崔恒陽 張電光 凌仕誠(chéng) 陳光輝 譚肖英

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430070)

硒(Se)是魚類維持正常生命活動(dòng)所必需的微量元素之一,在抗氧化和脂類代謝調(diào)控過程中起重要作用[1]。例如,Zhao等[2]指出,與0.3 mg Se/kg飼料組比較,3 mg Se/kg飼料組顯著上調(diào)了豬Sus-scrofa domesticus肝臟中固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白SREBP1(調(diào)控脂類合成代謝的重要轉(zhuǎn)錄因子)的表達(dá)水平;飼料硒添加導(dǎo)致虹鱒Oncorhynchus mykiss肝臟TG含量顯著下降[3];小鼠Mus musculus攝入硒會(huì)改變肝臟脂肪酸代謝,導(dǎo)致體重增加[4]。然而,硒攝入影響機(jī)體脂類代謝變化的機(jī)制在很大程度上是未知的。

miRNA是一類長(zhǎng)度約為22 nt的非編碼小分子RNA,通過形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC),導(dǎo)致靶基因mRNA的降解或翻譯抑制,因而參與許多重要的生命活動(dòng)[5—7]。在斑馬魚Danio rerio[8]、虹鱒[9]和團(tuán)頭魴Megalobrama amblycephala[10]中的研究表明,miRNA能調(diào)控脂類代謝。同時(shí),硒也會(huì)影響動(dòng)物組織miRNA的表達(dá)[11—12]。但是,miRNA介導(dǎo)的硒對(duì)魚類脂代謝的研究還未全面開展。

黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)是一種雜食性淡水魚,因其肉質(zhì)鮮美,市場(chǎng)價(jià)值高,成為我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種。在集約化精養(yǎng)條件下,腸系膜脂肪組織均是包括黃顙魚在內(nèi)的許多魚類脂肪沉積的主要部位。如何降低腸系膜脂肪組織的脂肪沉積,提高腸系膜脂肪組織脂肪的利用率是目前魚類脂類營(yíng)養(yǎng)關(guān)注的重點(diǎn)。然而,要探討降低腸系膜脂肪組織脂肪沉積的能力,首要是要明確腸系膜脂肪組織的代謝特點(diǎn)和調(diào)控機(jī)制。因此,本實(shí)驗(yàn)以黃顙魚作為對(duì)象,研究飼料中不同硒添加量對(duì)黃顙魚腸系膜脂肪組織脂肪沉積和代謝的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚的養(yǎng)殖與飼喂

本實(shí)驗(yàn)中所用的黃顙魚購(gòu)自湖北省潛江水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)。參照Hu等[13]確定的黃顙魚對(duì)飼料硒的適宜需求,在基礎(chǔ)飼料中分別添加0、0.5和14 mg/kg(分別為低硒、適宜硒和高硒組)的Na2SeO3,配制三組實(shí)驗(yàn)飼料(表1)。使用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-MS)方法測(cè)量飼料中硒含量,低硒組、適宜硒組和高硒組飼料中硒的實(shí)際含量分別為0.03、0.25和6.39 mg Se/kg。將暫養(yǎng)過的270尾魚[平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤: (8.27±0.03) g,混合性別]平均分到9個(gè)缸中,在環(huán)境溫度(26±3)℃下,缸中水量約為300 L,正常的光周期(14 L∶10D),每組硒含量飼料飼養(yǎng)3個(gè)缸。每天在09:00和16:30飽食投喂,實(shí)驗(yàn)期間充氣,使水中溶解氧接近飽和。缸中的水每天更換80%。實(shí)驗(yàn)為期12周,取樣前饑餓24h。實(shí)驗(yàn)期間黃顙魚的存活率為100%。

1.2 飼料硒含量、甘油三酯(TG)及脂代謝相關(guān)酶活性的測(cè)定

如前所述的方法測(cè)定飼料中的硒含量。采用南京建成生物工程研究所的商業(yè)試劑盒,按照說明書檢測(cè)黃顙魚腸系膜脂肪組織中TG含量以及脂類代謝相關(guān)酶活性,包括6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6PGD)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、蘋果酸酶(ME)、異檸檬酸脫氫酶(ICDH)和脂肪酸合成酶(FAS)的酶活性。以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品,測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量。一個(gè)酶活性單位定義為在28℃的條件下,每分鐘內(nèi)催化1 μmoL底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量,并表示為mU/mg可溶蛋白。

