付強(qiáng)，金向楠，郜玉忠，王健，閆鵬

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)科；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，遼寧 錦州 121000)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以慢性炎癥為特征的一種自身免疫性關(guān)節(jié)疾病，炎性免疫細(xì)胞侵潤(rùn)到滑膜液并造成軟骨破壞[1]。異常過(guò)度增殖的成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)在這種炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)破壞機(jī)制中起關(guān)鍵作用，它通過(guò)產(chǎn)生炎性介質(zhì)，如腫瘤壞死因子(TNF-α)，前列腺素E2(PGE2)，一氧化氮(NO)，白細(xì)胞介素(IL)-6等發(fā)揮作用，其中IL-1β也是較為重要的一種，高水平的IL-1β持續(xù)刺激滑膜細(xì)胞可以引起細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶的持續(xù)激活和信號(hào)通路的過(guò)度傳導(dǎo)，從而使一氧化氮合酶(iNOS)，環(huán)氧化酶(COX)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達(dá)水平上調(diào)[2]。這些蛋白酶表達(dá)量的多少?zèng)Q定著關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)產(chǎn)生進(jìn)行性的關(guān)節(jié)破壞，甚至最終導(dǎo)致畸形和殘疾。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，MAPKs通路調(diào)控從胚胎生發(fā)，細(xì)胞分化到細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活/凋亡的所有細(xì)胞功能。MAPKs可分類成三種類型：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和2(ERK1/2)，p38蛋白，和c-Jun N-末端激酶(JNK)[1]233-255。細(xì)胞因子IL-1β被證實(shí)能夠誘導(dǎo)人的FLS通過(guò)p38途徑使得NO和PEG2的產(chǎn)生增多[3]。

金絲桃苷(hyperin,Hyp)又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，屬黃酮醇苷類化合物，廣泛存在于各種植物體內(nèi)，如金絲桃科、薔薇科、桔?？?、葵科、藤黃科、豆科等的果實(shí)與全草中，藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)其具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化，改善心血管循環(huán)功能等藥物作用[4]。目前，一些研究證明Hyp通過(guò)抑制TNF-α，IL-6和NO等炎癥因子的產(chǎn)生，有顯著的抗炎作用，還有一些研究發(fā)現(xiàn)Hyp在體外可以顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖[5]。然而，對(duì)于Hyp是否能夠抑制RA-FLS類腫瘤樣的侵蝕特性，目前尚無(wú)研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)就針對(duì)Hyp是否會(huì)對(duì)RA有抗炎和抑制軟骨受侵蝕作用進(jìn)行研究。

1 材 料

1.1 滑膜組織的來(lái)源

RA滑膜組織取自錦州附屬大學(xué)第一醫(yī)院2018年9月至12月行關(guān)節(jié)鏡術(shù)的3例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者，RA患者均符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)制定的RA分類標(biāo)準(zhǔn)，所有患者均已簽署知情同意書(shū)，符合倫理學(xué)要求并經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要藥品與試劑

Ⅱ型膠原酶和胎牛血清購(gòu)于GIbco公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)于Hyclone公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)和胰蛋白酶購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；金絲桃苷(Hyperin)，黃色粉末，純度>98%，購(gòu)于南京春秋生物工程有限公司；白細(xì)胞介素(IL)1-β購(gòu)于Sigma公司；SB203580阻斷劑購(gòu)于Abcam公司 ；iNOS 抗體、MMP3抗體、p38抗體、山羊抗兔二抗、 山羊抗鼠二抗、β-actin、BrdU Cell Proliferation Assay Kit均購(gòu)于Cell Signaling公司；Transwell購(gòu)于Corning公司。

2 方 法

2.1 滑膜細(xì)胞的培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，將手術(shù)中獲取的滑膜組織，用眼科剪刀剪碎，移入含有終濃度為0.5 mg/mL的Ⅱ型膠原酶的培養(yǎng)基中，于37 ℃ 5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中消化2 h，取出后用吸管反復(fù)吹打，并經(jīng)70 μm孔徑的紗網(wǎng)過(guò)濾后離心，沉淀重懸，移入培養(yǎng)瓶放置于37 ℃ 5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中，每2～3 d換液1次，待細(xì)胞密度達(dá)到80%以上，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)使用FLS，純度達(dá)到95%以上的3～7代細(xì)胞。

