李 環(huán)， 曲振廷，錢鴻昊，徐 晗，曲 莉，張 晶，王洪艷，徐小磊

(1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生教研室，吉林 吉林 132001；2.吉林省吉林中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院兒科，吉林 吉林 132012)

男性不育為男科病中常見病和多發(fā)病。與十年前比較，男性精子質(zhì)量和數(shù)量均有較大幅度下降，生育能力低下及不育的患者日益增多[1]。目前，西醫(yī)對(duì)不育癥治療的臨床效果并不理想，因此開發(fā)新的更安全和更有效的中藥制劑對(duì)臨床男性不育癥患者進(jìn)行治療具有重要意義。

明朝醫(yī)藥學(xué)家李時(shí)珍認(rèn)為“人參治男婦一切虛癥”。 服用人參粗提物后可以提高精子數(shù)量和精子活力，可以促進(jìn)下丘腦-垂體-睪丸軸發(fā)揮作用[2-3]。人參皂苷 Rg1(ginsenoside Rg1)和人參皂苷 Rg3(ginsenoside Rg3)是人參中最具活性的成分，已有研究[4]表明：人參皂苷Rg1能明顯逆轉(zhuǎn)棉酚所致的精子數(shù)量降低，增強(qiáng)受損傷的精子活力，提高生精能力。但有關(guān)人參皂苷Rg1的生精作用機(jī)制目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。人參皂苷Rg3能改善糖尿病大鼠抗鏈脲霉素的勃起功能障礙[5]，并能通過下調(diào)miR-26a保護(hù)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞[6]。為了能取得較好的不育癥防治的效果,多藥聯(lián)用是現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)的新手段。目前，人參皂苷Rg1聯(lián)合人參皂苷Rg3 對(duì)生殖功能損傷的改善作用及相關(guān)機(jī)制尚未見報(bào)道。

鄰苯二甲酸二丁酯(dinbutyl phthalate,DBP)是公認(rèn)的環(huán)境污染物，文獻(xiàn)[7]報(bào)道及本課題組前期研究[8]表明：DBP具有明顯的生殖毒性，可引起睪丸質(zhì)量減輕、生精小管萎縮和生精功能受損。因此，本研究采用 DBP 灌胃制備雄性生殖功能損傷小鼠模型[9]，同時(shí)給予人參皂苷 Rg1和人參皂苷 Rg3皮下注射，觀察小鼠精子質(zhì)量、睪丸組織病理學(xué)、血清性激素水平及睪丸組織中縫隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)蛋白表達(dá)的變化，探討人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3 聯(lián)合應(yīng)用對(duì)雄性生殖功能損傷小鼠生殖功能的改善作用及相關(guān)機(jī)制，為探索和開發(fā)天然、高效及安全的生精藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器清潔級(jí)C57BL/6雄性小鼠，6周齡，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(吉)2010-0005。人參皂苷Rg1和Rg3(R)由吉林大學(xué)藥學(xué)院提供。DBP購自美國 Santa Cruz Biotechnology 公司，蘇木素和伊紅購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，免疫熒光劑盒由武漢博士德生物公司提供，小鼠血清黃體生成素(luteinizing hormone，LH) 、卵泡刺激素 (follicle-stimulating hormone， FSH)和睪酮(testosterone，T)試劑盒由上海江來生物公司提供，Cx43兔多克隆抗體購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。WLJY-9000 彩色精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)購自北京偉力公司，DP20型正置熒光顯微鏡購于日本東京奧林巴斯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、造模和給藥采用 DBP 灌胃方法制作雄性生殖功能損傷小鼠模型[9]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)[8]結(jié)果顯示：400 mg·kg-1DBP灌胃給藥35 d可以成功制備雄性生殖功能損傷小鼠模型，故此方法用于本次模型制備。本研究選用28只清潔級(jí)6周齡C57BL/6雄性小鼠，適應(yīng)環(huán)境 1 周后，按2×2 析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)并依據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組(400 mg·kg-1DBP)、人參皂苷Rg1+DBP組(20 mg·kg-1人參皂苷 Rg1，400 mg·kg-1DBP)、人參皂苷Rg3+DBP組(20 mg·kg-1人參皂苷Rg3，400 mg·kg-1DBP)和聯(lián)合組(20 mg·kg-1人參皂苷Rg1，20 mg·kg-1人參皂苷Rg3，400 mg·kg-1DBP)，每組 7只。DBP溶于玉米油于每天上午8點(diǎn)灌胃給藥，人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3溶于生理鹽水于每天下午2點(diǎn)皮下注射給藥，每天DBP灌胃給藥和 人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg3皮下注射給藥各1次。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度(55±15)%，12 h/12 h明/暗交替；各組小鼠均自由進(jìn)食和飲水，實(shí)驗(yàn)期為35 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組小鼠眼球取血，室溫靜置后， 2 500 r·min-1離心10 min，取血清，4℃冰箱保存樣品；脊髓脫臼處死，取睪丸稱質(zhì)量并計(jì)算睪丸臟器系數(shù)，睪丸臟器系數(shù)= 睪丸質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)。

