趙麗萍，黃術(shù)兵，張博枰，周芝蘭，賈雪冰，孫孟菲，喬晨萌，陳 雪，申延琴，崔 春

(江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院神經(jīng)退行和損傷研究室，江蘇 無錫214122)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是一種嚴(yán)重致殘的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，患者常表現(xiàn)為四肢癱、截癱[1-2]和神經(jīng)性腸功能障礙(便秘和大便失禁)等[3]。在大鼠SCI模型中也可見腸道炎癥、結(jié)腸神經(jīng)元密度降低[4]和腸道菌群失調(diào)[5]等腸道表現(xiàn)，SCI前誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)可阻礙運動功能的恢復(fù)[6]。因此，SCI引起的腸道病理表現(xiàn)以及腸道菌群對SCI后運動功能恢復(fù)和患者生存質(zhì)量的影響不容忽視。與哺乳動物比較，成年斑馬魚有極強的神經(jīng)再生能力，在脊髓完全橫斷后6周即可完全恢復(fù)運動能力，是研究SCI的理想動物模型[7]。目前，SCI對斑馬魚腸道炎癥和腸道菌群的影響尚無報道。鼠李糖乳桿菌GG株(LactobacillusrhamnosusGG, LGG)是一種黏著率高、定植力強的益生菌，研究[8]顯示：LGG攝入可減輕艾滋病病毒感染者的腸道炎癥。但 LGG攝入對斑馬魚SCI后腸道炎癥和腸道菌群的影響及其機制目前尚無相關(guān)報道。本研究探討了斑馬魚SCI后腸道炎癥的發(fā)生和LGG對斑馬魚腸道炎癥的抑制作用，并從腸屏障和腸道致病菌2個方面闡述了LGG抑制腸道炎癥的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器斑馬魚購于上海佳譽水族館，斑馬魚飼料購于上海吉熒生物公司。LGG凍干粉購于臺灣亞芯公司，MRS瓊脂購于青島海博生物公司，三卡因(MS-222)購于美國Sigma公司， RT-qPCR引物購于上海Invitrogen 公司，組織RNA提取試劑盒(R6311-02)購于美國BIOMIGA公司，反轉(zhuǎn)錄試劑(RR036A)和熒光定量PCR試劑盒(RR820A)購于日本TaKaRa公司。90 mm培養(yǎng)皿購于美國Thermo公司，熒光定量PCR儀(Light Cycler 480Ⅱ)購于美國Roche公司，厭氧培養(yǎng)箱(AW200SG)購于英國Electrotek公司，斑馬魚飼養(yǎng)系統(tǒng)購于上海海圣公司，體視顯微鏡(SMZ-140)購于美國Motic公司，手術(shù)器械購于美國WPI公司。

1.2 實驗動物飼養(yǎng)條件成年野生型斑馬魚，4～6月齡，雌雄不限, 飼養(yǎng)在實驗室室內(nèi)水循環(huán)系統(tǒng)中，水溫控制在(28±1)℃，pH值為7.2～7.4，光照周期為14 h光照和10 h黑暗(光照時間為8:00至22:00)，每天投喂飼料2次(8:30和17:30各1次)，每次投喂的飼料量是斑馬魚體質(zhì)量的1.5%～2.0%。動物實驗過程中涉及的所有操作步驟均遵守江南大學(xué)動物福利和倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。

1.3 實驗動物分組將14條正常斑馬魚隨機分為正常飲食組和LGG飲食組(LGG組)，每組7條，喂養(yǎng)21 d后取腸道組織。將48條手術(shù)斑馬魚隨機分為假手術(shù) + 正常飲食組、假手術(shù) + LGG組、SCI + 正常飲食組和SCI + LGG組，每組12條。手術(shù)后連續(xù)喂養(yǎng)25 d后取腸道組織用于RT-qPCR法檢測(每組各6條魚)，喂養(yǎng)7和28 d后斑馬魚取腸道組織用于腸道菌群高通量16s rRNA測序(每組各3條魚)。正常飲食組斑馬魚喂食商品化飼料；LGG組斑馬魚喂食添加LGG凍干粉的飼料。

