姜炎杰，杜亞明，杜丙輝，張偉

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

深靜脈血栓(deep vein thrombosis，DVT)是一種外周血管疾病，每年的發(fā)病率在0.1%～0.27%之間，約40%左右的患者會(huì)出現(xiàn)靜脈性跛行，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。DVT的發(fā)病主要與血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、血流速度變緩、血管狹窄和血液高凝密切相關(guān)。針對(duì)DVT的治療包括改善癥狀、清除血栓、抗凝治療和改善循環(huán)治療等。目前DVT的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。最近研究顯示miRNAs在DVT的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[2]。miRNAs是一類非編碼的小RNA，長度只有20～24 nt，在生物體基因組中普遍存在。已有研究證實(shí)，雖然miRNAs只占所有RNA的1.0%左右，但它們參與了30%～50%的基因調(diào)控[3]。miRNAs通過靶向調(diào)控靶mRNA，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞生理過程[4]。研究顯示miR-21-3p在小鼠DVT模型中顯著低表達(dá)，并能夠通過抑制FASLG參與DVT的形成[5]。然而miR-21-3p在DVT中的作用和機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。因此采用RT-PCR檢測(cè)DVT患者和健康受試者外周血中miR-21-3p和PTEN的表達(dá)水平；在DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics和miR-21-3p inhibitors后檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡情況，以探討miR-21-3p通過靶向調(diào)控PTEN參與DVT的形成。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本

選取2018年4月至2019年5月期間在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院的25名DVT患者和同期體檢中健康受試者25名。患者平均年齡(56.9±10.3)歲，男性16例，女性9例。健康受試者平均年齡(55.3±12.6)歲，男性14例，女性11例。抽取兩組患者外周血10 mL，離心后血清凍存于-80 ℃冰箱。所有患者均簽署知情同意書，經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞的原代細(xì)胞分離使用密度梯度離心法，采用內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)專用培養(yǎng)基EGM-2 MV在37 ℃、5%CO2平衡濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用INTERFERin轉(zhuǎn)染試劑并按試劑說明書轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics、miR-21-3p inhibitors、LV-PTEN 和si-PTEN。每組重復(fù)設(shè)置3個(gè)孔。

1.3.2 qRT-PCR

采用miRNeasy Mini Kit提取miRNA，使用TaqMan MicroRNA Assay試劑盒檢測(cè)miR-21-3p的表達(dá)水平，并使用Applied Biosystem 7500進(jìn)行qPCR，U6作為內(nèi)參。采用TRIzol?試劑提取細(xì)胞中總RNA，使用NanoDrop 1000分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱。根據(jù)RNA濃度進(jìn)行計(jì)算取等質(zhì)量的RNA，根據(jù)目的RNA的種類使用不同的試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以β-actin為內(nèi)參，按2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

1.3.3 CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞增殖

各組細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行收集，以2×103個(gè)密度接種到96孔培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)1、2、3和4 d后，加人10 μL的CCK-8溶液，孵育10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定在405 nm波長的吸光度進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率

取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以3×105個(gè)/孔接種于6孔板，胰酶消化收集轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞，PBS 洗滌后制備成細(xì)胞懸液，加入預(yù)冷的70%乙醇，4 ℃固定過夜。加入PBS洗滌2次后棄上清，加入PI工作液，室溫下避光孵育30 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶染色液(0.25 mg/mL)，輕輕混勻，室溫避光孵育20 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

由此，要使一國自主走向法律趨同的道路，就需要一國的法律文化發(fā)生相應(yīng)的變化。促使一國在法律制度上趨同于另一個(gè)國家的法律，首先需要一國在觀念、原則、價(jià)值體系上與另一國家相接近，歷史上具有相近文化背景的國家往往更容易走向自發(fā)地法律趨同道路。不過，全球化浪潮、“地球村”范圍的擴(kuò)大使得法律趨同只局限于具有相似法律文化背景的國家已經(jīng)不現(xiàn)實(shí)，法律趨同必須擴(kuò)大到具有不同法律文化背景的國家才能真正適應(yīng)全球化帶來的“地球村”經(jīng)貿(mào)合作。而要使法律文化相異的國家自主地在國內(nèi)法層面相互趨同法律，就只能通過推動(dòng)兩國在觀念、原則、價(jià)值體系上相互接近的方式進(jìn)行，對(duì)此，我們只能借助法律認(rèn)同的方式實(shí)現(xiàn)。

1.3.5 雙熒光素酶報(bào)告

將野生型或突變型PTEN克隆到pmirGLO質(zhì)粒受體中，同時(shí)將miR-21-3p mimics或miR-NC導(dǎo)入293細(xì)胞中，共培養(yǎng)48 h后采用雙熒光素酶受體分析系統(tǒng)測(cè)量雙熒光素活性。

