武祥偉 張躍環(huán) 肖 述 秦艷平 馬海濤 喻子牛

(1.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所,中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州510301;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,昆明 650201;3.云南省高校高原漁業(yè)資源保護(hù)與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650201)

海洋雙殼貝類的殼色常呈現(xiàn)繽紛的色彩。殼色不僅受遺傳因素的調(diào)控,還受外部環(huán)境,如浮游生物種類、水溫、鹽度、底質(zhì)等的影響[1],因此,殼色與貝類的生態(tài)與行為緊密相關(guān)[2]。但最近的研究發(fā)現(xiàn),殼色還與貝類的生長(zhǎng)與存活等性狀相關(guān)聯(lián)[3—6]。因此,殼色具有成為一種可選育性狀的潛力,與經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行協(xié)同選擇,可以培育出兼具目標(biāo)殼色與經(jīng)濟(jì)性狀的新品系。對(duì)殼色進(jìn)行選育,首先必須明確殼色的遺傳模式。有研究認(rèn)為牡蠣的殼色受單基因控制,屬于質(zhì)量性狀,通過(guò)合適的選配設(shè)計(jì)可使目標(biāo)殼色性狀分離,經(jīng)過(guò)連續(xù)多代的選擇即可獲得純系[7,8]。目前,國(guó)內(nèi)研究人員已通過(guò)多代選育成功培育出金色殼長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas)“海大2號(hào)”[9]與黃色殼葡萄牙牡蠣(Crassostrea angulata)“金蠣1號(hào)”[10]。

海洋雙殼貝類營(yíng)養(yǎng)成分的含量多寡與性腺發(fā)育和配子發(fā)生密切相關(guān),影響著性腺發(fā)育的程度及配子發(fā)生的快慢[11,12]。糖原和甘油三酯是牡蠣配子形成過(guò)程中卵黃生成所需的主要物質(zhì),蛋白質(zhì)亦是餌料匱乏時(shí)性腺發(fā)育所需能量的主要來(lái)源,對(duì)牡蠣的配子發(fā)生、成熟與排放起到重要作用[13]。本研究以熊本牡蠣金色殼品系和黑色殼品系F3群體為研究對(duì)象,比較了兩個(gè)品系生長(zhǎng)與存活率的差異及與殼色的相關(guān)關(guān)系,并進(jìn)一步確認(rèn)了性腺發(fā)育特征及配子發(fā)生與生化成分含量的關(guān)系。本研究為熊本牡蠣殼色品系的選育提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 金色殼與黑色殼品系的構(gòu)建與培育

以2015年構(gòu)建的熊本牡蠣殼金品系、殼黑品系的F2群體為親本,采用截頭法分別選擇200個(gè)個(gè)體(雌∶雄=3∶1)構(gòu)建F3群體,留種率為10%,選擇強(qiáng)度為1.755[14]。人工解剖獲取精卵,并使用新鮮海水促熟卵子與激活精子后備用。

采用人工授精,受精卵密度為5×107個(gè)/L,孵化條件: 溫度27—30℃,鹽度20,pH 7.8—8.5。在室內(nèi)進(jìn)行浮游幼蟲培育;采用成吊的牡蠣殼作為附著基,幼蟲變態(tài)并附著完畢后轉(zhuǎn)移至廣西北海自然海區(qū)吊養(yǎng),進(jìn)行稚貝與成貝的培育。室內(nèi)幼蟲培育與室外成貝養(yǎng)殖過(guò)程中養(yǎng)殖密度調(diào)節(jié)至相同。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2 性狀測(cè)量

使用顯微鏡(Olympus CX22,Tokyo,Japan)測(cè)量9、12和15 dph (day post hatching)浮游幼蟲的殼高(μm);使用游標(biāo)卡尺(精確至0.01 mm)測(cè)量40日齡稚貝的殼長(zhǎng)與殼高(mm),以及180、360、450 dph成貝的殼長(zhǎng)、殼高(mm)。每次測(cè)量60個(gè)個(gè)體。

測(cè)量180、360、450 dph成貝的總體積,方法為: 1 mL淡水的重量為1 g,因此總體積定義為同體積淡水的重量。使用量筒或燒杯盛滿淡水,把整只牡蠣放入其中,收集溢出的淡水并稱重(g),即為總體積(mL)。

