周 薇 代愛霞

上海市寶山區(qū)大場(chǎng)醫(yī)院(200436)

研究已證實(shí)，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染與宮頸癌密切相關(guān)[1]。80%的婦女一生中會(huì)感染HPV，只有少部分患者出現(xiàn)HPV持續(xù)感染，甚至出現(xiàn)宮頸上皮病變、宮頸癌等嚴(yán)重病理變化[2]。大部分宮頸癌變?cè)蚴荋PV持續(xù)感染[3]。目前宮頸癌癌前檢查主要通過宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)或聯(lián)合HPV DNA檢測(cè)，但單次檢測(cè)結(jié)果不能代表HPV持續(xù)感染。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類RNA分子，參與腫瘤細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)過程[4]。HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOTAIR)是長(zhǎng)度為2158nt的LncRNA，與胰腺癌、肝癌、宮頸癌等發(fā)生發(fā)展相關(guān)[5]。LncRNA核富集轉(zhuǎn)錄體(NEAT1)在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常[6]。但關(guān)于LncRNA NEAT1和HOTAIR在宮頸HPV持續(xù)感染研究鮮有報(bào)道。故本研究檢測(cè)宮頸HPV持續(xù)感染患者脫落細(xì)胞中LncRNA NEAT1和HOTAIR的表達(dá)水平，為臨床早期診斷提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年8月-2018年8月本院確診并治療的宮頸高危型HPV感染患者56例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床診斷證實(shí)為HPV持續(xù)感染；②未經(jīng)任何手術(shù)、藥物治療；③能按期隨訪，具有完整臨床資料；④醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往無宮頸上皮內(nèi)瘤、宮頸癌和其他惡性腫瘤；②年齡>60歲。

1.2 標(biāo)本處理

使用采樣刷收集患者宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本，行液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查(TCT)和HPV DNA基因型檢測(cè)。細(xì)胞部分用于4%甲醛溶液固定，離心、濃縮后涂片，用于p16、Ki67檢測(cè)；部分于HPV DNA檢測(cè)的保存液中保存；部分-80℃凍存。

1.3 HPV DNA基因型檢測(cè)

取保存液樣本500μl離心，提取DNA，PCR擴(kuò)增體系PCR反應(yīng)試劑及Tap酶加入試管中，DNA模板1 L，振蕩混勻離心行PCR擴(kuò)增；同時(shí)分別擴(kuò)增HPV18型陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照以做參照。采用凱普醫(yī)用核酸分子快速倒流儀進(jìn)行導(dǎo)流雜交，酶標(biāo)顯色，檢測(cè)擴(kuò)增HPV產(chǎn)物的基因分型。結(jié)果判定：陽(yáng)性點(diǎn)可見藍(lán)紫色的圓點(diǎn)，根據(jù)HPV膜條分型分布圖判定HPV病毒類型。本研究檢測(cè)顯示14種高危亞型：68、66、58、33、16、18、31、51、39、45、52、59、53、56，5種低危亞型6、11、44、43。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)p16、Ki67

涂片經(jīng)3% H2O2溶液室溫孵育10min，阻滯內(nèi)源H2O2酶活性，10mmol/L(pH8.0)緩沖液清洗；90℃水浴30min抗原熱修復(fù)；滴加p16、Ki67單克隆抗體(1:500)，4℃孵育過夜，PBS洗3×5min；洗滌后滴加酶標(biāo)二抗37℃孵育30 min，PBS洗3×5min；滴加DAB顯色。p16定位于胞質(zhì)和胞核，染色棕黃色為陽(yáng)性；Ki67定位于胞核，胞核棕黃色為陽(yáng)性。脫落宮頸細(xì)胞著色>10%即判定為陽(yáng)性標(biāo)本。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)LncRNA NEAT1和HOTAIR

取凍存的細(xì)胞標(biāo)本提取細(xì)胞中總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度，將良好的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)LncRNA NEAT1和HOTAIR相對(duì)表達(dá)量，在冰上配置PCR反應(yīng)液，反應(yīng)體系為25 μl：SYBR GreenⅡqPCR Master Mix 12 μl，上下游引物各1 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O 10 μl，振蕩離心充分混勻PCR反應(yīng)液；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。采用3步法設(shè)定反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 10 min；95℃ 15 s；48℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，對(duì)Ct值進(jìn)行分析，LncRNA NEAT1和HOTAIR以U6為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt算法計(jì)算LncRNA NEAT1和HOTAIR的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物信息

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較

根據(jù)HPV檢測(cè)持續(xù)感染組26例、轉(zhuǎn)歸組30例，兩組一般資料比較無差異(P>0.05)，見表2。

表2 兩組患者一般資料比較

2.2 脫落細(xì)胞檢測(cè)指標(biāo)

宮頸HPV感染患者中脫落細(xì)胞LncRNA NEAT1、HOTAIR表達(dá)水平持續(xù)感染組表達(dá)高于轉(zhuǎn)歸組(P<0.05)。見圖1。免疫組化檢測(cè)p16、Ki67表達(dá)陽(yáng)性率持續(xù)感染組(73.3%、66.7%)高于轉(zhuǎn)歸組(19.2%、11.5%)(χ2=16.329、17.490，均P=0.000)。

圖1 宮頸脫落細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量

2.3 p16、Ki67與LncRNA NEAT1、HOTAIR相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示，LncRNA NEAT1、LncRNA HOTAIR表達(dá)與p16、Ki67均呈顯著正相關(guān)。見表3。

