肖聰麗，李 理*，陳 敏

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510641；2.中新國際聯(lián)合研究院，廣東廣州 510000）

高血脂癥是指血脂水平過高，主要表現(xiàn)為膽固醇和甘油三酯水平過高。高血脂癥常常會并發(fā)糖尿病[1]、動脈粥樣硬化[2]等疾病，嚴(yán)重危害人體健康。據(jù)美國國家衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)中心的數(shù)據(jù)分析，自1999-2012年以來，高膽固醇血癥的患病率從1999-2000年的3%增加到2011-2012年的6.3%[3]，同時(shí)，高血脂癥也越來越趨于年輕化[4]。目前，針對高血脂癥的治療多為化學(xué)藥物，具有一定的毒副作用[5]，越來越多的人將研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到天然活性產(chǎn)物中來[6-7]。大豆蛋白是一種營養(yǎng)價(jià)值較高的植物性蛋白質(zhì)，其必需氨基酸組成符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Food and agriculture organization，F(xiàn)AO）/世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）標(biāo)準(zhǔn)模式，是良好的蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑。大豆蛋白經(jīng)過物理或化學(xué)處理后，得到的大豆多肽不僅具有溶解度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)良的加工特性[8]，同時(shí)還具有多種生理功能活性，包括抗氧化[9-11]、降血壓[12-13]、降血脂[14-15]、抗癌[16-17]等，極具研究和開發(fā)價(jià)值。

目前，國內(nèi)外對大豆多肽降血脂活性及其作用機(jī)制的研究日趨深入，高夢笛[18]利用斑馬魚高血脂模型來研究大豆多肽Lunasin的降血脂活性，推測其機(jī)理主要是通過參與膽固醇代謝來調(diào)節(jié)血脂，進(jìn)而降低血脂水平。LAMMI C等[14，19]研究發(fā)現(xiàn)，從大豆球蛋白中分離出的三個(gè)多肽（IAVPGEVA，IAVPTGVA和LPYP）能夠通過激活低密度脂蛋白受體-固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（LDLR-SREBP2）途徑來抑制羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGCoAR）的活性并調(diào)節(jié)膽固醇代謝，從而增加人肝癌細(xì)胞（HepG2）攝取低密度脂蛋白的能力。本研究通過HepG2肝癌細(xì)胞構(gòu)建高膽固醇細(xì)胞模型，以大豆蛋白為對照組，分析大豆多肽對HepG2細(xì)胞內(nèi)總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high densitylipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力的影響，從而評價(jià)大豆多肽的體外降血脂活性。同時(shí)，采用凝膠過濾層析法和納米技術(shù)-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（nano-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，Nano-HPLC-MS/MS）技術(shù)對大豆多肽的組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析、鑒定，旨在為降血脂大豆多肽的開發(fā)和應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆蛋白（蛋白含量91.90%）：臨沂山松生物制品有限公司；大豆多肽（經(jīng)復(fù)合蛋白酶酶解制備而成，蛋白含量為91.25%）：中慈保健品生物有限公司；乙腈（色譜純）：龐博生物有限公司；橄欖油：益海糧油工業(yè)有限公司；胰脂肪酶（酶活力為500 U/mg）、曲拉通X-100（分析純）、膽固醇（純度≥99.00%）：美國Sigma公司；最小必需培養(yǎng)基（minimal essential medium，MEM）、總膽固醇試劑盒、甘油三脂試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒：美侖生物有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JW-3021離心機(jī)：安徽嘉文儀器裝備有限公司；HWS-12恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YX-18HDD高壓滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；HF細(xì)胞培養(yǎng)箱：力新儀器（上海）有限公司；RT-6000酶標(biāo)儀：深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；EASY-nano-LC 1200 Q Exactive plus質(zhì)譜儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；Acclam PepMap C18分析柱（75 μm×15 cm）：上海希言科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MTT細(xì)胞增殖及毒性實(shí)驗(yàn)

利用四甲基偶氮唑藍(lán)（methylthiazalyltetrazolium，MTT）比色法檢測不同濃度的大豆蛋白、大豆多肽對HepG2細(xì)胞增殖的影響，以此確定最適的樣品濃度。取對數(shù)期的HepG2細(xì)胞（含有1%雙抗＋10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2的二氧化碳養(yǎng)箱中培養(yǎng)），加入0.25%的胰酶消化1～2 min，計(jì)數(shù)，接種于96孔板中，每孔加100 μL，使其細(xì)胞數(shù)為5 000個(gè)/孔，于37 ℃、5%CO2條件下靜置培養(yǎng)24 h，每孔更換100 μL新的培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度（1.25 μg/mL、12.50 μg/mL、25.00 μg/mL、50.00 μg/mL、100.00 μg/mL、200.00μg/mL、500.00μg/mL、1000.00μg/mL、5000.00μg/mL）[20]的樣品，作用24 h后，棄去上清液，隨后添加100 μL的MTT溶液（5 mg/mL），孵育4 h后，添加一定量的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解液，待底部的結(jié)晶紫完全溶解后，將96孔板置于酶標(biāo)儀上，于波長490 nm處測定其吸光度值，細(xì)胞存活率的計(jì)算公式如下：