測(cè)量180、360、450 dph成貝的總重,方法為:使用天平稱量牡蠣總重(精確至0.01 g);牡蠣開殼后用濾紙吸干體腔液,稱量軟體重(精確至0.01 g)。

計(jì)算9、12、15 dph浮游幼蟲的存活率,方法為: 使用300目篩絹網(wǎng)隨機(jī)收集幼蟲,濃縮至1.5 mL離心管中顯微鏡下統(tǒng)計(jì)空殼數(shù)與幼蟲數(shù),存活率為幼蟲數(shù)占總數(shù)量的百分比。

計(jì)算40、180、360、450 dph的成活率;方法為: 在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)各采集3吊牡蠣(約120個(gè)個(gè)體),統(tǒng)計(jì)空殼數(shù)與活體數(shù),成活率為活體數(shù)占總數(shù)的百分比。

1.3 性腺發(fā)育分期與性別鑒定

金色殼與黑色殼品系分別在180(2016年12月)、360(2017年6月)、450(2017年10月) dph取樣,每次隨機(jī)采集60個(gè)個(gè)體制作石蠟切片。解剖后取性腺組織(去除消化腺),固定于Bouin’s液中,24h后轉(zhuǎn)入70%乙醇溶液中,之后依次進(jìn)行脫水、透明、包埋,并做連續(xù)切片,切片厚度6—8 μm。將切片置于45℃恒溫箱中烘干后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色。

使用顯微鏡觀察性腺切片,參照已報(bào)道方法[15,16]鑒定性腺發(fā)育階段,本研究把牡蠣性腺發(fā)育分為6個(gè)時(shí)期: 未分化期、形成期、生長(zhǎng)期、成熟期、排放期、耗盡期,每期特征為: 未分化期: 濾泡長(zhǎng)條形,較薄,生殖細(xì)胞緊貼濾泡壁,不能辨別雌雄。形成期: 生殖細(xì)胞(精原細(xì)胞、卵原細(xì)胞)開始形成,濾泡開始增大。生長(zhǎng)期: 濾泡較大,濾泡壁處具有較多的精原細(xì)胞或卵原細(xì)胞,濾泡腔中可出現(xiàn)少量精細(xì)胞或卵黃形成前期的卵母細(xì)胞,可辨別雌雄。成熟期: 性腺飽滿,濾泡緊密相連,內(nèi)充滿多邊形的卵子或輻射狀排列的精子,但無(wú)排卵或排精現(xiàn)象。排放期: 卵子或精子大量排入生殖導(dǎo)管中,濾泡內(nèi)出現(xiàn)較大空白空間。耗盡期: 卵巢中殘存少量扁塌的卵子,處于重吸收狀態(tài),濾泡壁上有少量不連續(xù)的生殖細(xì)胞,如卵原細(xì)胞或精原細(xì)胞。

通過(guò)生殖細(xì)胞的有無(wú)和類型辨別每個(gè)個(gè)體的性別,把個(gè)體的性別分為未分化、雌性、雄性、雌雄同體等四種類型。

1.4 生化成分定量

分別在180、360、450 dph取樣,每次每個(gè)品系隨機(jī)采集15個(gè)個(gè)體,解剖后分別取性腺(去除消化腺)、閉殼肌、鰓、外套膜,每5個(gè)個(gè)體的4種組織分別混合,每種組織制成3個(gè)混合樣品保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

采用二喹啉甲酸法測(cè)定總蛋白含量[17],即準(zhǔn)確稱取1 g組織,按照重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水,冰浴條件下勻漿,2500 r/min離心10 min,取上清液待測(cè)。使用酶標(biāo)儀比色法,以雙蒸水作為空白對(duì)照,標(biāo)準(zhǔn)品濃度為563 μg/mL,讀取波長(zhǎng)562 nm處的吸光度,按照總蛋白濃度(μg/mL)=(待測(cè)樣OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×待測(cè)樣稀釋倍數(shù),計(jì)算總蛋白含量。

采用磷酸甘油氧化酶法(GPO-PAP)測(cè)定甘油三酯含量[18],即組織勻漿后制成待測(cè)液,使用酶標(biāo)儀比色法,以雙蒸水作為空白對(duì)照,標(biāo)準(zhǔn)品濃度為2.26 mmol/L,讀取波長(zhǎng)500 nm處的吸光度。按照甘油三酯含量(mmol/g prot)=(待測(cè)樣OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度/待測(cè)樣本蛋白濃度(g/L),計(jì)算甘油三酯含量。

