張金羽,葛 瀅,張春華

(1.南京農(nóng)業(yè)大學 資源與環(huán)境科學學院 江蘇省海洋生物學重點實驗室,南京 210095;2.南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學實驗中心,南京 210095)

砷是一種廣泛分布在海洋、淡水和土壤環(huán)境中的類金屬元素,有以下4種價態(tài):-3、0、＋3和＋5,賦存形態(tài)可分為無機砷和有機砷。無機砷主要為亞砷酸鹽[As(Ⅲ)]和砷酸鹽[As(Ⅴ)];有機砷主要包括一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、三甲基砷酸(TMA)、砷甜菜堿(AsB)、砷膽堿(AsC)、砷糖和砷脂等[1-3]。砷的形態(tài)制約其毒性大小,與無機砷相比,有機砷如MMA、DMA、AsB等形態(tài)的毒性要小得多。水環(huán)境中砷的含量較低,主要以As(Ⅴ)存在[4-5]。水體中大量的藻類等初級生產(chǎn)者可將無機砷吸收、轉(zhuǎn)化為有機砷,并通過食物鏈傳遞[6-7],從而對水生生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生顯著影響。

不同生物對砷有不同的耐受性,導致砷的解毒機制多樣。不同解毒機制導致砷與不同細胞組分結(jié)合并進行形態(tài)轉(zhuǎn)化,根據(jù)轉(zhuǎn)化生成物溶解性大體可分為水溶態(tài)、脂溶態(tài)和殘渣態(tài)等3種組分[8-9]。不同組分含有多種砷的賦存形態(tài),其提取、測定方法各不相同。為保證水生生物細胞內(nèi)砷形態(tài)穩(wěn)定且提取完全,文獻[3,10-13]采用了不同溶劑進行單一或分級提取,取得了一定的效果,但目前還沒有相關(guān)研究的總結(jié)。因此,本文總結(jié)了淡水及海洋生物中不同組分的砷含量、形態(tài)及其提取與測定方法,為深入了解水生生物體內(nèi)砷的富集代謝規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

1 水生生物中的砷形態(tài)

目前已報道的水生生物中的砷形態(tài)可分為5類:無機砷、甲基砷、砷甜菜堿、砷膽堿、砷糖、砷脂。

1.1 無機砷

無機砷主要以As(Ⅲ,亞砷酸鹽)和As(Ⅴ,砷酸鹽)的形式存在,是海水和淡水環(huán)境中的主要砷形態(tài),通常在生物體中質(zhì)量分數(shù)較低,約占總砷的0.4%～30.7%[9]。而褐藻、羊棲菜則例外,其含有約占總砷50%以上的無機砷[14];泰國淡水魚[13]和挪威某些地區(qū)的藍貽貝[15]報道了其中無機砷質(zhì)量分數(shù)較高,約占總砷42%以上。

1.2 甲基砷

在亞砷酸鹽甲基轉(zhuǎn)移酶(ArsM)的催化下,無機砷可以甲基化為MMA 和DMA[16-17],還可產(chǎn)生三甲基砷(TMAO)、揮發(fā)性TMA 及四甲基砷(TETRA)[17-21]等。這些化合物在海產(chǎn)品中質(zhì)量分數(shù)較小(0.1%～3.6%),主要形態(tài)是DMA,軟體動物可以含有比魚類或藻類更高比例的DMA(5%～46%)[22-27]。MMA在海洋環(huán)境中并不常見,并且通常僅以痕量存在。TMAO 迄今尚未在海藻中發(fā)現(xiàn),但在一些魚類中以較高質(zhì)量分數(shù)(2%～8%)存在[28]。

1.3 砷甜菜堿和砷膽堿

砷甜菜堿是雙離子型四元烷基砷化合物,其結(jié)構(gòu)高度穩(wěn)定不易被降解。砷甜菜堿是大多數(shù)有鰭魚類和貝類中砷的主要存在形態(tài)(70%～98%),也存在于浮游動物和褐藻、綠藻、紅藻等[29-32]。水生生物體內(nèi)也存在砷膽堿,例如從星斑鯊油中水解堿的不穩(wěn)定組分中檢出了磷脂酰砷膽堿[33],但含量要低于砷甜菜堿。

1.4 砷糖

一些生物可以將無機砷甲基化并合成一系列含有核糖的砷化物,統(tǒng)稱為砷糖。海藻從海水中吸收、積累砷并主要以砷糖的形式儲存,通常質(zhì)量分數(shù)較高,約占總砷的80%以上[34-35]。軟體動物[22,25,36-38]和甲殼類動物[39]這些濾食性、食草動物通過攝入藻類或浮游植物而含有較低質(zhì)量分數(shù)的砷糖(0.2%～28%)。目前已報道了20 多種砷糖,但最常見的4種形式是甘油砷糖(-Gly)、磷酸砷糖(-PO4)、磺酸砷糖(-SO3)和硫酸砷糖(-SO4)。