1.3.6 Westrn blot法

細(xì)胞在不同轉(zhuǎn)染24 h后，常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠每孔加入40 μg的待測(cè)蛋白，110 V電泳，250 mA電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，分別加入PTEN和β-actin一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3×10 min，二抗37 ℃ 孵育1 h，TBST洗膜3×30 min，ECL顯影。運(yùn)用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin作內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析和Dunnett-t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系分析，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-21-3p和PTEN在DVT患者中的表達(dá)水平

miR-21-3p在DVT患者外周血中的表達(dá)水平明顯低于健康受試者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.35±0.67 vs 3.72±1.53，t=7.12，P<0.05)，見圖1A；PTEN在DVT患者外周血中的表達(dá)水平明顯高于健康受試者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4.60±2.21 vs 2.40±0.82，t=4.67，P<0.05)，見圖1B；同時(shí)miR-21-3p和PTEN在DVT患者外周血中的表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)(R=-2.61，P<0.05)，見圖1C；在DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics后，miR-21-3p的表達(dá)水平明顯升高(1.84±0.18 vs 1.01±0.13，t=6.38，P<0.05)，轉(zhuǎn)染miR-21-3p inhibitors后，miR-21-3p的表達(dá)水平明顯降低(0.45±0.19 vs 1.01±0.13，t=4.21，P<0.05)，見圖1D。

A：DVT患者和健康受試者外周血中miR-21-3p的表達(dá)水平；B：DVT患者和健康受試者外周血中PTEN的表達(dá)水平；C：miR-21-3p和PTEN在DVT中表達(dá)水平相關(guān)性；D：DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-21-3p mimics和miR-21-3p inhibitors。與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.2 miR-21-3p對(duì)DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和凋亡的影響

在DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics后培養(yǎng)4 d，結(jié)果顯示內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖能力較轉(zhuǎn)染miR-NC組明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3.51±0.17 vs 2.44±0.14，t=6.84，P<0.05)，見圖2A；在DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-21-3p inhibitors后培養(yǎng)4 d，結(jié)果顯示內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖能力較轉(zhuǎn)染miR-NC組明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.73±0.15 vs 2.52±0.18，t=5.30，P<0.05)，見圖2B；在DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics后，內(nèi)皮祖細(xì)胞的凋亡率較轉(zhuǎn)染miR-NC組明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3.46±0.51 vs 6.16±0.13，t=4.08，P<0.05)，見圖2C；在DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-21-3p inhibitors后，內(nèi)皮祖細(xì)胞的凋亡率較轉(zhuǎn)染miR-NC組明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(13.61±2.07 vs 5.81±0.90，t=5.98，P<0.05)，見圖2D。

A:DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics對(duì)細(xì)胞增殖的影響;B: DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21-3p inhibitors對(duì)細(xì)胞增殖的影響;C:DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics對(duì)細(xì)胞凋亡的影響;D:DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21-3p inhibitors對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。與miR-NC組相比，*P<0.05

2.3 miR-21-3p能夠靶向結(jié)合PTEN

為分析miR-21-3p調(diào)控DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和凋亡的作用機(jī)制。見圖3A為miR-21-3p和PTEN的結(jié)合位點(diǎn)情況，采用雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證顯示PTEN-WT組中轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics后雙熒光素活性明顯下降(0.45±0.04 vs 1.03±0.06，t=17.47，P<0.05，見圖3B)；在PTEN-MUT組中轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics后雙熒光素活性未見明顯改變(1.03±0.05 vs 0.99±0.05，t=1.31，P>0.05)，見圖3B；同時(shí)在DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics后，PTEN的表達(dá)水平明顯降低(0. 37±0.06 vs 1.01±0.14，t=7.32，P<0.05)，見圖3C-D；在DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-21-3p inhibitors后，PTEN的表達(dá)水平明顯升高(1.66±0.13 vs 1.01±0.14，t=6.02，P<0.05)，見圖3C-D；在進(jìn)一步研究中，在DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞中轉(zhuǎn)染LV-PTEN能夠明顯促進(jìn)PTEN的表達(dá)水平(1.85±0.20 vs 1.02±0.12，t=6.31，P<0.05)，見圖3E；轉(zhuǎn)染si-PTEN能夠明顯抑制PTEN的表達(dá)水平(0.39±0.11 vs 1.01±0.12，t=6.51，P<0.05)，見圖3F。

A：miR-21-3p和PTEN的結(jié)合位點(diǎn)；B：雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證miR-21-3p和PTEN的結(jié)合情況；C：DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics和miR-21-3p inhibitors對(duì)PTEN mRNA表達(dá)的影響；D：DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics和miR-21-3p inhibitors對(duì)PTEN蛋白表達(dá)的影響；E:DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞轉(zhuǎn)染LV-PTEN后PTEN的表達(dá)水平；F:DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-PTEN后PTEN的表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.4 miR-21-3p調(diào)控PTEN參與DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和凋亡