表 1 實(shí)驗(yàn)飼料配方和營(yíng)養(yǎng)成分分析Tab.1 Feed formulation and proximate analysis of experimental diets

1.3 總RNA提取和分析

使用TRIzol 試劑盒(TaKaRa)按照說明書步驟,提取脂肪組織總RNA。通過NanoDrop 分光光度計(jì)分析總RNA樣品的純度和濃度,結(jié)果顯示所有樣品均為高純度,A260/A230吸光度比為2.0—2.1,A260/A230吸光度比為1.8—1.9。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性,結(jié)果顯示所有RNA樣品具有高質(zhì)量,28S rRNA的亮度約是18S rRNA的2倍。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)

使用生工生物工程(上海)股份有限公司的miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,制備miRNA熒光定量模板,方法依照說明書進(jìn)行。使用Prime-ScriptTMRT reagent Kit試劑盒(TaKaRa)制備待檢測(cè)mRNA的cDNA模板,方法依照說明書進(jìn)行。qPCR分析使用SYBR?Premix ExTaqTMII試劑盒(TaKaRa)在MyiQ?2 Two-Color Real-Time PCR Detection System分析檢測(cè)儀(Bio-Rad)上進(jìn)行。反應(yīng)體系總體積為20 μL,包括: 10 μL SYBR?Premix ExTaqTMII,1 μL cDNA 模板,0.8 μL引物(上下游引物各0.4 μL,濃度為10 mmol/L)和8.2 μL H2O。mRNA定量引物見表2,miRNA定量引物見表3。qPCR反應(yīng)參數(shù)為: 95℃預(yù)變性30s;95℃ 5s,57℃30s,72℃ 30s,共40個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)均設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。在qPCR分析之前,對(duì)所有的引物進(jìn)行檢測(cè),確保只有單一條帶。用逐級(jí)稀釋cDNA的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,保證所有基因的擴(kuò)增效率大致相同且接近于100%。相對(duì)表達(dá)水平采用2?ΔΔCt方法計(jì)算。本實(shí)驗(yàn)選用U6作為miRNA表達(dá)量的內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,使用tuba以及β-actin作為mRNA表達(dá)量的內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.5 miRNA靶基因預(yù)測(cè)及生物信息學(xué)分析

使用TargetScanFish6.2(http://www.targetscan.org/fish_62/)和miRwalk3.0(http://mirwalk.umm.uniheidelberg.de/)基于miRNA與靶基因互作的原則[14],預(yù)測(cè)差異表達(dá)脂代謝相關(guān)miRNA靶基因。在篩選出靶基因后,進(jìn)行KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)富集分析,Pathway顯著性富集分析以KEGG Pathway為單位,應(yīng)用超幾何檢驗(yàn),找出與整個(gè)基因組背景相比,在候選靶基因中顯著性富集的Pathway。該分析的計(jì)算公式:

表 2 靶基因定量PCR反應(yīng)所使用的引物序列Tab.2 Primers used for the mRNA PCR reaction

表 3 miRNA定量PCR反應(yīng)所使用的引物序列Tab.3 Primers used for the miRNA PCR reaction

式中,N為所有基因中具有Pathway注釋的基因數(shù)目;n為N中候選靶基因的數(shù)目;M為所有基因中注釋為某特定Pathway的基因數(shù)目;m為注釋為某特定Pathway的候選靶基因數(shù)目。并對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行Bonferroni校正,以校正P值,False Discovery Rate(FDR)≤0.05的KEGG通路才定義為在候選靶基因中顯著富集。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(Mean±SEM)。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和多重比較檢驗(yàn)(Duncans multiple range test),顯著差異水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 飼料硒添加對(duì)黃顙魚腸系膜脂肪組織脂類代謝的影響