2.2 分組處理方法

本實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞分為4種處理方法，正常對(duì)照組：細(xì)胞無(wú)需特殊處理，加入等量的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組：加入終濃度為10 ng/mL的IL-1β，誘導(dǎo)用藥組：分別加入終濃度為10、50、100 μm/mL的Hyp+ IL-1β(10 ng/mL)，誘導(dǎo)阻斷劑組：加入終濃度為20 μm/mL 的SB203580+IL-1β(10 ng/mL)，單獨(dú)用藥組：分別加入Hyp(10、50、100 μm/mL)。

2.3 Brdu細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的FLS細(xì)胞，消化后以1×104/孔的密度均勻接種于96孔板中，隔天加藥前給予饑餓處理，然后分別加入Hyp和SB203580(20 μm/mL)，作用48 h，在藥物和阻斷劑作用24 h后誘導(dǎo)組給予加入IL-1β(10 ng/mL)，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基。將Brdu原液1：500稀釋在藥物作用結(jié)束前8 h每孔加入20 μL，然后按照Brdu細(xì)胞增殖試劑盒說(shuō)明書(shū)所示方法操作，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定各孔OD值。

2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的FLS細(xì)胞，消化后用不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基制成密度為1×105/mL的細(xì)胞懸液，于每個(gè)transwell小室上室中加入100 μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h。24 h后依照分組在上室中加入Hyp和SB203580，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基，下室中均加入含IL-1β的10%胎牛血清培養(yǎng)基600 μL，上室藥物作用24 h。取出后用結(jié)晶紫染色放置于倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

2.5 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白水平

將細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)，每組3復(fù)孔，待細(xì)胞密度達(dá)到80%以上，給予加藥處理，分別加入Hyp(50、100 μm/mL)和SB203580(20 μm/mL)作用4 h，在藥物和阻斷劑作用結(jié)束前2 h誘導(dǎo)組給予加入IL-1β(10 ng/mL)，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基，制樣。用10% 聚丙烯酰胺凝膠 ( SDS-PAGE)電泳分離蛋白質(zhì)，電泳后將PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉 60 min，加入相應(yīng)一抗，4 ℃過(guò)夜，洗去一抗后，加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗，最后用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，結(jié)果用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量[6]。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次，結(jié)果采用SPSS 17.0軟件處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差(One-Way ANOVA)分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 Hyp對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的人RA-FLS增殖能力的影響

分析酶標(biāo)儀測(cè)得數(shù)據(jù)顯示：IL-1β明顯的誘導(dǎo)了RA-FLS的增殖，與正常對(duì)照組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。誘導(dǎo)用藥組與誘導(dǎo)組相比呈劑量依賴性的抑制了FLS的增殖，終濃度為50,100 μm/mL的Hyp誘導(dǎo)用藥組與誘導(dǎo)組的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，誘導(dǎo)阻斷劑組與誘導(dǎo)組相比也有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，說(shuō)明p38的阻斷劑SB203580也明顯抑制了LPS誘導(dǎo)的RA-FLS增殖能力，見(jiàn)圖1。

與正常對(duì)照組比***P<0.001，與IL-1β誘導(dǎo)組比###P<0.001

3.2 Hyp對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的人RA-FLS遷移能力的影響

在倒置顯微鏡(×100)下將每個(gè)小室分為9個(gè)面積相等的視野，分別計(jì)數(shù)穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)量，算出平均值統(tǒng)計(jì)分析。如圖所示(見(jiàn)圖2A)，我們觀察到50、100 μm/mL的Hyp成劑量依賴性的抑制了IL-1β誘導(dǎo)的FLS縱向的遷移能力，SB203580阻斷劑組也同樣有抑制遷移作用。分析結(jié)果顯示，用藥組和阻斷劑組與正常對(duì)照組相比均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，見(jiàn)圖2B。

A:a.正常對(duì)照組；b.金絲桃苷(50 μm/mL)-用藥組；c.金絲桃苷(100 μm/mL)-用藥組；d.SB203580(20 μm/mL)-阻斷劑組

3.3 Western Blot測(cè)定Hyp對(duì)蛋白表達(dá)水平的影響

3.3.1 Hyp對(duì)iNOS蛋白表達(dá)水平的影響

Western Blot結(jié)果顯示，IL-1β刺激RA-FLS使iNOS的蛋白表達(dá)量明顯增加，與正常對(duì)照組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。而應(yīng)用p38阻斷劑SB203580組iNOS的蛋白表達(dá)量相應(yīng)的有所降低，用藥組劑量為50、100 μm/mL的Hyp使得iNOS的蛋白表達(dá)量成劑量依賴性降低。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)：誘導(dǎo)用藥組和誘導(dǎo)阻斷劑組與誘導(dǎo)組相比均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，見(jiàn)圖3。

