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多鱗fih-1基因克隆及其低氧脅迫的mRNA表達(dá)

2020-08-07 01:23黃志棚林星樺王耀嶸江東能陳華譜鄧思平朱春華李廣麗田昌緒
水生生物學(xué)報 2020年4期
關(guān)鍵詞:團(tuán)頭魴低氧魚類

黃志棚 林星樺,2 王耀嶸,2,3 江東能,2,3 陳華譜,2,3 鄧思平,2,3 朱春華,2,3 李廣麗,2,3 黃 洋,2,3,* 田昌緒,2,3,*

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,湛江 524088;2.廣東省名特優(yōu)魚類生殖調(diào)控與繁育工程技術(shù)研究中心,湛江 524088;

3.廣東省海水養(yǎng)殖生物育種工程實(shí)驗(yàn)室,湛江 524088)

多鱗Sillago sihama(Forsk?l),又名沙錐魚,隸屬鱸形目、科,為熱帶印度至西太平洋淺海魚類,廣泛分布于我國沿海地區(qū),粵西地區(qū)產(chǎn)量豐富,但近年來由于過度捕撈,導(dǎo)致多鱗種群數(shù)量減少,產(chǎn)量降低[1]。該魚美味可口深受消費(fèi)者喜愛,市場價格約60元/斤,具有較高的經(jīng)濟(jì)價值和營養(yǎng)價值[2]。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中,多鱗屬小型魚類,成品魚規(guī)格小,養(yǎng)殖管理過程簡單,養(yǎng)殖成活率高,經(jīng)濟(jì)效益較好,養(yǎng)殖前景十分廣闊[1]。目前杜濤等[3]已攻克了多鱗人工繁殖技術(shù)并對多鱗的人工養(yǎng)殖進(jìn)行了初步試驗(yàn),研究發(fā)現(xiàn)多鱗與對蝦的混養(yǎng)模式具有較高的養(yǎng)殖效益,水體溶解氧過低是養(yǎng)殖過程中造成大規(guī)模死亡的主要原因。多鱗耐低氧能力差,對水體溶解氧含量變化敏感,在低氧環(huán)境下易出現(xiàn)浮頭現(xiàn)象。目前尚未能夠?qū)崿F(xiàn)工廠化高密度養(yǎng)殖,嚴(yán)重限制了其養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展空間。

水體中溶解氧含量不足或缺氧,直接影響了魚類生長發(fā)育、繁殖及各種行為活動,進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的水產(chǎn)養(yǎng)殖問題[4—6]。低氧誘導(dǎo)因子抑制因子-1(factor inhibiting hypoxia inducible factor 1,fih-1)是魚類低氧信號通路中的關(guān)鍵因子,在魚類低氧轉(zhuǎn)錄響應(yīng)中起重要作用。fih-1是由Mahon等[7]通過酵母雙雜交方法發(fā)現(xiàn)的一種與HIF相互作用的蛋白。人類fih-1基因定位于10號染色體(10q24),含有8個外顯子[8]。fih-1是一種天冬酰胺羥化酶,屬于2-氧化戊二酸依賴的二氧化物酶超家族,能夠使HIF-1α羧基端反式激活區(qū)(CTAD)的天冬酰胺殘基羥基化[9]。在低氧信號傳導(dǎo)途徑中fih-1在常氧條件下利用氧氣中的氧分子將HIF-1α的CTAD天冬酰胺殘基羥基化,阻礙HIF-1α與轉(zhuǎn)錄輔助因子(CBP/p300)結(jié)合,從而抑制其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。相反,在低氧條件下,fih-1對HIF-1α羥基化能力下降,HIF-1α能夠與轉(zhuǎn)錄輔助因子結(jié)合,從而促進(jìn)下游靶基因轉(zhuǎn)錄[4,9,10]。目前在魚類中關(guān)于fih-1基因的研究也取得一定進(jìn)展: Zhang等[10]完成了團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)fih-1基因的克隆,并在該基因中發(fā)現(xiàn)3個與其低氧耐受性狀相關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn);李紅蓮[11]克隆了尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)fih-1α基因并對其抑制劑fih-1αn進(jìn)行了功能分析;丁為群等[12]完成鰱(Hypophthalmichthys molitrix)低氧調(diào)控基因igfbp-1和igf-I的克隆及表達(dá)特征分析;Geng等[13]基于轉(zhuǎn)錄組技術(shù)開展了斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)fih-1基因在低氧脅迫下的表達(dá);Ju-Hoon等[14]對斑馬魚(Danio rerio) fih-1與Mib E3泛素連接酶相互作用機(jī)制進(jìn)行了探討。