如圖1A所示,相比較于適宜硒組,在高硒和低硒添加組,脂肪組織內(nèi)TG含量顯著上升(P＜0.05)。如圖1B所示,與適宜硒組比較,FAS的酶活性在低硒和高硒組中均顯著上升(P＜0.05),G6PD和6PGD的酶活性在低硒組中活性顯著下降(P＜0.05),在高硒組中活性顯著上升(P＜0.05);異檸檬酸脫氫酶(ICDH)的活性,在高硒組中顯著下降(P＜0.05),在低硒組中沒有顯著性變化;蘋果酸酶(ME)酶活性在低硒和高硒組中均顯著上升(P＜0.05)。

圖1 飼料硒水平對(duì)黃顙魚腸系膜脂肪組織TG含量及脂類代謝相關(guān)酶活性的影響Fig.1 Effects of dietary selenium levels on TG content and enzyme activities of lipid metabolism of the mesenteric adipose tissue in yellow catfish

圖2 飼料硒水平對(duì)黃顙魚腸系膜脂肪組織miRNAs表達(dá)的影響Fig.2 Effect of dietary selenium levels on the expression of miRNAs in mesenteric adipose tissue of yellow catfish

2.2 硒對(duì)黃顙魚腸系膜脂肪組織miRNA表達(dá)的影響

如圖2所示,相比于適宜硒組,在高硒添加組,miR-26a、miR-183和miR-135的表達(dá)量顯著上升(P＜0.05),而在低硒組中沒有顯著性差異;miR-181a-5p在低硒組中顯著上升(P＜0.05),在高硒組中沒有顯著性差異;miR-130和miR-203a在低硒和高硒組中表達(dá)量均顯著上升(P＜0.05);miR-200a和miR-143在低硒組中表達(dá)量顯著下降(P＜0.05),在高硒組中表達(dá)量顯著上升(P＜0.05)。相比較于適宜硒組,let-7b和let-7c在高硒添加組表達(dá)量顯著上升(P＜0.05);let-7e在低硒添加組表達(dá)量顯著上升(P＜0.05);let-7d和let-7f在低硒添加組表達(dá)量顯著下降(P＜0.05),在高硒添加組表達(dá)量顯著上升(P＜0.05)。差異表達(dá)倍數(shù)變化較大的(|log2fold change|＞5)miR-135和let-7g的表達(dá)量?jī)H在高硒添加組顯著上升(P＜0.05);miR-143的表達(dá)量在低硒添加組顯著下降(P＜0.05),在高硒添加組顯著上升(P＜0.05);miR-203a的表達(dá)量在高硒和低硒添加組均顯著上升(P＜0.05)。

2.3 差異表達(dá)miRNA KEGG通路富集分析

對(duì)硒產(chǎn)生強(qiáng)響應(yīng)的miRNA的靶基因進(jìn)行KEGG pathway富集分析,結(jié)果表明,miR-130的靶基因在胰島素通路、胰島素抵抗、自噬、鞘脂類代謝、調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞脂肪分解和mTOR通路中顯著富集(P＜0.05,FDR≤0.05,圖3);miR-203a的靶基因在胰島素抵抗、胰島素通路、調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞脂肪分解和自噬等代謝途徑、信號(hào)通路中顯著富集(P＜0.05,FDR≤0.05,圖4);miR-143的靶基因在礦物吸收、不飽和脂肪酸生物合成、胰島素通路、自噬、脂肪酸代謝、鞘脂類代謝和甘油磷脂代謝等途徑中顯著富集(P＜0.05,FDR≤0.05,圖5)。綜合分析發(fā)現(xiàn),三個(gè)差異表達(dá)miRNA的靶基因共同富集在自噬、凋亡、胰島素抵抗和脂肪酸合成等脂代謝相關(guān)的通路中。

圖3 miR-130靶基因富集的前15條KEGG通路Fig.3 Top 15 KEGG pathway analysis of miR-130 target genes圖通過R語言3.6.0輸出,圓圈的面積越大表示基因數(shù)目越多,顏色越亮表示差異越顯著,富集因子越大表示顯著性越可靠;下同F(xiàn)igure output by R version 3.6.0.The larger area of circle,the greater number of genes.Colors from dark to light indicate the significance from small to large.The greater enrichment factor,the more reliable significance.The same applies below

