(烏蘭察布醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,烏蘭察布 012000)

黃芩又名山茶根、土金茶根,為唇形科黃芩屬多年生草本植物,在我國北方各省均有種植。黃芩提取物為黃芩干燥根經(jīng)加工制成的淡黃色粉末,具有清熱燥濕、瀉火解毒、安胎、止血等功效[1-4],臨床上用于治療上呼吸道感染、肺熱咳嗽、肝火頭痛、目赤腫痛、濕熱黃疸、胎動(dòng)不安、高血壓、癰腫癤瘡等癥[5-6],其具有藥理活性的化學(xué)成分主要為黃芩素、黃芩苷、褪黑素、5-羥色胺、漢黃芩苷、野黃芩苷等[7-9]。

目前黃芩的評(píng)價(jià)主要是通過其藥理活性化學(xué)成分測定或者色譜指紋圖譜等進(jìn)行品種鑒別、產(chǎn)地來源分析,測定方法包括薄層色譜法[10]、液相色譜法[2,9,11-12]和液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[8,13-14],而中國藥典(2015年版)中黃芩提取物定量指標(biāo)成分僅有黃芩苷一項(xiàng),不能完全反映黃芩提取物的整體質(zhì)量。對不同來源的黃芩提取物進(jìn)行有效成分的定性定量鑒別已成為規(guī)范黃芩提取物的質(zhì)量控制并保證其臨床用藥安全性、有效性的重要途徑。

本工作針對7份不同產(chǎn)地的黃芩提取物,采用甲醇超聲提取,經(jīng)ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱分離,質(zhì)譜檢測器測定,建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)測定黃芩提取物中黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷、野黃芩苷等4種黃酮類成分的分析方法,旨在為黃芩提取物的質(zhì)量控制及其藥理活性化學(xué)成分研究提供測定方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY UPLC/Xevo TQ MS型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀;Milli-Q 型超純水器;JP-060型超聲波清洗機(jī);5415D 型高速冷凍離心機(jī);Syncore Polyvap型多樣品平行蒸發(fā)儀。

4種黃酮類成分的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1 000 mg·L-1,稱取黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷、野黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各50.0 mg,分別置于50 mL容量瓶中,用適量甲醇溶解,并用甲醇定容至50.0 mL。

黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷、野黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均為色譜純;其余試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱(2.1 mm×150 mm,1.8μm),柱溫35 ℃;流量0.2 mL·min-1;進(jìn)樣體積10μL。流動(dòng)相:A 為0.01%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)氨水,B 為乙腈。梯度洗脫程序:0～4.0 min 時(shí),A 由80%降至20%;4.0～6.0 min時(shí),A 由20%降至5%,保持2.5 min;8.5～12.0 min時(shí),A 由5%升至80%,保持3 min。

2)質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI),負(fù)離子模式;離子源溫度150 ℃,脫溶劑溫度350 ℃;毛細(xì)管電壓3.5 kV;碰撞氣為氬氣,流量0.15 mL·min-1;錐孔氣為氮?dú)?流量50 L·h-1;脫溶劑氣為氮?dú)?流量600 L·h-1;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。其余質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中,“*”為定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗(yàn)方法

7份不同產(chǎn)地(山東沂蒙山區(qū)、甘肅慶陽、內(nèi)蒙古赤峰、吉林延邊、河北承德、山西臨汾、陜西渭南)的黃芩提取物,購自某公司。

稱取黃芩提取物粉末樣品約0.1 g置于50 mL離心管中,加入4 mL水,渦旋30 s,再加入6 mL甲醇,渦旋混勻后超聲提取(超聲功率300 W,超聲頻率28 kHz)30 min,以12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min,收集上清液。殘?jiān)尤? mL水,渦旋30 s,再加入6 mL甲醇,渦旋混勻后超聲提取(超聲功率300 W,超聲頻率28 kHz)30 min,以12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min,合并上清液,用水定容至50.0 mL,過0.22μm 微孔濾膜后按儀器工作條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜行為