fih-1基因在低氧脅迫通路中發(fā)揮重要作用,但目前多鱗中fih-1基因尚未克隆,其機(jī)制特別是在低氧脅迫后的表達(dá)機(jī)制不清楚,因此本研究的開展將為多鱗低氧脅迫相關(guān)基因的研究和解析多鱗低氧脅迫分子機(jī)理建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚

本實(shí)驗(yàn)多鱗均為1齡性成熟魚[體重(30.0±5.0) g,體長(13.5±3.0) cm],來自廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物研究基地。

1.2 低氧脅迫處理實(shí)驗(yàn)

1.3 樣品采集和保存

在實(shí)驗(yàn)魚麻醉后解剖分離組織。對照組采集鰓、心臟、腦、肝臟、肌肉、精巢、卵巢等7個組織,其余三組采集鰓和心臟組織,采樣后立刻放入液氮速凍,后轉(zhuǎn)移到-80℃保存,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 總RNA的提取及cDNA的合成

本實(shí)驗(yàn)采用Trizol法提取總RNA,使用瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)Tanon-1600全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)檢驗(yàn)RNA的完整性,使用Nanodrop 2000 超微量生物檢測儀測定RNA的濃度和質(zhì)量,最后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa Bio)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.5 fih-1基因cDNA全長的克隆

從多鱗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[2]中獲取fih-1基因序列,設(shè)計多鱗fih-1基因相關(guān)引物和β-actin基因引物(表1)?;旌细?、肌肉、腦等組織cDNA作為模板,以fih1-Ss-orf-f引物作為正向引物,fih1-Ss-orf-r引物作為反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),程序設(shè)定為94℃預(yù)變性3min,94℃變性1min,58℃退火30s,72℃延伸1.5min,進(jìn)行30個循環(huán),72℃延伸10min,4℃保存。PCR產(chǎn)物選取5 μL進(jìn)行電泳(DYY-6C型電泳儀)檢測,將目的產(chǎn)物送上海生工公司測序。

表 1 引物名稱編號及其相應(yīng)的序列Tab.1 Primer sequence

1.6 fih-1基因的生物信息學(xué)分析

運(yùn)用DNAstar軟件(https://www.dnastar.com/)預(yù)測出基因的開放閱讀框(ORF)并翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列;運(yùn)用SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu);運(yùn)用Signal IP 4.1網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測基因前體蛋白的信號肽;通過Swiss-Model(https://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行基因的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測;使用DNAMAN 8軟件對基因氨基酸序列與其他脊椎動物的基因氨基酸序列進(jìn)行多序列比對,利用MEGA 7.0軟件對氨基酸序列與其他脊椎動物的氨基酸序列進(jìn)行鄰接聚類分析。

1.7 fih-1基因的組織表達(dá)

1.8 fih-1基因的組織表達(dá)熒光定量分析

本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時熒光定量分析方法,對多鱗低氧脅迫處理前后鰓和心臟組織fih-1基因表達(dá)變化進(jìn)行分析。在低氧脅迫實(shí)驗(yàn)處理后,每組隨機(jī)選用3尾多鱗的鰓、心臟組織cDNA作為模板,以fih-1-RT-f引物作為正向引物,fih-1-RT-r引物作為反向引物,以β-actin基因作為內(nèi)參,使用實(shí)時熒光定量PCR儀(Roche,LightCycle?96)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),擴(kuò)增循環(huán)程序?yàn)?5℃變性10s,58℃退火15s,72℃延伸15s,進(jìn)行40個循環(huán)。每個樣品做3個生物學(xué)重復(fù),三個技術(shù)重復(fù)。熒光定量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用2?ΔΔCt法計算相對表達(dá)量,用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,Duncan法對組間差異進(jìn)行多重比較,用GraphPad Prism 7.0制作表達(dá)量直方圖。