采用蒽酮法測(cè)定糖原定量[19]。取新鮮組織,使用生理鹽水漂洗后再用濾紙吸干水分,稱重,并按照樣本重(mg)∶堿液體積(μL)為1∶3的比例向樣本中加入堿液,沸水煮沸20min,流水冷卻后制成待測(cè)液,并按照5%的待測(cè)液濃度加入蒸餾水。取1 mL檢測(cè)液加入1 mL顯色劑,沸水浴5min,冷卻后以雙蒸水為空白對(duì)照,標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.01 mg/mL,使用分光光度計(jì)讀取波長(zhǎng)620 nm處的吸光度(1 cm光徑),按照糖原含量(mg/g組織)=待測(cè)樣OD值/標(biāo)準(zhǔn)OD值×標(biāo)準(zhǔn)品含量×待測(cè)樣稀釋倍數(shù)×10/1.11計(jì)算糖元含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS18.0 (SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)計(jì)算每組數(shù)據(jù)的平均值與標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD),采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)檢測(cè)組間的差異顯著性,水平均為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 浮游幼蟲與稚貝的生長(zhǎng)比較

9—40 dph殼金品系的殼高均小于殼黑品系,差異顯著(P＜0.05,15 dph除外)。殼金品系在浮游幼蟲期無(wú)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)(表1)。

2.2 幼貝與成貝生長(zhǎng)比較

180—450 dph,殼金品系的殼高、殼長(zhǎng)、總重、總體積、軟體重均大于殼黑品系,總重呈顯著性差異(P＜0.05,表2),表明在幼貝與成貝階段,殼金品系具有較全面的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。

表 1 熊本牡蠣殼金品系與殼黑品系9—40 dph的殼長(zhǎng)與殼高Tab.1 Shell length and shell height of golden shell and black shell lines from 9 to 40 dph in Crassostrea sikamea (n=60; ±SD)

注: 同列數(shù)據(jù)上標(biāo)不同表示差異顯著 (P＜0.05);下同Note: Values in each column with different superscripts are significantly different (P＜0.05).The same applies below

品系Line 9日齡9 dph 12日齡12 dph 15日齡15 dph 40日齡40 dph殼高Shell height (μm) 殼高Shell height (μm) 殼高Shell height (μm) 殼高Shell height (mm) 殼長(zhǎng)Shell length (mm)殼金Golden shell 170.04±20.71b 264.88±47.68b 340.91±39.56a 9.88±1.17b 8.06±0.94a殼黑Black shell 211.74±42.76a 331.26±47.85a 347.07±46.81a 11.15±1.30a 9.27±1.43a

表 2 熊本牡蠣殼金品系與殼黑品系180—450 dph的生長(zhǎng)Tab.2 Growth of golden shell and black shell lines from 180 to 450 dph in Crassostrea sikamea (n=60; ±SD)

表 2 熊本牡蠣殼金品系與殼黑品系180—450 dph的生長(zhǎng)Tab.2 Growth of golden shell and black shell lines from 180 to 450 dph in Crassostrea sikamea (n=60; ±SD)

品系Line 殼高 Shell height (mm) 殼長(zhǎng)Shell length (mm) 總重Total weight (g) 總體積Total volume (mL) 軟體重Body weight (g)180 dph(2016年12月) 180 dph (December 2016)殼金Golden shell 43.92±6.77a 31.61±6.20a 10.94±3.81a 6.02±2.17a 2.36±0.90a殼黑Black shell 38.83±7.65b 26.47±5.91b 7.13±3.70b 4.35±2.45b 1.32±0.76b 360 dph(2017年6月) 360 dph (June 2017)殼金Golden shell 50.99±9.42a 34.87±6.99a 23.53±4.76a 15.58±2.95a 4.12±0.88a殼黑Black shell 50.12±8.95a 37.97±6.39a 19.41±8.74b 12.04±5.38b 3.86±1.74a 450 dph(2017年10月) 450 dph (October 2017)殼金Golden shell 56.56±10.94a 39.36±8.27a 30.28±12.33a 18.71±7.62a 4.83±1.84a殼黑Black shell 57.57±6.24a 38.68±5.25a 27.33±8.79b 17.50±5.81a 4.17±1.83a