圖4 miR-203a靶基因富集的前15條KEGG通路Fig.4 Top 15 KEGG pathway analysis of miR-203a target genes

圖5 miR-143靶基因富集的前15條KEGG通路Fig.5 Top 15 KEGG pathway analysis of miR-143 target genes

2.4 共富集通路中脂類代謝相關(guān)靶基因定量分析

對(duì)miR-143、miR-130和miR-203a共富集通路中的關(guān)鍵脂類代謝相關(guān)靶基因進(jìn)行定量檢測(cè)(圖6),相比較于適宜硒組,過氧化物酶體增殖劑激活受體b(pparb)和脂肪組織甘油三酯酶(atgl)的表達(dá)量在低硒和高硒組中顯著上升(P＜0.05);乙酰輔酶A羧化酶b(accb)、碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白α(chrebpα)和過氧化物酶體增殖劑激活受體α(pparα)的表達(dá)量?jī)H在高硒組中顯著下降(P＜0.05);肉堿棕櫚先轉(zhuǎn)移酶1α(cpt1α)、fas、激素敏感酯酶(hsl)和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(srebp1)的表達(dá)量在低硒和高硒添加組中均顯著下降(P＜0.05)。

圖6 共富集通路靶基因相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative mRNA expression of co-enriched target genes tuba和β-actin作為內(nèi)參,適宜硒組標(biāo)準(zhǔn)化為1

3 討論

本研究結(jié)果表明,飼料硒缺乏和過量都會(huì)誘導(dǎo)黃顙魚腸系膜脂肪組織脂質(zhì)沉積。硒在魚類正常生長(zhǎng)和代謝過程中發(fā)揮重要作用,本研究發(fā)現(xiàn),0.03和6.39 mg Se/kg的飼料均造成黃顙魚腸系膜脂肪組織中FAS酶活性上升,TG含量增加,導(dǎo)致腸系膜脂肪組織中脂質(zhì)沉積;同時(shí),對(duì)組織中其他脂類代謝相關(guān)酶活性的測(cè)定分析發(fā)現(xiàn),0.03 mg Se/kg的飼料投喂黃顙魚會(huì)導(dǎo)致G6PD和6PGD酶活性的下降;6.39 mg Se/kg的飼料投喂黃顙魚造成其G6PD、6PGD和ME酶活性的上升,ICDH酶活性下降,間接造成脂質(zhì)沉積。本研究結(jié)果與胡俊茹等[15]和Zhu等[16]在黃顙魚幼魚和黑鱸的研究結(jié)果相類似,然而,與胡俊茹等[15]在低硒誘導(dǎo)黃顙魚幼魚體脂肪沉積減少的結(jié)果相反,其原因可能是由于miRNA的表達(dá)具有時(shí)間特異性和組織特異性,miRNA在黃顙魚的幼魚期和成魚期表達(dá)存在較大的差異,且腸系膜脂肪組織和皮下脂肪組織的表達(dá)存在差異,進(jìn)而造成對(duì)下游脂代謝相關(guān)靶基因的調(diào)控產(chǎn)生不同的影響。