1.3.2 高膽固醇細(xì)胞造模實(shí)驗(yàn)

待肝癌細(xì)胞HepG2鋪滿細(xì)胞瓶底的80%～90%時(shí)，用胰酶消化、懸浮、計(jì)數(shù)，按照終濃度為2×105個(gè)/mL接種于96孔板中，在二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24～48 h，當(dāng)細(xì)胞單層長滿孔板底部時(shí)，換成無血清培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度（5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25 μg/mL）的膽固醇溶液，作用24 h后，棄去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）清洗3遍后，用胰酶消化，完全培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)入離心管中，于1 500 r/min離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，離心，棄上清，用PBS懸浮細(xì)胞，細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞后，按照試劑盒說明，測定各組細(xì)胞內(nèi)的膽固醇濃度。

1.3.3 大豆多肽對HepG2細(xì)胞中TG、TC的影響

待細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞長滿瓶底至80%～90%時(shí)，用胰酶消化、離心、稀釋至一定濃度后，將細(xì)胞接種于96孔板中，加入一定濃度的膽固醇于完全培養(yǎng)基中，每孔加樣量為2.5mL，作用一段時(shí)間后，添加不同質(zhì)量濃度（10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL）的樣品，培養(yǎng)24 h，隨后吸去上清液，用胰酶消化，離心，PBS清洗3遍，添加250 μL的1%Triton X-100，隨后于4 ℃冰浴裂解30～40 min。采用TG、TC試劑盒檢測其含量。

1.3.4 大豆多肽對HepG2細(xì)胞中LDL-C、HDL-C和SOD的影響

待細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞長滿瓶底至80%～90%時(shí)，用胰酶消化、離心、稀釋至一定濃度后，將細(xì)胞接種于96孔板中，加入一定濃度的膽固醇于完全培養(yǎng)基中，每孔加樣量為2.5mL，作用一段時(shí)間后，添加不同質(zhì)量濃度（10μg/mL、50μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL）的樣品，培養(yǎng)24 h，隨后吸去上清液，用胰酶消化，離心，PBS清洗三遍，添加250 μL的1%Triton X-100，隨后于4 ℃冰浴裂解30～40 min。采用LDL-C、HDL-C和SOD試劑盒檢測其含量。

1.3.5 體外胰脂肪酶活性的測定

在50 mL的三角瓶中加入4 mL的橄欖油和5 mL pH值為7.5的PBS緩沖液，混勻至乳液狀后，置于40 ℃保溫5 min，加入1 mL 5 mg/mL的胰脂肪酶，其中空白組加入1 mL的胰脂肪酶，實(shí)驗(yàn)組加入1 mL的胰脂肪酶和1 mL的待測樣品，混勻后在40 ℃準(zhǔn)確反應(yīng)30 min，以15 mL的體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇終止反應(yīng)后，在溶液中加入2～3滴1%的酚酞指示劑，用0.025 mol/L的NaOH滴定至淡紅色出現(xiàn)，并且在30 s內(nèi)不褪色，記錄消耗的NaOH溶液體積，胰脂肪酶活力的計(jì)算公式如下[21]：

式中：VA為樣品組消耗NaOH滴定液的體積，mL；VB為空白組消耗NaOH滴定液的體積，mL；M為NaOH滴定液的濃度，mol/L；W為胰脂肪酶的取樣量，g；T為反應(yīng)時(shí)間，min。

1.3.6 大豆多肽的分子質(zhì)量分布

采用國標(biāo)GB/T22492—2008《大豆肽粉》中的檢測方法，稍加修改。具體方法如下：采用高效凝膠過濾色譜法進(jìn)行檢測，其中色譜柱為TSKgel G2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）（內(nèi)徑）的凝膠柱，流動相∶乙腈∶水∶三氟乙酸=200∶800∶1（V/V），流速為0.5 mL/min，檢測波長為220 nm[22]。

1.3.7 凝膠過濾層析

采用葡聚糖凝膠SephadexG15作為填料，裝填至60mm×2.5 mm的玻璃層析柱中，平衡2～3個(gè)柱體積后上樣，以去離子水為洗脫液，洗脫流速為1 mL/min，檢測波長為220 nm，用自動收集器收集各組分，將屬于同一峰的組分合并、濃縮并凍干，待后續(xù)備用[23]。

1.3.8 Nano-HPLC-MS/MS

將樣品復(fù)溶于水后經(jīng)由配備在線納噴離子源的HPLCMS/MS分析。流動相：0.1%甲酸-水（A）和0.1%甲酸-乙腈（B），上樣3 μL樣品，以線性梯度分離，0～60 min，8%～40%B。柱流量控制在200 nL/min，柱溫為40 ℃，電噴霧電壓2 kV。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

串聯(lián)質(zhì)譜圖經(jīng)過PEAKSStudioX軟件分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0進(jìn)行分析，每組數(shù)據(jù)均為3次測定的平均值，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Duncan法進(jìn)行單因素顯著性差異分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆多肽的分子質(zhì)量分布

