袁銘悅 李翔 劉紅佶 劉歡 李祥玉

青光眼(glaucoma)是以特異性視神經(optic nerve，ON)損傷和視功能損害為特征的一類眼病，是全球僅次于白內障、可導致視力喪失的主要原因[1]。據統(tǒng)計，2013年，全世界40～80歲人群中，青光眼患病率為3.54%，有6 426萬，預計到2020年和2040年分別將達7 602萬和11 182萬，約有60%青光眼患者分布在亞洲[2]。青光眼視功能損害的病因、病機復雜，迄今尚未明確。近年來，許多學者提出青光眼是一種中樞神經退行性病變[3]，病變涉及了包括視網膜神經節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)、視神經、視交叉、視束、外側膝狀體(lateral geniculate nucleus，LGN)、視放射、視皮質(visual cortex，VC)整個視路。因此，青光眼視功能保護研究應深入到視神經顱內段更廣闊的范疇。

Qing G等[4]利用核磁共振檢查原發(fā)性開角型青光眼患者發(fā)現(xiàn)中心視野未受損時相對應的VC區(qū)的神經元已出現(xiàn)了對視覺刺激的反應下降，表明青光眼患者視皮質神經元損傷可能早于目前常用視野計能檢測到的視野改變，由此推斷青光眼患者視皮質的改變可能不僅是RGCs及視神經的損傷的繼發(fā)改變，還有可能是其主動參與了青光眼的發(fā)病。中醫(yī)藥對此的相關報道并不多。本實驗采用烙閉上鞏膜靜脈的方法誘導產生眼壓維持穩(wěn)定、持續(xù)時間較長的慢性高眼壓(elevated intraocular pressure，EIOP)模型，選用杞菊地黃丸合復方丹參片作為干預藥物，通過SD大鼠眼壓(intraocular pressure，EIOP)，初級視皮質(primary visual cortex，PVC)中尼氏小體、磷酸化FoxO1、IKK2的含量等客觀指標觀察補腎活血中藥對大鼠慢性EIOP模型PVC損害的干預，探討SD大鼠慢性EIOP模型視功能損害的中樞機制和補腎活血中藥的干預及作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 清潔級SD大鼠30只，雌雄各半，8～12周齡，體重160～200g。飼養(yǎng)條件：空氣流通，相對濕度55%～75%，室溫20～25℃，12小時光照維持，晝夜循環(huán)，自由攝食飲水。納入標準：①外眼無異常；②雙眼瞳孔直間接對光反射無異常；③無歪頸。

1.1.2試劑 FoxO1(phospho-Ser319)抗體、IKK2抗體均由BeacomBio提供，批號分別為：BIO95906、BIO87319。

1.2 分組與給藥方法

動物購回后，適應性喂養(yǎng)3天，進行IOP測量，正常IOP區(qū)間估計，取平均IOP在9～18mmHg者，以SPSS 20.0統(tǒng)計軟件產生隨機數字，分為3組，對照組，模型組和給藥組進行單眼(右眼)造模。

對照組和模型組每天予3ml生理鹽水灌胃；給藥組以成人劑量的20倍換算，每天灌胃予0.96g/kg體重的復方丹參片、3.0g原生藥/kg體重的杞菊地黃丸的混懸液3ml灌胃(混懸液制作：將復方丹參片、杞菊地黃丸磨成粉狀，加入生理鹽水)。每周稱體重1次，根據大鼠體重變化調整給藥量。每天同一時間段給藥(16∶00-17∶00)。造模后1周開始給藥，連續(xù)給藥8周。

1.3 取材方法

大鼠灌胃8周后，大腦灌注固定法(參陳浩宇等[5]，結合本實驗加以改良)： 3%戊巴比妥鈉溶液腹腔麻醉大鼠，大鼠仰臥暴露腹部，固定四肢，劍突下剪開胸腔，暴露心臟，將套有16號灌胃針針頭的注射器經左心室插入升主動脈，同時剪開右心耳，快速推注含肝素鈉注射液(20u/ml)生理鹽水50 ml沖洗，以無血液流出為度，換4%多聚甲醛溶液50～80 ml灌注固定，先快后慢，約 10～15 min推完固定液，灌注結束后，開顱取出腦組織，固定液固定72h。

1.4 眼壓測量

TNON-PEN XL眼壓計每天同一時間段(14∶00-16∶00)測量IOP。術前3天連續(xù)測量大鼠IOP，取平均值為正常IOP；術后即刻、術后1w、術后2 w、術后4w、術后6w、術后8w，各測1次各組大鼠右眼IOP。

1.5 免疫組化檢測PVC中磷酸化FoxO1、IKK2

腦組織固定72h后，參照《大鼠腦立體定位圖譜(第三版)》[6]切取視皮質區(qū)腦組織，標本逐級酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，做4μm連續(xù)切片，烘干備用。分別用BeacomBio的FoxO1(phospho-Ser319)及IKK2抗體染色，檢測PVC磷酸化FoxO1、IKK2含量。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 補腎活血中藥對SD大鼠慢性EIOP模型IOP的影響見表1