1.5 砷脂

SADOLIN[40]首次報道了海洋生物中存在脂溶性砷(砷脂),其質(zhì)量分數(shù)為3.0～4.5μg·g-1。藻類以及一些無脊椎動物中也存在砷脂[41-44],但僅在近十年中才揭示了這些化合物的結(jié)構(gòu)和多樣性。砷脂的形態(tài)結(jié)構(gòu)有很多種,包括含砷脂肪酸(AsFA)[45-47]、砷糖磷脂(AsPL)[47-48]、含砷碳氫化合物(AsHC)[48-50]、含砷長鏈醇[51]等。到目前為止,已經(jīng)確定了至少70種砷脂。

2 水生生物中砷形態(tài)的提取方法

提取效率高且不改變砷化學形態(tài)是砷形態(tài)提取的關(guān)鍵。提取效率取決于各種參數(shù),包括樣品基質(zhì)、待提取的形態(tài)、溶劑類型、提取方法、提取時間和提取溫度等[52]。目前常用的方法是單一提取法,以水或甲醇-水混合液為提取劑,這種方法操作簡單,對一些結(jié)構(gòu)簡單的藻類和貝類來說效率較高[53-55]。然而對于一些以脂溶態(tài)砷為主的藻類和魚類,若只用一種提取劑,其形態(tài)提取率較低。例如MURRAY 等[56]采用甲醇-水混合液超聲提取法對普通小球藻進行形態(tài)提取,其提取率僅有11%～27%;JANKONG 等[13]采用甲醇-水混合液振蕩法對淡水魚類等的形態(tài)提取率僅為37%～54%。

連續(xù)分級提取是根據(jù)砷與不同細胞組分的結(jié)合特性,選擇不同的提取劑,將樣品中不同組分結(jié)合的物質(zhì)依序分離出來的過程。常用的水溶態(tài)砷提取劑有水、硝酸溶液,脂溶態(tài)砷提取劑有甲醇(MeOH)、二氯甲烷(DCM),分級提取通常結(jié)合超聲或微波輔助法進行[53,57-58]。以念珠藻為例,MIYASHITA等[8]使用水超聲法對其進行形態(tài)提取,提取率高達93%,但后期只檢測出了As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA 等;XUE等[59]則依次使用水、二氯甲烷-甲醇混合液等多種提取劑連續(xù)振蕩提取,除上述形態(tài)外,還檢出了一種砷糖和兩種脂溶態(tài)砷。這說明相較于單一提取法,連續(xù)分級提取法的提取效率更高,且能鑒定出更多種類的砷形態(tài)。水生生物中不同形態(tài)砷的提取方法見表1。

表1 水生生物中不同形態(tài)砷的提取方法Tab.1 Extraction methods for arsenic species in aquatic organisms

表1 (續(xù))

2.1 水溶態(tài)

水溶態(tài)砷指的是儲存在細胞內(nèi)親水性的砷化物,一般以無機砷為主,也有少量MMA、DMA、AsB、AsC、砷糖等,一般占胞內(nèi)總砷質(zhì)量分數(shù)的12%～58%,在一些貝類中其質(zhì)量分數(shù)可達90%[24,53]。

王亞等[65]采用水-微波輔助提取法提取帶菌鹽藻中不同形態(tài)的砷,即以水為提取劑,采用超聲振蕩充分破碎并提取。該方法常見于藻類的形態(tài)提取,如綠藻、褐藻等[10,14,54,61]。JIA 等[62]采用水、甲醇與水的混合物、硝酸溶液這3種不同的提取劑提取并檢測了4種貝類樣品中不同形態(tài)的砷。結(jié)果顯示:采用微波輔助法,以1%硝酸溶液作為提取劑提取效率較高。然而,硝酸溶液易破壞水溶態(tài)砷中不穩(wěn)定形態(tài)的砷如砷糖等結(jié)構(gòu),導致檢測出的形態(tài)多為簡單的無機砷和甲基砷[59]。

2.2 脂溶態(tài)

脂溶態(tài)砷指細胞內(nèi)的含砷脂質(zhì),包括含砷脂肪酸、含砷碳氫化合物、含砷長鏈醇、砷糖磷脂等,結(jié)構(gòu)復雜且含量低,提取難度較高;藻類和貝類的砷脂含量較低,通常占總砷的4.2%～46%[3,10],而一些魚類中砷脂的質(zhì)量分數(shù)較高,可達62.3%[38]。一般選擇親脂性試劑作為提取劑,如甲醇、二氯甲烷等,可提高效率并確保其結(jié)構(gòu)的完整性。

YU 等[66]使用二氯甲烷與甲醇的混合液對褐藻進行脂溶態(tài)砷提取,通過反相色譜法分離鑒定出了21種砷脂。GLABONJAT 等[67]對提取方式進行了優(yōu)化,以CRM 7405-a羊棲菜為試驗材料,考察了三氯甲烷、二氯甲烷、甲醇、甲苯、丙酮等提取劑。結(jié)果顯示:采用二氯甲烷與甲醇以體積比2∶1組成的混合液為提取劑5 mL 連續(xù)提取,并過硅膠柱以去除色素的方法,提取效果較優(yōu),且回收率較高。