2.3 成貝存活率差異比較

熊本牡蠣浮游幼蟲期(9—15 dph)、稚貝期(40 dph)與幼貝期(180 dph)殼金品系的存活率高于殼黑品系,但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。360 dph與450 dph(2017年6月與10月)殼金品系的成活率分別為55.35%與42.22%,是殼黑品系成活率(分別為25.23%與12.09%)的2.19倍與3.49倍,差異顯著(P＜0.05)。殼金品系在成貝期具有較高的存活率優(yōu)勢(shì)(表3)。

2.4 性別比例

180—450 dph殼金品系與殼黑品系性別比例同步變化。180、360與450 dph殼金品系的雌雄比分別為1∶0.56、1∶0.45與1∶0.9,180與360 dph時(shí)19%與4%的個(gè)體具有未分化性腺。而相同時(shí)間殼黑品系的雌雄比分別為1∶1.7、1∶0.27與1∶0.28,僅在180 dph時(shí)存在15%的未分化個(gè)體(圖1)。

2.5 性腺發(fā)育特征

180—450 dph殼金品系與殼黑品系的性腺發(fā)育具有同步性(圖2)。180 dph殼金品系與殼黑品系處于性腺分化期的個(gè)體比例分別為47.6%與53.5%,處于成熟期和排放期的個(gè)體比例分別為14.3%與7.1%;而360 與450 dph時(shí)90%以上的個(gè)體均處于成熟期、排放期或耗盡期(圖3)。

2.6 生化成分含量變化

180—450 dph殼金與殼黑品系的糖原含量均逐漸升高,而甘油三酯含量逐漸降低;并且殼金品系的糖原含量與甘油三酯含量大于殼黑品系,但無(wú)顯著性差異(P＞0.05,圖4)。總蛋白含量在不同組織和不同時(shí)期無(wú)顯著變化(圖4)。

表 3 熊本牡蠣殼金品系與殼黑品系第9到第450 dph的存活率Tab.3 Survival rate of golden shell and black shell lines of Crassostrea sikamea in 9 to 450 dph

圖1 180—450 dph熊本牡蠣殼金品系(a)與殼黑品系(b)的性別比例Fig.1 Sex ratio of golden shell and black shell lines from 180 to 450 dph in Crassostrea sikamea

圖2 熊本牡蠣殼金與殼黑品系性腺發(fā)育分期Fig.2 Gonad developmental stages for golden shell and black shell lines of Crassostrea sikamea

3 討論

3.1 殼色對(duì)生長(zhǎng)與存活的影響

海洋雙殼貝類普遍具有殼色多態(tài)性現(xiàn)象,淺色殼個(gè)體具有較高的基因純合度,但亦表現(xiàn)較低的適合度[6]。殼色與經(jīng)濟(jì)性狀常存在顯著的相關(guān)性。同時(shí)期的長(zhǎng)牡蠣殼白色群體軟體重與存活率均低于深殼色群體[20]。長(zhǎng)牡蠣中亦發(fā)現(xiàn)殼金色與殼紫色群體幼蟲的殼高顯著高于殼白色群體(P＜0.05),成貝階段殼金色群體的生長(zhǎng)亦顯著大于殼白色與殼黑色群體,并且殼紫色群體的存活率顯著高于其他殼色的群體[21]。進(jìn)一步研究表明,長(zhǎng)牡蠣貝殼的金黃色是一種背景色,為單基因控制的顯性性狀,可以穩(wěn)定遺傳[8];不同殼色個(gè)體生長(zhǎng)與存活的差異性可能是由于有害隱性等位基因純合導(dǎo)致生長(zhǎng)速度下降[5,22]。在本研究中熊本牡蠣不同殼色群體中亦發(fā)現(xiàn)相似現(xiàn)象,殼金品系成貝的生長(zhǎng)與存活率均高于殼黑品系,并且在幼貝與成貝期殼金品系的殼高、殼長(zhǎng)、總重、總體積與軟體重均大于殼黑品系。同時(shí),熊本牡蠣成貝的存活率與殼色亦顯著相關(guān),6月與10月殼金品系的存活率是殼黑品系的2.19倍與3.49倍。因此,熊本牡蠣殼金品系表現(xiàn)出顯著的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)與存活優(yōu)勢(shì)(P＜0.05)。

圖3 180—450 dph熊本牡蠣殼金品系(a)與殼黑品系(b)的性腺發(fā)育特征Fig.3 Gonadal development for golden shell (a) and black shell(b) lines of Crassostrea sikamea from 180 to 450 dph