表1 各組大鼠組間及造模、用藥前后IOP比較

2.2 補腎活血中藥對SD大鼠慢性EIOP模型PVC中磷酸化FoxO1表達的影響見表2(圖1)。

表2 補腎活血中藥對SD大鼠EIOP模型PVC中磷酸化FoxO1表達的影響

表3 補腎活血中藥對SD大鼠EIOP模型PVC中磷酸化IKK2表達的影響

圖1 各組大鼠PVC中磷酸化FoxO1含量(免疫組化×400)Fig.1 p-FoxO1 in PVC of rats of all groups(Immunohistochemical method x400)

圖2 各組大鼠PVC中IKK2含量(免疫組化×400)

3 討論

青光眼視功能損害的病因、病機復雜，迄今尚未明確。目前認為，青光眼視功能損害可由多種因素共同作用引起的。目前認為，青光眼視功能損害可由多種因素引起，近年來，許多學者提出青光眼是一種中樞神經退行性病變[3]，青光眼患者視皮質的改變可能不僅是RGCs及視神經的損傷的繼發(fā)改變，還有可能是其主動參與了青光眼的發(fā)病。

青光眼類似中醫(yī)的“五風內障”及“青盲”，多由風、火、痰、郁、虛等導致氣血失和，氣滯血瘀，玄府閉塞，神水瘀積為病，病久肝腎兩虧，神光衰微甚至泯滅、不睹三光而成“青盲”，所以肝腎虛損、脈絡瘀滯是青光眼視神經病理改變的主要病機，滋養(yǎng)肝腎、活血化瘀為防治青光眼視神經損害的基本方法[7]。本實驗選用杞菊地黃丸和復方丹參片作為研究藥物，滋養(yǎng)肝腎、活血化瘀，杞菊地黃丸為經典古方，為滋補肝腎明目的代表方劑，復方丹參片活血化瘀，兩者均為《中國藥典》載入藥品，非處方用藥，經濟實用，服用方便。我們前期研究也證實具有補腎活血中藥(杞菊地黃丸和復方丹參片合用)對SD大鼠慢性EIOP模型視網膜、視神經、視中樞損傷及眼壓控制后的青光眼患者視功能均有一定的保護作用[8-18]。

本實驗病理組織學觀察了PVC PI3K/Akt通路上磷酸化FoxO1和IKK2的表達。

近年來，關于PI3K/Akt信號通路(磷酸肌醇-3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸激酶，phosphatidylinostiol 3′-OH kinase/ protein kinase B，PI3K /Akt)調控細胞凋亡研究較多。Akt在PI3K調控下激活后，通過多種途徑對細胞凋亡進行調控。包括①抑制NF-κB、FoxOs等轉錄因子的活性，調控凋亡；②磷酸化Bad、抑制caspase-9的磷酸化過程、抑制GSK-3活性，抑制凋亡；③抑制線粒體相關功能，抑制凋亡等[19]。FoxO1是FOX亞家族FoxO家族的一員，磷酸化后，會由細胞核轉移到細胞質中，與細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白結合，抑制細胞正常的周期、損傷修復及代謝活動，從而導致細胞周期停滯和凋亡[20-22]。IKK2為IKK的催化亞基[23]，是細胞因子介導的核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)活化所必須的亞基結構[24]。NF-κB在生物體內各種類型的細胞中均存在，對細胞的凋亡具有雙向調節(jié)作用。有研究證明IKK/NF-κB信號通路在中樞神經系統(tǒng)疾病中對起著重要作用，在神經細胞的凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[25]。

本實驗結果顯示：采用的烙閉上鞏膜靜脈的方法建立的SD大鼠慢性EIOP模型可以使大鼠IOP升高，且可維持至少8周(實驗結束時)。補精益視片可輕度降低SD大鼠慢性EIOP模型的眼壓；阻斷SD大鼠慢性EIOP模型初級視皮質中的尼氏小體的分解過程，改善初級視皮質的神經元的功能。 降低SD大鼠慢性EIOP模型初級視皮質中PI3K/Akt通路中p-FoxO1及IKK2的表達，可抑制SD慢性EIOP模型初級視皮質的神經細胞凋亡，對大鼠慢性EIOP模型的視功能具有作用。另外IKK2為NF-κB活化所必須的亞基結構，因此推測補精益視片可能可以降低SD大鼠慢性EIOP模型初級視皮質中NF-κB的表達。

綜上，補精益視片可有效保護SD大鼠慢性EIOP模型的視功能，其作用表現(xiàn)在輕度降低IOP，提高PVC尼氏小體的含量，降低PVC中p-FoxO1及IKK2的表達。