2.3 殘渣態(tài)

經(jīng)過水溶態(tài)和脂溶態(tài)的連續(xù)提取后,剩下的是殘渣態(tài)砷。其含量隨先前的連續(xù)提取效率而變化,該組分主要是無機砷。檢測方法通常是加入定量的硝酸和過氧化氫進行石墨爐或微波消煮,然后進行總量檢測[3]。

3 水生生物中砷形態(tài)的檢測方法

砷形態(tài)的檢測方法包括不同砷化物的分離方法和檢測方法。目前常用的分離方法有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、毛細管電泳法(CE)等[8,68-69]。GC無法使各種砷化物同時被衍生成低沸點化合物,具有局限性[70]。CE 具有高效、快速、抗干擾強等優(yōu)點,但進樣量少,因而制備能力差,且靈敏度較低[71]。而HPLC 分離砷形態(tài)時不需要樣品衍生,可根據(jù)分析形態(tài)的性質(zhì)選擇適當?shù)纳V體系,且速率快、分辨率高、靈敏度高[72]。

常用的檢測方法包括:原子光譜法如原子吸收光譜法(AAS)、原子發(fā)射光譜法(AES)、原子熒光光譜法(AFS)等,質(zhì)譜法如電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)等[31,55-56]。

對砷的檢測來說,AAS和AES靈敏度低、干擾大,而AFS結(jié)構(gòu)簡單、分析成本低、靈敏度高,為降低背景干擾常和氫化物發(fā)生法(HG)聯(lián)用,是近幾年報道較多的砷檢測方法之一。ICP-MS不僅靈敏度高、且能跟蹤多元素同位素信號變化等[73],其檢出限可低至ng·L-1級別,特別對于生物細胞中痕量、超痕量的復雜有機砷化物來說是最可靠的形態(tài)分析方法[74]。

HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)融合了HPLC的高效分離、高靈敏度、高重現(xiàn)性和ICP-MS的低檢出限、寬動態(tài)線性范圍,是目前檢測多形態(tài)砷化物的常用方法之一[74]。

HPLC-ICP-MS 與電噴霧離子源-串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)的聯(lián)用可通過獲得的物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息來鑒定已知、未知的復雜砷化物,已成為砷形態(tài)檢測領(lǐng)域的主流技術(shù)。

水生生物中不同形態(tài)砷的檢測方法見表2。

表2 水生生物中不同形態(tài)砷的檢測方法Tab.2 Detection methods for arsenic species in aquatic organisms

表2 (續(xù))

不同組分砷形態(tài)的檢測方法差異較大。水溶態(tài)砷(包括無機砷、甲基砷、砷甜菜堿、砷糖)的檢測多采用陰/陽離子交換色譜法[3,11,43],以不同含量的磷酸銨鹽、碳酸銨鹽、吡啶等無機試劑作為流動相,根據(jù)砷不同形態(tài)的酸堿性不同,調(diào)節(jié)流動相的酸度、種類及含量即可實現(xiàn)不同形態(tài)的分離及保留時間的調(diào)整。如PéTURSDóTTIR 等[3]采用HPLC-ICPMS/ESI-MS聯(lián)用,以20 mmol·L-1碳酸銨溶液為流動相,通過離子交換色譜法對褐藻進行砷形態(tài)分析,分離并檢測出了DMA 和4種砷糖。脂溶態(tài)砷(砷脂等)則多采用反相色譜法[10,45,51],以甲醇、乙腈等有機試劑為流動相來測定。如AMAYO 等[51]使用RP-HPLC-ICP-MS與ESI-MS聯(lián)用,以含0.1%甲酸的水和甲醇作為流動相,對毛鱗魚的脂溶態(tài)砷含量進行檢測,并確定了砷脂的相關(guān)結(jié)構(gòu)。

目前儀器的相關(guān)參數(shù)設置、接口技術(shù)、基體干擾及標準參考物質(zhì)的匱乏等仍是砷形態(tài)分析技術(shù)需要解決的關(guān)鍵問題。因此,建立更加快速、高效、完整的樣品前處理體系,提高聯(lián)用技術(shù)水平,使各形態(tài)砷在得到較好分離的基礎(chǔ)上滿足超痕量分析的要求,是今后砷形態(tài)分析研究的發(fā)展方向。

4 展望

本文匯總了水生生物中砷的提取和形態(tài)分析方法。隨著本領(lǐng)域的不斷發(fā)展,以往存在的問題,如操作復雜、檢測范圍有限、樣品提取過程中砷化物的結(jié)構(gòu)破壞等,已得到顯著改善。盡管如此,砷的提取與形態(tài)分析技術(shù)仍需不斷完善,且應根據(jù)樣品種類和分析目的進行開發(fā)。隨著本領(lǐng)域相關(guān)分析測定技術(shù)的進一步優(yōu)化,未來將有更多新的含砷化合物得到鑒定,這將深入推進砷的生物地球化學循環(huán)研究,為揭示砷化合物的生物合成及其在食物網(wǎng)內(nèi)的傳遞機制奠定堅實基礎(chǔ)。