表3 各指標(biāo)相關(guān)性分析

2.4 LncRNA NEAT1和HOTAIR診斷宮頸HPV持續(xù)感染價(jià)值

ROC曲線分析顯示，LncRNA NEAT1診斷宮頸HPV持續(xù)感染的特異性為95.7%，敏感性為60.0%；LncRNA HOTAIR診斷宮頸HPV持續(xù)感染的特異性為84.6%，敏感性為90.0%。具體見表4、圖2。

表4 兩種指標(biāo)診斷宮頸HPV持續(xù)感染分析

圖2 兩種指標(biāo)診斷HPV持續(xù)感染AUC曲線分析

3 討論

宮頸癌患者多數(shù)是由癌前病變-子宮頸上皮內(nèi)瘤逐漸發(fā)展而來，發(fā)病與HPV持續(xù)感染關(guān)系密切[7]，早期診斷HPV持續(xù)感染可降低發(fā)生宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)。目前對(duì)宮頸HPV持續(xù)感染主要是宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)或HPV DNA檢測(cè)，但單次檢測(cè)結(jié)果難以確定感染狀態(tài)，選擇宮頸HPV持續(xù)感染的特異性標(biāo)識(shí)物具有臨床意義。

LncRNA在多種腫瘤病理變化中發(fā)揮重要作用。一些相關(guān)研究顯示，LncRNA NEAT1是非編碼RNA，屬細(xì)胞核內(nèi)旁斑的重要組成部分[8]；在乳腺癌患者中異常高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小密切相關(guān)[9]；在卵巢癌表達(dá)高于癌旁組織，且與腫瘤分級(jí)、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[10]；在宮頸組織表達(dá)量隨著宮頸病變程度增加而增高，宮頸癌表達(dá)高于宮頸炎和宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變組織，提示NEAT1參與了從早期炎癥到晚期癌變的全過程[11]。高危HPV持續(xù)感染與宮頸癌發(fā)生關(guān)系密切，但NEAT1表達(dá)與HPV感染的關(guān)系鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，宮頸HPV持續(xù)感染組脫落細(xì)胞中LncRNA NEAT1水平高于轉(zhuǎn)歸組，提示LncRNA NEAT1可能參與了HPV持續(xù)感染的過程。有研究報(bào)道m(xù)iRNA-34a在宮頸HPV持續(xù)感染組中表達(dá)顯著升高，可作為HPV感染轉(zhuǎn)歸的新指標(biāo)[12]。而生物信息學(xué)分析顯示miRNA-34a是LncRNA NEAT1的靶基因，推測(cè)LncRNA NEAT1可能通過參與調(diào)控miRNA-34a表達(dá)參與宮頸HPV持續(xù)感染及后續(xù)癌變過程。ROC曲線分析顯示，LncRNA NEAT1診斷宮頸HPV持續(xù)感染的AUC面積是0.838，有望作為宮頸HPV持續(xù)感染的潛在早期診斷指標(biāo)之一。

LncRNA HOTAIR是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控LncRNA，通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。薛世民等研究報(bào)道，非小細(xì)胞癌患者中LncRNA HOTAIR異常高表達(dá)，且與患者臨床分期及預(yù)后等密切相關(guān)[13]。Geng等報(bào)道干擾肝癌細(xì)胞中LncRNA HOTAIR的表達(dá)，VEGF和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)減少，是多種腫瘤早期診斷標(biāo)志物[14]。本研究顯示，宮頸HPV持續(xù)感染組LncRNA HOTAIR表達(dá)水平高于轉(zhuǎn)歸組，提示其可能與HPV持續(xù)感染有關(guān)。ROC曲線分析顯示，LncRNA HOTAIR診斷宮頸HPV持續(xù)感染的AUC面積是0.936，有望成為宮頸HPV持續(xù)感染的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)。

p16可通過突變、缺失引起細(xì)胞周期紊亂，引發(fā)細(xì)胞癌變。在多數(shù)腫瘤組織中出現(xiàn)基因缺失，表達(dá)降低，但在宮頸癌中表達(dá)不同[15]。HPV E7蛋白與pRb結(jié)合，解除pRb對(duì)p16蛋白表達(dá)的負(fù)調(diào)控，引起p16表達(dá)升高[16]。p16高表達(dá)與宮頸癌臨床分期、分化程度密切相關(guān)[17]。Ki67可反映宮頸癌細(xì)胞增殖情況[18]。當(dāng)p16、Ki67均高表達(dá)時(shí)提示機(jī)體細(xì)胞周期異常，二者常作為宮頸癌早期診斷的敏感性標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示p16、Ki67在HPV持續(xù)感染組中陽(yáng)性表達(dá)率升高。Spearman相關(guān)性分析顯示，LncRNA NEAT1、HOTAIR與p16、Ki67呈顯著正相關(guān)，提示二者可能與宮頸癌前期HPV持續(xù)感染有關(guān)；LncRNA NEAT1、HOTAIR在HPV持續(xù)感染患者中均高表達(dá)，而宮頸癌發(fā)病大多數(shù)與HPV持續(xù)感染相關(guān)，提示可通過檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞中LncRNA NEAT1、HOTAIR早期預(yù)防。

綜上所述LncRNA NEAT1、HOTAIR在宮頸HPV持續(xù)感染患者脫落細(xì)胞中異常高表達(dá)，可能成為宮頸HPV持續(xù)感染的臨床診斷指標(biāo)，預(yù)防宮頸癌變。但本研究樣本量不足，僅提供一種思路，還需擴(kuò)大樣本探究其作用機(jī)制。