與正常對(duì)照組比***P<0.001，與IL-1β誘導(dǎo)組比###P<0.001

3.3.2 Hyp對(duì)MMP3蛋白表達(dá)水平的影響

Western Blot結(jié)果顯示，IL-1β刺激RA-FLS使MMP3的蛋白表達(dá)量明顯增加，與正常對(duì)照組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。而應(yīng)用p38阻斷劑SB203580組MMP3的蛋白表達(dá)量相應(yīng)的有所降低，用藥組劑量為50、100 μm/mL的Hyp使得MMP3的蛋白表達(dá)量成劑量依賴性降低。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)：誘導(dǎo)用藥組和誘導(dǎo)阻斷劑組與誘導(dǎo)組相比均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，見(jiàn)圖4。

與正常對(duì)照組比***P<0.001，與IL-1β誘導(dǎo)組比###P<0.001

3.3.3 Hyp對(duì)p38蛋白表達(dá)水平的影響

Western Blot結(jié)果顯示，IL-1β刺激RA-FLS使p38的蛋白表達(dá)量明顯增加，與正常對(duì)照組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。誘導(dǎo)用藥組與誘導(dǎo)組相比呈劑量依賴性的抑制了p38蛋白的表達(dá)水平，終濃度為50、100 μm/mL的Hyp誘導(dǎo)用藥組與誘導(dǎo)組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，見(jiàn)圖5。

與正常對(duì)照組比***P<0.001，與IL-1β誘導(dǎo)組比###P<0.001

4 討 論

在RA中，最顯著的特點(diǎn)之一是FLS的過(guò)度增殖，這種滑膜細(xì)胞參與著炎癥和關(guān)節(jié)破壞，類腫瘤樣生長(zhǎng)使它具有不同尋常的增殖性及侵襲性，這種增殖性及侵襲性是多種因素決定的[7-8]。我們注意到RA滑膜中存在過(guò)量的細(xì)胞因子、受體及與其有相似性的癌基因產(chǎn)物，他們可以作用在滑膜細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的不同位置，導(dǎo)致持續(xù)的信號(hào)傳導(dǎo)，從而引起RA滑膜細(xì)胞的異常增生。目前各種治療RA方法發(fā)展迅速，以FLS侵襲為靶點(diǎn)的藥物研究已成為近年來(lái)抗RA藥物研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)，新藥和新療法層出不窮,極大地改善了病人的預(yù)后,但由于調(diào)控RA-FLS侵襲的復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)使靶向單一治療束手無(wú)策，多種改善病情抗風(fēng)濕藥聯(lián)合治療給患者帶來(lái)的藥物副作用越來(lái)越多，臨床上仍缺乏安全有效的治療方法。金絲桃苷分子式為C21H20O12，相對(duì)分子量為464.3763，毒性極低，且已有研究表明它對(duì)心肌缺血、腦缺血、肝及胃粘膜有保護(hù)作用，還具有降血脂、解痙陣痛作用，為了探討Hyp是否可以作為一種副作用小的中藥同樣應(yīng)用于RA，我們研究了Hyp對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的RA-FLS增殖與遷移能力的影響。

因脫離機(jī)體環(huán)境而體外培養(yǎng)的RA-FLS經(jīng)幾次傳代后，其炎癥因子的產(chǎn)生及遷移能力均會(huì)減弱，所以我們要對(duì)其進(jìn)一步的誘導(dǎo)，IL-1β是多種RA誘導(dǎo)因子之一，有證據(jù)指出，IL-1β通過(guò)誘發(fā)FLS的增殖和炎性反應(yīng)在RA滑膜炎和關(guān)節(jié)破壞發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。Fonsa 等報(bào)道滑膜關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射IL-1β可以刺激滑膜細(xì)胞產(chǎn)生包括MMP在內(nèi)的炎性介質(zhì)，從而引發(fā)蛋白多糖、膠原的降解和軟骨細(xì)胞的破壞。此外，IL-1β還能刺激中性蛋白酶和前列腺素E2的產(chǎn)生，增強(qiáng)關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)滑膜巨噬細(xì)胞進(jìn)一步分化為破骨細(xì)胞，導(dǎo)致邊緣骨質(zhì)的破壞。我們通過(guò)Brdu細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)觀察到IL-1β(10 ng/mL)明顯誘導(dǎo)了RA-FLS的增殖及遷移，發(fā)現(xiàn)100 μm/mL的Hyp可以顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞增殖和遷移，意味著Hyp用于治療RA是有效果的[9]。