1.3 小鼠精子質(zhì)量分析精子濾液制備：將雙側(cè)附睪放入平皿中，剪碎附睪組織，在預(yù)熱的生理鹽水中 37℃ 溫育1～2 min，制備精子混懸液，然后滴加到預(yù)溫的精子計(jì)數(shù)板上，應(yīng)用WLJY-9000型精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)各組小鼠的精子密度、精子活力和總畸形率。取4個(gè)視野，于2 min內(nèi)完成檢測(cè)。

1.4 小鼠睪丸組織病理學(xué)檢查取小鼠一側(cè)睪丸(左)，4% 多聚甲醛固定，將固定好的睪丸組織常規(guī)脫水、浸蠟、包埋和切片處理，常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下拍照,觀察小鼠睪丸組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.5 ELISA法檢測(cè)小鼠血清中性激素水平采用ELISA法測(cè)定各組小鼠血清中T、FSH和LH水平，所有的操作均按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.6 免疫熒光法檢測(cè)小鼠睪丸組織中Cx43蛋白表達(dá)水平將固定的睪丸組織病理切片經(jīng)脫蠟至水、酶法修復(fù)抗原、血清封閉非特異性抗原(室溫孵育10 min)，滴加一抗(用5%BSA 配制，濃度為 1∶100)于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。第2天取出濕盒后室溫復(fù)溫1 h，滴加生物素化二抗IgG(1∶100 稀釋)于濕盒內(nèi)，37℃孵育30 min；滴加DyLight 488-SABC(1∶200 稀釋)，37℃避光孵育30 min。采用含有防熒光淬滅的甘油封片，1 h內(nèi)完成采集圖像(熒光顯微鏡)，在每個(gè)切片中選取總面積，使用Image J軟件分析熒光強(qiáng)度，以平均熒光強(qiáng)度表示Cx43蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠睪丸臟器系數(shù)與模型組比較， 聯(lián)合組小鼠睪丸臟器系數(shù)明顯升高(t=1.34，P= 0.034)，人參皂苷Rg1+DBP組和人參皂苷Rg3+DBP組小鼠睪丸臟器系數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠睪丸臟器系數(shù)

2.2 各組小鼠精子質(zhì)量分析與模型組比較，人參皂苷Rg1+DBP組、人參皂苷Rg3組+DBP和聯(lián)合組小鼠精子密度和精子活力均明顯升高(P<0.01)，精子總畸形率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠精子密度、精子活力和精子總畸形率

聯(lián)合作用的析因分析結(jié)果顯示：人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3聯(lián)合應(yīng)用與小鼠精子活力存在交互作用 (F=6.704,P=0.016)。由圖 1可見： 2條量-效曲線隨劑量增加而遠(yuǎn)離，提示人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3聯(lián)合應(yīng)用可使小鼠精子活力升高，具有協(xié)同作用。