1.4 益生菌飼料的制備首先將商品化飼料研磨，再將LGG凍干粉的菌懸液噴灑到飼料上(即LGG飼料)，混勻后在20℃無菌條件下風(fēng)干12 h，-20℃保存[9]。正常飲食組飼料不添加LGG，其他流程均與LGG飼料相同。采用平板菌落計數(shù)法檢測飼料中LGG的濃度，將LGG飼料和正常飲食組飼料樣品分別接種到MRS培養(yǎng)基后置于37℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)48 h后計數(shù)。每克飼料中菌落總數(shù)(CFU·g-1)=(同一稀釋度在3個平皿上形成菌落的平均數(shù)×稀釋倍數(shù))/取樣體積。

1.5 斑馬魚SCI模型制備將斑馬魚置入0.033%的MS-222中麻醉，待腮律動放緩并停止游動時取出，放在體視顯微鏡下的冰槽中，在鰓蓋和背鰭連線的中點處暴露脊髓，然后用精細(xì)彈簧剪刀將脊髓一次性剪斷(SCI組)，SCI后斑馬魚放入含抗真菌劑的水杯中單獨飼養(yǎng)。對照組為脊髓假手術(shù)斑馬魚(假手術(shù)組)，即只剪開皮膚和肌肉，但不切斷脊髓。

1.6 RT-qPCR法檢測斑馬魚腸道組織中腸道屏障相關(guān)分子和炎癥相關(guān)分子mRNA表達水平實驗結(jié)束后，取各組斑馬魚腸道組織，按照Biomiga EZgeneTMTissue RNA Kit的說明提取腸道總RNA并測定濃度，然后按PrimeScriptTMRT Master Mix進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，以該cDNA為模板，按表1中的引物序列合成相應(yīng)引物，使用 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ進行RT-qPCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95℃、1 min；95℃、15 s，55℃、15 s，72℃、45 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算斑馬魚腸道組織中腸道屏障相關(guān)分子[β防御素樣肽-1(defensin beta-like 1, DEFBL1)、 緊密連接蛋白2a(tight junction protein 2a, TJP2a)、黏液素2.1 (mucin 2.1, MUC2.1)和黏液素5.3(mucin 5.3, MUC5.3)]和炎癥相關(guān)分子[腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、Toll樣受體2(Toll-like receptor 2, TLR-2)及白細(xì)胞介素6(interleukin-6, IL-6)]mRNA表達水平。

1.7 斑馬魚腸道菌群高通量16S rRNA測序分別給予正常飲食和LGG飲食的假手術(shù)組和SCI組斑馬魚喂養(yǎng)7 d和28 d后，取腸道組織及內(nèi)容物干冰條件下送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，按QIAamp 96 PowerFecal QIAcube HT Kit(5)中的說明提取斑馬魚腸道中的DNA，對樣品進行PCR 擴增及上機測序分析，通過引物343F(TACGGRAGGCAGCAG) 和798R(AGGGTATCTAATCCT) 擴增樣品16S rRNA的V3-V4 區(qū)。提取擴增后的高質(zhì)量序列，通過質(zhì)量控制過濾去除不符合要求的序列，對得到的優(yōu)質(zhì)序列采用操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)進行分類，對各樣本中分類到該 OTU 的序列數(shù)(tags)進行統(tǒng)計，獲得斑馬魚腸道組織中致病菌屬的豐度。

表1 PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 飼料中LGG濃度測定為了確定LGG飼料中LGG濃度，采用平板菌落計數(shù)法，將LGG飼料和正常飲食組飼料的梯度稀釋樣品接種到MRS培養(yǎng)基，然后置于37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。結(jié)果顯示：在LGG飼料的培養(yǎng)皿中散在分布著白色圓形的菌落，菌落直徑為1～2 mm，表面光滑、中央有凸起或扁平、質(zhì)地較軟，依據(jù)菌落計數(shù)結(jié)果計算出飼料中LGG濃度為7.3×108CFU·g-1。正常飲食組飼料無菌落生長。見圖1(插頁一)。