為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-21-3p調(diào)控PTEN對(duì)DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和凋亡影響，結(jié)果顯示在DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics和LV-PTEN后，能夠反轉(zhuǎn)單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics對(duì)細(xì)胞增殖(2.70±0.16 vs 2.44±0.14，t=1.72，P>0.05，見圖4A)和凋亡(5.88±0.92 vs 6.16±1.02，t=0.36，P>0.05)，見圖4；影響。在DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics和si-PTEN，結(jié)果顯示內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖能力較單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics進(jìn)一步升高(8.29±0.21 vs 3.46±0.10，t=4.99，P<0.05)，見圖4B；內(nèi)皮祖細(xì)胞的凋亡率較單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics進(jìn)一步降低(1.79±0.31 vs 3.46±0.51，t=4.82，P<0.05)，見圖4D。

A：在DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics和LV-PTEN后對(duì)細(xì)胞增殖的影響；B：在DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics和si-PTEN后對(duì)細(xì)胞增殖的影響；C：在DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics和LV-PTEN后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 ；D：在DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics和si-PTEN后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。與miR-NC組相比，*P<0.05；與miR-21-3p mimics組相比，#P<0.05

3 討 論

內(nèi)皮祖細(xì)胞在DVT的形成中發(fā)揮著重要作用，內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員后遷移至血管損傷或者血栓部位，并參與血管部位的新生血管形成，促進(jìn)血栓再通[6]。目前研究顯示內(nèi)皮祖細(xì)胞作為一種干細(xì)胞，具有較強(qiáng)的增殖能力，能夠分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞參與血管修復(fù)[5,7]270。因此探討DVT中內(nèi)皮祖細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制對(duì)DVT的防治具有重要作用。研究顯示多種miRNAs在內(nèi)皮祖細(xì)胞中存在異常表達(dá)，包括miR-377-5p、miR-214和miR-205等[8-9]。最近有研究顯示內(nèi)皮祖細(xì)胞來源的外泌體miR-21能夠通過調(diào)控血小板反應(yīng)蛋白參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)[10]。也有研究顯示骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞中miR-21能夠調(diào)控WWP1參與內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖[11]。這提示miR-21可能通過調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)行為參與DVT的形成。

在本研究中通過DVT患者和健康受試者外周血中miR-21-3p的表達(dá)水平，結(jié)果顯示miR-21-3p在DVT患者外周血中的表達(dá)水平明顯降低。進(jìn)一步采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-21-3p對(duì)DVT的影響，采用miR-21-3p mimics和miR-21-3p inhibitors轉(zhuǎn)染至DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-21-3p能夠明顯促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和抑制細(xì)胞的凋亡，同時(shí)低表達(dá)miR-21-3p能夠明顯抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。這提示miR-21-3p在DVT中能夠調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和凋亡，對(duì)DVT的形成具有重要影響，然而其作用機(jī)制有待進(jìn)一步明確。

PTEN是位于染色體10q23 上的磷酸酶，是一種抑癌分子，PTEN能夠通過去磷酸化參與細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡等多種細(xì)胞生理過程[12]。同時(shí)PTEN在轉(zhuǎn)錄和翻譯中也受到多種因素的調(diào)控，包括早期生長反應(yīng)蛋白、腫瘤抑制因子p53和活性轉(zhuǎn)錄因子等[13]。近年來有研究顯示miRNAs能夠調(diào)控PTEN的表達(dá)參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[14-15]。在本研究顯示PTEN在DVT患者外周血中的表達(dá)水平明顯升高，同時(shí)miR-21-3p和PTEN在DVT患者的表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)。這提示miR-21-3p可能通過調(diào)控PTEN參與DVT的進(jìn)展。

在進(jìn)一步研究中采用雙熒光素酶報(bào)告證實(shí)miR-21-3p能夠靶向調(diào)控PTEN，在過表達(dá)miR-21-3p后能夠明顯促進(jìn)PTEN的表達(dá)，同時(shí)低表達(dá)miR-21-3p后能夠明顯抑制PTEN的表達(dá)。這提示了miR-21-3p對(duì)PTEN的調(diào)控。同時(shí)近期有研究顯示miR-103a-3p在DVT中明顯低表達(dá)，并通過靶向抑制PTEN參與內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移和血管形成[16]。

在回復(fù)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證miR-21-3p調(diào)控PTEN參與DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和凋亡，在DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics和LV-PTEN后，能夠反轉(zhuǎn)單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響，同時(shí)共轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics和si-PTEN后能夠進(jìn)一步加強(qiáng)單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。這進(jìn)一步證實(shí)miR-21-3p能夠通過靶向調(diào)控PTEN參與內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和凋亡。

總之，miR-21-3p在DVT中明顯低表達(dá)，過表達(dá)miR-21-3p能夠通過靶向調(diào)控PTEN促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡，miR-21-3p可能成為DVT治療的一個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。