2.3 各組小鼠睪丸組織病理形態(tài)表現(xiàn)小鼠睪丸組織經(jīng)HE 染色后，光學(xué)顯微鏡400 倍下觀察生精上皮細(xì)胞層次、形態(tài)結(jié)構(gòu)、脫落細(xì)胞和管腔受損程度。模型組小鼠睪丸組織生精上皮較薄，生精上皮細(xì)胞層次紊亂，甚至缺失，數(shù)量明顯減少，管腔中生精細(xì)胞嚴(yán)重脫落，而且管腔內(nèi)精子數(shù)量稀少；與模型組比較， 人參皂苷Rg1+DBP組和人參皂苷Rg3+DBP組小鼠睪丸組織生精上皮變厚，生精上皮細(xì)胞排列較規(guī)則，數(shù)量有所增加，管腔中脫落細(xì)胞較少，支持細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，腔內(nèi)精子數(shù)量增多；聯(lián)合組小鼠睪丸組織生精上皮較厚，生精上皮結(jié)構(gòu)完整，各級(jí)生精細(xì)胞排列規(guī)則且數(shù)量較多，曲細(xì)精管之間排列緊密，腔內(nèi)精子豐富，在生精小管之間均勻分布間質(zhì)細(xì)胞。見圖2(插頁二)。

圖1 人參皂苷Rg1與人參皂苷Rg3聯(lián)合作用后小鼠精子活力分析

2.4 各組小鼠血清中性激素水平與模型組比較，人參皂苷Rg1+DBP組、人參皂苷Rg3組+DBP和聯(lián)合組小鼠血清中T和LH水平明顯升高(P<0.01)，F(xiàn)SH水平明顯降低(P<0.01)。見表3。

表3 各組小鼠血清中性激素水平

聯(lián)合作用的析因分析結(jié)果顯示： 人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3聯(lián)合應(yīng)用與小鼠血清中T水平存在明顯交互作用 (F=4.912,P=0.036) ，而與LH和FSH水平交互作用不明顯 (P>0.05)。由圖 3可見： 2條量-效曲線隨藥物劑量增加而遠(yuǎn)離，提示人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3聯(lián)合應(yīng)用可使小鼠血清中T水平升高，具有協(xié)同作用。

2.5 各組小鼠睪丸組織中Cx43蛋白表達(dá)水平

與模型組(0.081 4±0.013 5)比較，人參皂苷Rg1+DBP組、人參皂苷Rg3+DBP組和聯(lián)合組小鼠睪丸組織中Cx43蛋白表達(dá)水平(0.108 6±0.006 9、0.122 9±0.025 0和0.187 1±0.025 6)均明顯升高(P<0.05)。見圖4(插頁二)。

圖3 人參皂苷Rg1與人參皂苷Rg3聯(lián)合作用后小鼠血清中T水平分析

聯(lián)合作用的析因分析結(jié)果顯示：2條量-效曲線隨藥物劑量增加而遠(yuǎn)離(F=6.937,P= 0.018)，提示人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg3聯(lián)合應(yīng)用可增加小鼠睪丸組織中Cx43蛋白表達(dá)水平，具有協(xié)同作用。見圖5。

圖5 人參皂苷Rg1與人參皂苷Rg3聯(lián)合作用后小鼠睪丸組織中Cx43蛋白表達(dá)水平

3 討 論

全球男性不育發(fā)生率呈明顯上升趨勢(shì)，其中70%～90%是精子出現(xiàn)問題，表現(xiàn)為精子生成障礙、精子缺乏和精子活力不足。DBP作為一種重要工業(yè)原料，廣泛應(yīng)用于各種生產(chǎn)和生活中，如增塑劑、橡膠、膠黏劑和香料等。人體通過空氣、水體和土壤等接觸DBP，從而干擾生殖系統(tǒng)內(nèi)分泌激素水平，使血清T睪酮水平降低和 FSH 水平升高[10]，引發(fā)睪丸組織病理改變，表現(xiàn)為生精細(xì)胞脫落、生精小管損傷、生精細(xì)胞和支持細(xì)胞分離[11]。