2.2 各組斑馬魚腸道組織中DEFBL1、TJP2a、MUC2.1和MUC5.3 mRNA表達水平與正常飲食組比較，LGG組斑馬魚腸道組織中DEFBL1和TJP2a mRNA表達水平明顯升高(t=-2.387，P<0.05；t=-12.482，P<0.01)，MUC2.1和MUC5.3 mRNA表達水平明顯降低(t= 2.497，P<0.05；t= 3.173，P<0.05)。見表2。

表2 各組斑馬魚腸道組織中DEFBL1、TJP2a、MUC2.1和MUC5.3 mRNA表達水平

2.3 各組斑馬魚腸道組織中TNF-α、TLR-2和IL-6 mRNA表達水平各組斑馬魚腸道組織中TNF-α、TLR-2和IL-6 mRNA表達水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(TNF-α：F=11.31，P=0.00；TLR-2：F=9.20，P=0.02；IL-6：F=4.35，P=0.02)。與假手術(shù) + 正常飲食組比較，SCI+正常 飲食組斑馬魚腸道組織中TNF-α、TLR-2和IL-6 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)。與SCI + 正常飲食組比較，SCI + LGG組 斑馬魚腸道組織中TNF-α、TLR-2和IL-6 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 各組斑馬魚腸道組織中TNF-α、TLR-2和IL-6 mRNA表達水平

2.4 各組斑馬魚腸道組織中致病菌屬的豐度與正常飲食組比較，給予LGG飲食7 d后，斑馬魚腸道組織中致病菌屬和條件致病菌屬的豐度明顯降低，其中致病菌屬主要包括氣單胞菌屬(Aeromonas)和弧菌屬(Vibrio)，條件致病菌屬主要包括脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)和短波單胞菌屬(Brevundimonas); 另外，參與纖維素消化的瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae)的豐度也明顯降低。給予LGG飲食7 d后，斑馬魚腸道組織中Terrimonas、Fastidiosipila和Bryobacter等菌屬的豐度均明顯升高。

給予LGG飲食28 d后，斑馬魚腸道組織中致病菌屬Aeromonas和條件致病菌屬Desulfovibrio的豐度明顯降低，與LGG飲食處理7 d后的變化趨勢一致；而Terrimonas、互營菌屬(Syntrophus)、地桿菌屬(Geobacter)和Phaselicystis等菌屬的豐度則明顯升高。LGG飲食組中豐度升高和豐度降低的菌屬見表4和表5，表中的數(shù)字表示分類到該菌屬的序列數(shù)。

表4 各組斑馬魚腸道組織中豐度降低菌屬的序列數(shù)

表5 各組斑馬魚腸道組織中豐度升高菌屬的序列數(shù)

3 討 論

腸黏膜屏障由微生物、黏液層(包括黏液素)、抗菌肽(如防御素、溶菌酶和趨化因子等)、腸上皮(包括緊密連接蛋白claudins等)和黏膜免疫系統(tǒng)等幾部分組成[10]。研究[11-12]表明：在SCI患者和模型大鼠中均出現(xiàn)了腸黏膜功能喪失或腸屏障破壞。腸道環(huán)境的失調(diào)也可影響SCI的修復(fù)，在大鼠SCI模型中，腸道菌群失調(diào)和腸通透性增加，而在損傷前誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)阻礙了SCI大鼠運動功能的恢復(fù)[6]，表明包括腸道菌群在內(nèi)的腸道環(huán)境在SCI恢復(fù)過程中起重要作用。因此本研究利用有極強神經(jīng)再生能力的斑馬魚制備SCI模型，首次探討了斑馬魚SCI后腸道炎癥的發(fā)生以及LGG飲食對斑馬魚腸道菌群的影響和減輕腸道炎癥的作用機制。