圖4 180—450 dph熊本牡蠣殼金品系與殼黑品系閉殼肌、外套膜、鰓和性腺中糖元、甘油三酯和總蛋白含量的變化Fig.4 Contents of glycogen,triglyceridy and total protein contents in the adductor muscle,mantle,gill and gonad in golden shell and black shell lines of Crassostrea sikamea from 180 to 450 dph

3.2 性腺發(fā)育周期

外源性因素是影響牡蠣性腺發(fā)育的重要因素,包括水溫、鹽度、餌料生物多寡等[23]。水溫是變化較大的外部因素,水溫通過(guò)影響新陳代謝速率從而影響配子發(fā)育和產(chǎn)卵等生殖活動(dòng),水溫升高新陳代謝加快,通過(guò)供給性腺充足的能量來(lái)促進(jìn)性腺生長(zhǎng)[24]。即使在沒(méi)有繁殖活動(dòng)的冬季,人為升高海灣扇貝(Argopecten irradians)養(yǎng)殖水溫5—20℃,均可促使其生殖腺的發(fā)育成熟[25]。在本研究中180 dph(2016年12月)殼金與殼黑品系僅分別有14.3%和2.8%的個(gè)體處于性腺成熟期,約50%的個(gè)體性腺仍處于生長(zhǎng)期。熊本牡蠣殼金與殼黑品系養(yǎng)殖于廣西北海自然海區(qū),12月份水溫最低。因此,較低的水溫是推遲性腺成熟的原因之一。本研究中殼金與殼黑品系全年只有一個(gè)繁殖期,在6—10月份為繁殖盛期,這種性腺發(fā)育特征與長(zhǎng)牡蠣殼金群體以及魁蚶的性腺發(fā)育相似[11,26]。

3.3 生化成分含量周期性變化

糖原和甘油三酯是牡蠣配子形成過(guò)程中卵黃生成所需的主要物質(zhì)[27]。在本研究中殼金與殼黑品系的糖原與甘油三酯含量在性腺中最高,并隨著配子生成與性腺發(fā)育成熟而增減,表明糖原和甘油三酯與熊本牡蠣繁殖相關(guān)。糖原是牡蠣配子形成過(guò)程中的主要供能物質(zhì),配子發(fā)育成熟需要大量的能量,一旦發(fā)育成熟,能量需要即減少[28]。180—450 dph(12月—次年10月)熊本牡蠣殼黑品系性腺中糖元含量在6月(360 dph)最高,之后逐漸降低,而在殼金品系性腺中糖元含量一直升高,可能表明熊本牡蠣殼金品系比殼黑品系具有更長(zhǎng)的繁殖期。同時(shí),殼金與殼黑品系性腺中甘油三酯含量均逐漸降低。脂質(zhì)是卵子的重要組成成分,甘油三酯是脂質(zhì)積累所需的主要物質(zhì),隨著卵子大量成熟并排放,脂質(zhì)積累完成,甘油三酯需求減少,性腺中甘油三酯含量逐漸降低[27]。在長(zhǎng)牡蠣殼金品系以及菲律賓綴錦蛤(Tapes philippinarum)性腺的發(fā)育過(guò)程中亦發(fā)現(xiàn)甘油三酯含量隨性腺發(fā)育成熟而減少的現(xiàn)象[11,29]。蛋白質(zhì)是貝類卵黃的重要組成部分,是精巢發(fā)育的能量來(lái)源,卵子發(fā)生過(guò)程中蛋白質(zhì)在卵細(xì)胞中積累,并隨卵子排放而在性腺中的含量快速降低[30,31]。冬季牡蠣餌料匱乏時(shí)蛋白質(zhì)亦是主要的供能物質(zhì)[13]。但在本研究中殼金與殼黑品系總蛋白含量無(wú)組織與時(shí)間差異性。熊本牡蠣性腺在發(fā)育過(guò)程中可能具有不同的蛋白代謝方式。

總之,熊本牡蠣殼金品系具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)與存活率優(yōu)勢(shì);兩個(gè)品系之間的性腺發(fā)育具有同步性,性腺中糖原和甘油三酯的含量高低與性腺發(fā)育周期密切相關(guān)。殼金品系與殼黑品系為熊本牡蠣選擇育種提供了有用的素材。