在不育癥的治療中，現(xiàn)有的很多藥物都有明顯的不良反應(yīng)，輔助生殖技術(shù)的使用也可能會(huì)增加?jì)雰撼錾毕莺蛢和┌Y的風(fēng)險(xiǎn)。因此，尋求安全而有效的自然療法來提高生育能力成為大多數(shù)受不孕影響的人的主要選擇。被譽(yù)為“中草藥之王”的人參是治療不孕不育的常選藥物[12]。人參中的有效成份包括皂苷類、小分子肽、多肽和多糖等，其中人參皂苷是人參中最重要的有效成分。目前對(duì)人參皂苷的研究主要集中在其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和血液系統(tǒng)等的保護(hù)作用及抗腫瘤的功效方面。近年來研究[4]顯示：人參皂苷能夠誘導(dǎo)生精、提高精子活力和數(shù)量及促進(jìn)精子獲能。人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3在誘導(dǎo)生精、提高精子活力和數(shù)量的效果明顯，人參皂苷Rg3作為蛋白質(zhì)能量合成促進(jìn)因子，作用于細(xì)胞生殖周期的G2期。藥理學(xué)研究[13]證明：人參對(duì)生殖功能的2個(gè)主要方面，即性功能和生育能力都有較強(qiáng)影響。下丘腦-垂體-睪丸軸是調(diào)節(jié)睪丸功能的主要內(nèi)分泌反饋系統(tǒng)。激素水平過高或過低都不利于精子的形成，如LH和FSH等能夠調(diào)節(jié)T的合成分泌，影響精子的質(zhì)量。研究[14]表明：人參皂苷及人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1單體能刺激體外培養(yǎng)的垂體前葉細(xì)胞分泌FSH和LH。人參皂苷Rg1、人參皂苷Rh1和人參皂苷Ppt等對(duì)棉酚所致大鼠睪丸組織的結(jié)構(gòu)損傷有一定的修復(fù)作用，使生精組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，從而對(duì)生精障礙的治療起到一定作用[5]。人參皂苷還能通過抑制大鼠精子的凋亡來提高精子質(zhì)量。

睪丸質(zhì)量和臟器系數(shù)等指標(biāo)可反映生殖器官的發(fā)育情況及損害情況。本研究結(jié)果顯示：人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3 聯(lián)合應(yīng)用可使小鼠睪丸臟器系數(shù)明顯升高，單獨(dú)應(yīng)用人參皂苷Rg1或人參皂苷Rg3睪丸臟器系數(shù)變化不明顯；精子質(zhì)量分析，與模型組比較，人參皂苷Rg1+DBP組、人參皂苷Rg3+DBP組和聯(lián)合組小鼠精子密度、精子活力均升高，而各組小鼠精子總畸形率差異不明顯；人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3 聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于精子活力存在交互作用，提示人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3 聯(lián)合使用對(duì)于改善小鼠精子質(zhì)量具有協(xié)同作用；小鼠睪丸組織HE染色后觀察，模型組小鼠睪丸組織損傷嚴(yán)重，表現(xiàn)為生精上皮變薄且細(xì)胞層次紊亂，管腔中有生精細(xì)胞脫落，人參皂苷Rg1+DBP組、人參皂苷Rg3+DBP組和聯(lián)合組小鼠睪丸組織的損傷減輕，其中聯(lián)合組大鼠睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)最好。本研究結(jié)果表明：人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用均能抑制DBP所致的小鼠睪丸組織損傷，與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致。

