; screening; vinasse processing

陽(yáng)剛，楊第芹，曹文濤，等. 白酒糟纖維素降解菌的優(yōu)選及酒糟降解工藝[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2020，36(13)：212-221.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.13.025 http://www.tcsae.org

Yang Gang, Yang Diqin, Cao Wentao, et al. Screening of cellulose degrading bacteria in distiller's grains and degradation technology of distiller's grains[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(13): 212-221. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.13.025 http://www.tcsae.org

2020-03-22

2020-05-20

貴州省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合支撐[2018]2314）

陽(yáng)剛，主要從事釀酒微生物及生物建模研究。Email：GZ_university_YG@163.com

曹文濤，教授，主要從事白酒糟資源化利用及釀酒微生物應(yīng)用研究。Email:452794932@qq.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.13.025

Q939.96; TS261.1

A

1002-6819(2020)-13-0212-10