2 結(jié)果

2.1 fih-1基因全長cDNA的克隆及特征分析

多鱗fih-1基因cDNA全長為1280 bp,ORF為1065 bp,可編碼353個氨基酸,其GenBank登錄號為MN013394。對cDNA序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在第145個到第312個氨基酸包含一個JmjC 保守結(jié)構(gòu)域,fih-1蛋白無信號肽,其三級結(jié)構(gòu)模型是一個同二聚體。

2.2 fih-1基因的同源性以及系統(tǒng)進(jìn)化分析

以多鱗fih-1基因氨基酸序列為基礎(chǔ),在NCBI中進(jìn)行BLAST分析,得到尖吻鱸(Lates calcarifer)、大黃魚(Larimichthys crocea)、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)、武昌魚(Megalobrama amblycephala)、白斑狗魚(Esox lucius)、斑馬魚(Danio rerio)、原雞(Gallus gallus)、非洲爪蟾(Xenopus tropicalis)、牛(Bos taurus)、智人(Homo sapiens)及小家鼠(Mus musculus)的氨基酸序列。使用DNAMAN 8軟件分析得到多鱗與尖吻鱸的同源性最高為94.66%,其次是大黃魚為92.13%;與哺乳動物智人同源性為80.34%,與兩棲類非洲爪蟾同源性為77.25%,與禽類原雞的同源性為78.93%。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示,系統(tǒng)進(jìn)化樹主要分為2個大分支,魚類聚為一支,哺乳動物、鳥類、兩棲類等較高等的生物聚為另一支。其中多鱗與大黃魚和尖吻鱸的親緣關(guān)系最近,與哺乳動物、兩棲類和禽類的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖1)。

2.3 多鱗fih-1基因在不同組織的表達(dá)

在正常氧條件下,對多鱗鰓、心臟、腦、肝、卵巢、精巢、肌肉等組織fih-1基因表達(dá)分析(圖2),多鱗fih-1基因在不同組織中均有表達(dá),其中在精巢、卵巢和肌肉中的表達(dá)水平最高,其次在鰓、心臟和肝臟中的表達(dá)水平相對較高,在腦組織中的表達(dá)水平較低。

2.4 多鱗低氧脅迫處理前后fih-1基因的表達(dá)變化

對多鱗進(jìn)行低氧脅迫實(shí)驗(yàn),分析低氧脅迫處理過程中fih-1基因在鰓和心臟組織中表達(dá)變化(圖3)。結(jié)果顯示,經(jīng)低氧脅迫處理1h后,fih-1基因在鰓和心臟組織中的表達(dá)量顯著升高(P<0.05),低氧脅迫處理6h后,fih-1基因在鰓和心臟中的表達(dá)量持續(xù)顯著升高(P<0.05),恢復(fù)正常溶解氧4h后,fih-1基因在鰓和心臟中的表達(dá)量相對低氧脅迫處理時顯著下降(P<0.05),但仍顯著高于正常水平。

圖1 多鱗鱚與其他脊椎動物fih-1基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of fih-1 gene of S. sihama and other vertebrates

圖2 多鱗鱚fih-1基因的組織表達(dá)Fig.2 The expression of fih-1 in various tissues of S. sihama

3 討論

目前已有很多關(guān)于魚類低氧相關(guān)基因的研究報道,但在多鱗中尚未有相關(guān)的研究。本次研究獲得多鱗fih-1基因序列信息及其低氧脅迫處理下鰓和心臟組織中表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)fih-1在多鱗低氧信號傳導(dǎo)通路中具有重要作用,可為今后多鱗低氧脅迫研究提供基礎(chǔ)資料。