DBP可通過破壞男性內(nèi)分泌系統(tǒng)而間接損害睪丸，而DBP毒性作用的直接靶點(diǎn)可能是睪丸中的細(xì)胞[16-17]。本研究中血清性激素檢測(cè)結(jié)果顯示：與模型組比較，人參皂苷Rg1+DBP組、人參皂苷Rg3+DBP組和聯(lián)合組小鼠血清T和LH水平均升高，F(xiàn)SH水平降低，聯(lián)合作用的析因分析結(jié)果顯示人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3具有協(xié)同作用，提示人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3聯(lián)合應(yīng)用可最大程度地減輕DBP誘導(dǎo)的小鼠內(nèi)分泌系統(tǒng)損傷，從而保護(hù)小鼠睪丸組織。

大量研究[18-19]表明：睪丸內(nèi)支持細(xì)胞-支持細(xì)胞間連接或者支持細(xì)胞-生殖細(xì)胞間細(xì)胞連接是內(nèi)分泌干擾物作用于生殖系統(tǒng)的靶點(diǎn)，其作用于支持細(xì)胞的緊密連接，破壞細(xì)胞骨架組件；作用于細(xì)胞錨定連接蛋白，使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分布異常。睪丸和雄性生殖道中，作為相鄰細(xì)胞間的重要的細(xì)胞連接-縫隙連接(gap junction,GJ)廣泛存在。GJ是一種膜通道結(jié)構(gòu)，對(duì)睪丸發(fā)育以及對(duì)精子發(fā)生具有重要意義[20]。如果睪丸支持細(xì)胞和血液睪丸屏障(blood-testis barrier, BTB)的完整性破壞，就可以導(dǎo)致精子生成出現(xiàn)障礙。有研究[21-22]顯示：BTB 的細(xì)胞連續(xù)重塑和細(xì)胞連接動(dòng)力必須通過GJ的緊密協(xié)調(diào)和調(diào)控，說明GJ在大鼠睪丸中維持BTB功能的重要性。在睪丸中構(gòu)建GJ 細(xì)胞間縫隙通道[23]的十余種連接蛋白中， Cx43具有重要的生理功能，支持細(xì)胞特異性缺失Cx43會(huì)導(dǎo)致小鼠不育癥[16]。Cx43具有重要和獨(dú)特的生理功能，同時(shí)也可能是環(huán)境毒物誘導(dǎo)生殖功能障礙的良好靶標(biāo)[24-25]。本課題組研究結(jié)果[26-27]也顯示：DBP誘導(dǎo)的支持細(xì)胞損傷與Cx43的下調(diào)有密切關(guān)聯(lián)，可擾亂肌動(dòng)蛋白和波性蛋白等相關(guān)蛋白表達(dá)，破壞間質(zhì)細(xì)胞GJ通透性屏障功能，進(jìn)而影響生精功能。本研究結(jié)果顯示：人參皂苷Rg1+DBP組、人參皂苷Rg3+DBP組和聯(lián)合組小鼠睪丸組織中Cx43蛋白表達(dá)水平均高于模型組，聯(lián)合作用的析因分析結(jié)果表明人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3聯(lián)合應(yīng)用可增加小鼠睪丸組織中Cx43蛋白表達(dá)，兩者具有協(xié)同作用。

綜上所述， 人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3可通過上調(diào)Cx43表達(dá)發(fā)揮生精保護(hù)作用，改善DBP所致的生殖功能損傷。人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3聯(lián)合應(yīng)用可最大限度地減輕DBP所致的小鼠精子質(zhì)量下降和小鼠睪丸組織損傷，通過調(diào)節(jié)生殖激素的水平來發(fā)揮保護(hù)生殖功能的作用，其機(jī)制可能與上調(diào)Cx43表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果為人參皂苷的進(jìn)一步開發(fā)和合理利用奠定了理論基礎(chǔ)，但人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3生精作用的確切機(jī)制尚未明確，需從分子生物學(xué)水平繼續(xù)探討。