在檢測(cè)Hyp抑制FLS增殖和遷移能力的同時(shí)，本研究還在蛋白表達(dá)水平分別檢測(cè)了藥物對(duì)FLS產(chǎn)生iNOS及MMP3的影響。NO是IL-1β下游的重要炎性介質(zhì)之一，通過(guò)調(diào)節(jié)軟骨的合成和分解代謝維持軟骨穩(wěn)態(tài)的平衡，是導(dǎo)致RA關(guān)節(jié)破壞的重要因素[2]437-445。iNOS是NO產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，在正?；ぜ?xì)胞中沒(méi)有表達(dá)，但由IL-1β等細(xì)胞因子誘導(dǎo)的FLS可以使iNOS過(guò)度表達(dá)，炎性環(huán)境下iNOS的表達(dá)活性一旦被激活，便可持續(xù)性表達(dá)，從而產(chǎn)生大量的NO，高水平的NO介導(dǎo)廣泛的毒性作用，一方面進(jìn)一步促進(jìn)炎性介質(zhì)的釋放，誘導(dǎo)iNOS的產(chǎn)生，形成一種惡性循環(huán)，導(dǎo)致RA的關(guān)節(jié)軟骨處于一種持續(xù)性侵蝕狀態(tài)，另一方面可以使MMPs高表達(dá)而導(dǎo)致FLS的遷移和侵襲性增加[10]。

MMPs是導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙的重要效應(yīng)分子之一，幾乎能夠降解除了多糖以外全部的膠原、蛋白多糖等主要基質(zhì)成分，通過(guò)直接遷移到細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)導(dǎo)致關(guān)節(jié)骨和軟骨的破壞[11]。MMPs的活性調(diào)控包括多個(gè)方面，蛋白表達(dá)量的多少，酶原的活化以及與金屬蛋白酶組織特異性抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)比例的不平衡。在眾多的MMPs中，可以檢測(cè)到RA患者的滑液中MMP1、2、3、8、9均是高水平表達(dá)的，并有研究發(fā)現(xiàn)RA-FLS中表達(dá)MMP1和MMP3遷移和侵襲能力更強(qiáng)[12-13]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此是相符的IL-1β誘導(dǎo)了FLS產(chǎn)生大量的iNOS和MMP3，其表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高，而Hyp組使得iNOS和MMP3的蛋白表達(dá)量成劑量依賴性降低。

MAPKs是參與細(xì)胞功能的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在RA中，MAPK途徑廣泛的介導(dǎo)了滑膜細(xì)胞的增殖和炎性反應(yīng)，他們或是可以激活其他的蛋白激酶，或是可以磷酸化細(xì)胞骨架，或是直接轉(zhuǎn)位入核，磷酸化轉(zhuǎn)錄因子而調(diào)控下游基因的表達(dá)，如一方面，通過(guò)炎癥因子激活的MAPK可以活化下游轉(zhuǎn)錄因子(如ATF-2、AP-1等)，進(jìn)一步上調(diào)炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6等的表達(dá)，形成正反饋，它是RA患者局部和全身炎癥持續(xù)存在的重要機(jī)制，另一方面，MAPK途徑的下游的一些基因參與了RA的組織破壞，如JNL、p38是MMP表達(dá)的必須調(diào)節(jié)，特別是p38通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)對(duì)骨侵蝕有極大的影響[14]。在IL-1β的刺激下FLS表達(dá)p38的水平明顯增高，p38的激活在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控下游因子的表達(dá)，最終進(jìn)一步上調(diào)了TNF、IL、iNOS、MMPs、COX2、PGE2等的表達(dá)水平，并形成一種正反饋，是RA為慢性持續(xù)性炎癥疾病的重要機(jī)制[14-15]563-571。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制p38激酶，可以打破這回惡性循環(huán)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)，并通過(guò)研究藥物對(duì)其及其下游因子表達(dá)的影響，為Hyp對(duì)p38激酶途徑的抑制作用提供進(jìn)一步的證明。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Hyp顯著抑制了IL-1β誘導(dǎo)的FLS增殖及遷移能力，此外，在轉(zhuǎn)錄水平上還抑制了iNOS、MMP3和p38蛋白表達(dá)量，表明Hyp具有抑制增殖和控制關(guān)節(jié)和軟骨受侵蝕的效果，可以作為RA治療的一個(gè)理想的新藥進(jìn)行更多的研究。我們證明了Hyp能夠抑制IL-1β誘導(dǎo)的FLS對(duì) MMP3和iNOS的過(guò)度表達(dá)，還表明藥物是通過(guò)阻斷IL-1β激活的p38通路而發(fā)揮作用的，但這是否是Hyp作用于RA的主要機(jī)制，還需要更深一步的研究。