在常氧條件下,fih-1基因在團(tuán)頭魴和斑點(diǎn)叉尾鮰主要組織中廣泛表達(dá)[10,13],本研究也發(fā)現(xiàn)該基因在多鱗主要組織中均有表達(dá),其中在肌肉、卵巢、精巢的表達(dá)水平最高,在鰓、心臟、肝的表達(dá)水平較高,在腦的表達(dá)水平較低。同時,fih-1基因在不同的魚類中組織表達(dá)也存在一定差異,在團(tuán)頭魴和多鱗的肝臟組織表達(dá)水平相對較高,在斑點(diǎn)叉尾鮰的肝臟組織表達(dá)相對較低,在河川沙塘鱧的腦組織表達(dá)水平相對較高,而在多鱗的腦組織表達(dá)相對較低[10,11,13]。

圖3 低氧脅迫處理多鱗鱚fih-1基因在鰓(A)和心臟(B)的組織表達(dá)量變化Fig.3 The expression of fih-1 gene in gill (A) and heart (B) under hypoxia stress

鰓和心臟是魚類低氧應(yīng)激反應(yīng)主要應(yīng)答器官,研究低氧脅迫下多鱗fih-1基因在鰓和心臟組織中表達(dá),發(fā)現(xiàn)該基因在低氧脅迫處理過程表達(dá)持續(xù)顯著升高,表明fih-1基因在多鱗低氧脅迫轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在多鱗中,低氧處理1h后,fih-1基因在鰓和心臟組織中的表達(dá)量顯著升高,但在團(tuán)頭魴的研究中,低氧處理2h后,fih-1基因在大部分組織中的表達(dá)量降低[10],提示該基因的表達(dá)可能在多鱗和團(tuán)頭魴間存在物種特異性。經(jīng)過低氧處理6h后,fih-1基因在多鱗鰓和心臟組織表達(dá)量顯著升高,在團(tuán)頭魴中fih-1基因表達(dá)量同樣表現(xiàn)顯著升高[10],這種現(xiàn)象還出現(xiàn)在尼羅羅非魚和斑點(diǎn)叉尾鮰[11,13],表明在魚類中長時間的低氧脅迫處理可能會持續(xù)激活fih-1基因mRNA的表達(dá)。在低氧信號傳導(dǎo)途徑中,fih-1基因應(yīng)在缺氧期間表達(dá)下調(diào),促進(jìn)HIF與其轉(zhuǎn)錄輔助因子結(jié)合并激活其下游靶基因表達(dá)[4,9],但在以上4種魚類中經(jīng)過長時間的低氧脅迫處理fih-1基因在組織中的表達(dá)顯著升高,提示低氧通路中fih-1與HIF之間可能存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制,說明fih-1在魚類低氧適應(yīng)中起著重要的作用。丁晨雨等[15]發(fā)現(xiàn)低氧脅迫通過調(diào)節(jié)鰱心肌Bax基因和Bcl-2基因的表達(dá)來誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡,從而造成鰱心臟損傷甚至魚死亡,吳鑫杰等[16]發(fā)現(xiàn)低氧可導(dǎo)致團(tuán)頭魴心臟組織結(jié)構(gòu)的變化及線粒體損傷,低氧能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡。在恢復(fù)氧氣4h后,多鱗fih-1基因在鰓和心臟組織的表達(dá)量相對低氧脅迫處理時顯著降低,逐漸恢復(fù)至正常水平,但仍比正常水平要高。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的可能原因是低氧處理導(dǎo)致多鱗鰓和心臟組織部分細(xì)胞損傷,也可能是經(jīng)過長時間的低氧處理,fih-1的表達(dá)量恢復(fù)至正常水平需要更長的時間。

綜上所述,本研究成功克隆多鱗fih-1基因并對其基因序列進(jìn)行分析,同時探究在不同低氧脅迫處理下多鱗fih-1基因mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果表明,不同低氧脅迫處理組間存在顯著的差異,表明fih-1基因在多鱗低氧信號傳導(dǎo)通路中扮演重要的角色。本次實(shí)驗(yàn)為開展并解釋多鱗低氧脅迫遺傳機(jī)制提供候選基因,可為后續(xù)fih-1基因SNP篩選、鑒定以及關(guān)聯(lián)性分析建立基礎(chǔ)。

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