按儀器工作條件對4種黃酮類成分的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,色譜圖見圖1。

4種黃酮類成分的二級(jí)質(zhì)譜圖見圖2。

圖1 4種黃酮類成分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.1 TIC chromatogram of mixed standard solution of 4 flavonoids

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

采用蠕動(dòng)泵將1.0 mg·L-1的4種黃酮類成分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以1.0μL·min-1流量連續(xù)注入ESI中,分別采用正離子模式和負(fù)離子模式對其進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析,得到準(zhǔn)分子離子峰(母離子),再對各準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析,得到碎片離子峰(子離子)。結(jié)果表明:4種黃酮類成分在正離子模式和負(fù)離子模式下均有響應(yīng),但在負(fù)離子模式下產(chǎn)生的[M-H]-峰質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度較強(qiáng),可能是由于這4種黃酮類成分結(jié)構(gòu)中的羥基在負(fù)離子模式下易失去H 而形成穩(wěn)定的[M-H]-峰。采用二級(jí)質(zhì)譜掃描模式對準(zhǔn)分子離子[M-H]-峰進(jìn)行子離子掃描,優(yōu)化碰撞電壓和錐孔電壓,確定各化合物的二級(jí)質(zhì)譜圖,并使各碎片離子的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最高,選取豐度較大的兩個(gè)碎片離子作為定性離子和定量離子。試驗(yàn)選擇的質(zhì)譜條件見1.2節(jié)。

2.3 色譜柱的選擇

試驗(yàn)考察了ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱、UPLC BEH C18色譜柱、UPLC HSS C18色譜柱、UPLC HSS C18SB 色譜柱、UPLC BEH HILIC 色譜柱等5種超高效液相色譜柱對黃芩提取物中4種黃酮類成分分離情況的影響。結(jié)果表明:當(dāng)采用ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱時(shí),4 種黃酮類成分完全分離,保留時(shí)間(3.16～10.47 min)適中,且各化合物的色譜峰峰形尖銳對稱。試驗(yàn)選用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱。

2.4 流動(dòng)相的選擇

圖2 4種黃酮類成分的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 MS2 spectra of 4 flavonoids

試驗(yàn)考察了甲醇、乙腈、水、0.01%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液、0.1%甲酸溶液、0.01%氨水、0.1%氨水等組合為不同流動(dòng)相體系時(shí)對黃芩提取物中4種黃酮類成分的色譜分離效果和質(zhì)譜離子化效率的影響。結(jié)果表明:乙腈-水體系作為流動(dòng)相時(shí),4種黃酮類成分的質(zhì)譜響應(yīng)優(yōu)于甲醇-水體系作為流動(dòng)相時(shí)的質(zhì)譜響應(yīng);當(dāng)流動(dòng)相體系的pH 小于7時(shí),在負(fù)離子模式下易產(chǎn)生[M＋H]＋峰和[M＋Na]＋峰,其中黃芩素離子化效率和質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度較高,其他3種化合物的離子化效率和質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度不高;當(dāng)流動(dòng)相體系的pH 大于7時(shí),在負(fù)離子模式下易產(chǎn)生[M-H]-峰,尤其是采用0.01%氨水-乙腈體系作為流動(dòng)相時(shí),經(jīng)梯度洗脫,4種黃酮類成分得到了良好的色譜分離效果和質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度,色譜圖中基線平穩(wěn),峰寬較窄,峰形尖銳對稱。試驗(yàn)選擇流動(dòng)相為0.01%氨水-乙腈體系。

2.5 提取溶劑的選擇

水分含量較低的樣品在進(jìn)行分析時(shí),通常在樣品前處理時(shí)加入一定量水,以提高后續(xù)的提取效率。試驗(yàn)考察了水的加入量對黃芩提取物中4種黃酮類成分提取效果的影響。結(jié)果表明:水加入量不大于4 mL時(shí),4種黃酮類成分的提取率隨水加入量的增大而增大;水加入量大于4 mL 時(shí),4種黃酮類成分的提取率呈下降趨勢。試驗(yàn)選擇水加入量為4 mL。