在LGG相關(guān)研究中，LGG干預(yù)[13-17]的有效濃度范圍為1×106CFU·g-1～ 1×1010CFU·g-1，作用時間為10～33 d。在本研究中，LGG飼料中LGG濃度為7.3×108CFU·g-1，LGG作用時間最短為7 d，最長為28 d。因此本研究中LGG飲食從濃度和飲食時間兩個方面均能確保LGG的有效定植。

研究[12]顯示：雄性Wistar 大鼠T3脊髓損傷后，上段腸道的炎癥標(biāo)記物趨化因子2(chemokines 2, CCL2)、趨化因子3(chemokines 3,CCL3)和細(xì)胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM1)mRNA表達升高，同時伴有小腸組織壞死和腸黏膜絨毛縮短等腸屏障破壞的表現(xiàn)。腸屏障功能的改變與包括炎癥性腸病在內(nèi)的多種疾病有關(guān)[10]。在本研究中，首次發(fā)現(xiàn)了斑馬魚SCI后腸道組織中炎癥因子TNF-α、TLR-2和IL-6 mRNA表達水平升高，表明SCI引發(fā)了斑馬魚腸道炎癥，可能是由于腸屏障功能破壞導(dǎo)致的。研究[18-19]表明：在炎性疾病患者和系統(tǒng)性炎癥的動物模型中，口服益生菌能明顯降低體內(nèi)TNF-α的表達水平。新生小鼠灌胃LGG后，腸道內(nèi)緊密連接蛋白3(claudin 3)表達增加，并且能劑量依賴性地加速腸屏障的成熟[20-21]。體外實驗[22]顯示：LGG可以阻止大腸桿菌對上皮結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間緊密連接的破壞，并能通過增加有益菌和保護腸屏障功能，進而減輕高果糖飲食小鼠的肝臟炎癥和肝脂肪變性。本研究結(jié)果顯示：LGG飲食降低了斑馬魚SCI引起的腸道組織中炎癥因子表達水平的上升，并且在給予正常斑馬魚LGG飲食21 d后，腸屏障相關(guān)分子DEFBL1和TJP2a mRNA表達水平明顯升高，提示LGG可能通過增強腸上皮屏障功能改善SCI引起的腸道炎癥。

研究[23-24]顯示：在飲食和化學(xué)因素誘導(dǎo)的斑馬魚腸道炎癥中，出現(xiàn)了腸黏液層增加，黏膜屏障相關(guān)分子如MUC2.2表達水平升高，表明在腸屏障受損的炎癥狀態(tài)下，腸杯狀細(xì)胞可能會分泌更多的黏液素來保護腸黏膜。在本研究中，LGG飲食組斑馬魚腸道組織中MUC2.1和MUC5.3 mRNA表達水平明顯降低，可能是因為LGG飲食能增加腸緊密結(jié)合蛋白的表達，減少致病菌的定植，塑造了更加健康的腸道狀態(tài)，但其具體機制仍需進一步研究。

在腸道菌群中，嗜水氣單胞菌是引起養(yǎng)殖魚類腸道炎癥的主要條件致病菌，常被用作誘導(dǎo)斑馬魚腸道炎癥的實驗?zāi)Ｐ蚚25]。研究[26-27]表明：LGG能通過凝集素樣分子或黏液結(jié)合菌毛抑制致病菌(大腸桿菌和糞腸球菌等)的定植。在本研究中，與正常飲食組比較，7 d和28 d后LGG飲食組斑馬魚腸道致病菌豐度明顯降低，其中氣單胞菌屬豐度降低最明顯，提示LGG飲食或許能通過抑制致病菌的定植減輕腸道炎癥。

綜上所述，飲食中有效的LGG濃度和作用時間能夠通過影響腸屏障功能和降低腸道內(nèi)致病菌的豐度減輕斑馬魚SCI引發(fā)的腸道炎癥，有望能進一步促進斑馬魚SCI后運動功能的恢復(fù)。本研究結(jié)果為LGG用于減輕SCI患者腸道炎癥和調(diào)節(jié)腸道菌群提供了理論依據(jù)。