已有研究表明miR-21、miR-26a、miR-12、miR-130、miR-146、miR-152、miR-181a-5p、miR-183、miR-200a、miR-205、let-7、miR-143、miR-135和mir-203a對(duì)脂肪代謝產(chǎn)生重要影響[17—19]。在本研究中,miR-130和miR-203a在硒缺乏組和高硒組中表達(dá)量均顯著上升(P＜0.05);let-7d和let-7f、miR-200a和miR-143在低硒組中表達(dá)量顯著下降(P＜0.05),在高硒組中表達(dá)量顯著上升(P＜0.05)。差異表達(dá)倍數(shù)變化較大的(|log2fold change|＞5)miRNAs中,miR-135和let-7g的表達(dá)量?jī)H在高硒組顯著上升(P＜0.05);miR-143的表達(dá)量在低硒組顯著下降(P＜0.05),在高硒組顯著上升(P＜0.05);miR-203a的表達(dá)量在高硒和低硒組均顯著上升(P＜0.05)。miR-143、miR-130和miR-203a對(duì)硒添加量變化產(chǎn)生響應(yīng),對(duì)3個(gè)對(duì)硒響應(yīng)的miRNA靶基因分析中發(fā)現(xiàn),共同富集在自噬、凋亡、胰島素抵抗和脂肪酸合成等脂代謝相關(guān)的通路中。已有研究表明,miR-130a/b通過刺激脂解基因CPT1a和PPARα在脂肪沉積過程中發(fā)揮積極作用[20],miR-130的高表達(dá)可以通過抑制脂解基因的翻譯,造成脂肪沉積;miR-203a的高表達(dá)可以通過靶向硒蛋白P和HIP/ PAP mRNAs造成脂肪沉積[21];miR-143在高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠腸系膜脂肪組織中高表達(dá),在誘導(dǎo)TG合成的過程中發(fā)揮正向作用[22]。在本研究中,低硒和高硒飼料通過誘導(dǎo)miR-143、miR-130和miR-203a的差異表達(dá)對(duì)黃顙魚腸系膜脂肪組織脂質(zhì)沉積產(chǎn)生影響。

為了進(jìn)一步探究硒誘導(dǎo)miR-143、miR-130和miR-203a通過哪些靶基因?qū)χ|(zhì)沉積發(fā)揮作用,我們選取miRNA靶基因共富集的自噬、凋亡、胰島素抵抗、調(diào)節(jié)脂肪分解和脂肪酸合成等脂類代謝相關(guān)通路中關(guān)鍵靶基因rxra、accb、cpt1a、hsl、fas、pparb、chrebpa、srebp1、pparα和atgl進(jìn)行定量驗(yàn)證,結(jié)果顯示pparb和atgl的表達(dá)量在低硒和高硒添加組中顯著上升(P＜0.05);accb、chrebpa和pparα的表達(dá)量?jī)H在高硒添加組中顯著下降(P＜0.05);cpt1a、fas、hsl和srebp1的表達(dá)量在低硒和高硒添加組中均顯著下降(P＜0.05)。miRNA對(duì)靶基因大多數(shù)發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用,其靶基因的表達(dá)趨勢(shì)與miRNA的表達(dá)趨勢(shì)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),chrebpa的表達(dá)趨勢(shì)與miR-143相符合,cpt1a、hsl、fas、srebp1和pparα的表達(dá)趨勢(shì)與miR-203與miR-130相符合。碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(ChREBP)是脂肪合成途徑中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,通過激活A(yù)CL、ACC1和FAS促使脂質(zhì)沉積[23],高硒抑制miR-143的表達(dá),進(jìn)而使miR-143對(duì)chrebpa的負(fù)調(diào)控作用減弱,導(dǎo)致脂肪合成通路被激活,造成脂肪沉積;肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1(CPT1)是線粒體β-氧化的限速酶,控制長(zhǎng)鏈?；o酶A的線粒體攝取,在高水平表達(dá)時(shí),CPT1有助于增加脂肪酸分解并降低體脂含量,同時(shí),激素敏感脂酶(HSL)是水解脂肪細(xì)胞中所有的酰基甘油的關(guān)鍵酶,HSL可通過水解脂肪組織中的

甘油三酯(TG),降低脂質(zhì)含量,低硒和高硒飼料通過誘導(dǎo)miR-130和miR-203a的表達(dá)量上調(diào),使其對(duì)下游靶基因cpt1a和hsl的抑制作用增強(qiáng),導(dǎo)致靶基因表達(dá)量下降,進(jìn)而抑制了黃顙魚腸系膜脂肪組織中脂肪酸的分解,造成脂肪沉積。同時(shí),miR-143、miR-130和miR-203a通過調(diào)控其下游fas、srebp1、pparα、lpl、pparβ和atgl的表達(dá),介導(dǎo)低硒和高硒飼料誘導(dǎo)的黃顙魚腸系膜脂肪組織的脂質(zhì)沉積。