試驗(yàn)考察了提取溶劑依次為甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷時(shí)對黃芩提取物中4種黃酮類成分提取效果的影響。結(jié)果表明:4種黃酮類成分可溶于甲醇、乙醇、乙腈和丙酮,微溶于異丙醇、乙酸乙酯和二氯甲烷;4種黃酮類成分的提取率由大到小對應(yīng)的提取溶劑依次為乙腈(98.4%)、甲醇(97.8%)、乙醇(94.3%)、丙酮(89.8%)、異丙醇(76.4%)、乙酸乙酯(62.3%)、二氯甲烷(57.1%),其中乙腈對4種黃酮類成分的提取率最高,但乙腈提取液中雜質(zhì)較多,而甲醇對4種黃酮類成分的提取率為96.2%～102%,平均值為97.8%,甲醇提取液中雜質(zhì)較少。試驗(yàn)選擇提取溶劑為甲醇。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)

為考察黃芩提取物中目標(biāo)物以外的基質(zhì)對4種黃酮類成分提取效果的影響,在乙腈和空白黃芩提取物這兩種基質(zhì)中分別加入5.0,100.0,250.0μg·kg-1的4種黃酮類成分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用標(biāo)準(zhǔn)加入法評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)(即M＝S2/S1×100%,其中:M為基質(zhì)效應(yīng),S1為乙腈中目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)值,S2為黃芩提取物中目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)值。若90%＜M＜110%,表明不存在基質(zhì)效應(yīng);若M＜90%或M＞110%時(shí),表明存在基質(zhì)減弱效應(yīng)或基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng))[15]?；|(zhì)效應(yīng)見表2。

由表2可知:M為92.7%～98.7%,即不存在基質(zhì)效應(yīng)。

表2 基質(zhì)效應(yīng)Tab.2 Matrix effect %

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

分別移取1 000 mg·L-1的4種黃酮類成分標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量,用空白黃芩提取液為基質(zhì)配制5.0,10.0,25.0,50.0,100.0μg·L-1的4種黃酮類成分的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按儀器工作條件對上述基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定,以4種黃酮類成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的質(zhì)譜響應(yīng)值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:4種黃酮類成分的質(zhì)量濃度在5.0～500.0μg·L-1內(nèi)與其對應(yīng)的質(zhì)譜響應(yīng)值呈線性關(guān)系,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。

根據(jù)3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限(3S/N),根據(jù)10倍信噪比計(jì)算方法的測定下限(10S/N),結(jié)果見表3。

由表3可知:檢出限為0.3～1.5μg·kg-1,測定下限為1.0～5.0μg·kg-1。

2.8 精密度和回收試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對空白黃芩提取物樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),計(jì)算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表4。

由表4可知:回收率為91.1%～99.1%,RSD 為2.0%～4.1%。

表3 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和測定下限Tab.3 Linear regression equations,correlation coefficients,detection limits and lower limits of determination

表4 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.9 樣品分析

按試驗(yàn)方法對7份不同產(chǎn)地的黃芩提取物樣品進(jìn)行分析,結(jié)果見表5。

表5 樣品分析結(jié)果Tab.5 Analytical results of the samples mg·kg-1

由表5可知:不同產(chǎn)地的黃芩中均含有黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷、野黃芩苷,但其含量存在差異,這與文獻(xiàn)[1]、文獻(xiàn)[8]報(bào)道較為一致;其中黃芩苷含量差異較大,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為76.3～107.8 mg·kg-1,這種顯著性差異可能是由于黃芩品種、生長環(huán)境(氣溫、海拔、降雨量、日照等)、生長年限、貯藏時(shí)間及種植技術(shù)等差異引起的不同產(chǎn)地黃芩提取物之間相同的化學(xué)成分含量不同[16]。因此,利用黃芩提取物中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、野黃芩苷含量不同的特點(diǎn),本方法可更加全面有效地為黃芩提取物質(zhì)量控制提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

本工作采用UHPLC-MS/MS測定黃芩提取物中黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷、野黃芩苷的含量。本方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度好等特點(diǎn)。