通過凝膠過濾色譜法對大豆多肽樣品的分子質(zhì)量分布進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。由表1可知，大豆多肽中分子質(zhì)量在190～451 Da范圍內(nèi)為其主要成分，占68.95%，其次是分子質(zhì)量在451～1 452 Da范圍內(nèi)的組分，占18.80%，分子質(zhì)量＞6 500 Da的組分最少，僅占0.94%。其中，分子質(zhì)量＜1 500 Da的組分占比＞87%，這表明該大豆多肽主要由小分子肽構(gòu)成。INOUE N等[24]從大豆蛋白酶解液中分離出3個(gè)二肽（KA、VK和SY），進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，KA、VK和SY均可以顯著降低HepG2細(xì)胞中甘油三酯的合成量（P＜0.05），其中，SY能夠有效抑制載脂蛋白-B的分泌，具有一定的降血脂活性。NAGAOKA S等[25]研究發(fā)現(xiàn)，大豆多肽（WAWWMY）的膽酸結(jié)合能力與降血脂藥物消膽胺相當(dāng)，能夠顯著降低大鼠血清、肝臟和腸道的膽固醇含量（P＜0.05）。

表1 大豆多肽的分子質(zhì)量分布Table 1 Molecular weight distribution of soybean peptides

2.2 大豆多肽的體外降血脂實(shí)驗(yàn)

2.2.1 MTT實(shí)驗(yàn)[26]

本實(shí)驗(yàn)考察了8個(gè)濃度梯度的樣品對HepG2肝癌細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果見圖1。由圖1可知，在1.25～5 000 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，HepG2細(xì)胞的存活率均＞99.00%，這表明在該濃度范圍內(nèi)大豆多肽和大豆蛋白對HepG2細(xì)胞不具有細(xì)胞毒性作用，且不具有顯著性差異（P＞0.05），在此濃度范圍內(nèi)可以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖1 大豆蛋白和大豆多肽對HepG2肝癌細(xì)胞的存活影響Fig.1 Effect of soybean protein and soybean peptides on the survival of HepG2 liver cancer cells

2.2.2 高膽固醇細(xì)胞造模實(shí)驗(yàn)

圖2 不同質(zhì)量濃度的膽固醇對總膽固醇含量的影響Fig.2 Effect of different concentrations of cholesterol on total cholesterol content

以HepG2肝癌細(xì)胞來構(gòu)建高膽固醇細(xì)胞模型，其結(jié)果見圖2。由圖2可知，當(dāng)膽固醇質(zhì)量濃度＜20 μg/mL時(shí)，膽固醇的含量隨著膽固醇濃度的增加而增加，膽固醇質(zhì)量濃度＜20 μg/mL時(shí)，膽固醇的含量不再顯著增加（P＞0.05），膽固醇質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，對應(yīng)的膽固醇含量為7.41 mmol/L，高于正常水平時(shí)的膽固醇含量，這表明當(dāng)膽固醇質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，高膽固醇細(xì)胞模型構(gòu)建成功，因此，將此膽固醇質(zhì)量濃度20 μg/mL作為造模濃度。

2.2.3 大豆多肽對HepG2細(xì)胞中TG和TC含量的影響

圖3 不同質(zhì)量濃度的大豆蛋白和大豆多肽對HepG2細(xì)胞中TG（a）及TC（b）含量的影響Fig.3 Effect of different concentrations of soybean protein and soybean peptides on TG (a) and TC (b) contents

以大豆蛋白為對照組，通過添加不同質(zhì)量濃度（10μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL）的大豆多肽，研究其對HepG2細(xì)胞中甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）含量的影響。細(xì)胞中TG含量的變化如圖3a所示，在10～100 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞中TG的含量隨著大豆多肽和大豆蛋白濃度的升高而降低，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，大豆蛋白和大豆多肽對應(yīng)的TG濃度分別為9.8μmol/g和4.6μmol/g，與10μg/mL時(shí)對應(yīng)的TG濃度相比，分別降低了810%和880%。這表明，大豆蛋白和大豆多肽均能夠在一定程度上抑制細(xì)胞中TG的產(chǎn)生，與大豆蛋白對照組相比，大豆多肽在濃度10μg/mL、100 μg/mL時(shí)對TG具有顯著性降低作用（P＜0.05）。細(xì)胞中TC含量的變化如圖3b所示，在10～100 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，大豆蛋白和大豆多肽對細(xì)胞中TC含量的影響與TG基本一致，均與樣品濃度呈負(fù)相關(guān)。100 μg/mL的大豆多肽和大豆蛋白對應(yīng)的TC濃度分別為2.9μmol/g和2.1 μmol/g，與10 μg/mL的樣品濃度對應(yīng)的TC濃度相比（65.5 μmol/g和78.9 μmol/g），顯著降低（P＜0.05）。綜合以上分析，大豆多肽能夠在一定程度上抑制細(xì)胞中TG和TC的產(chǎn)生，且大豆多肽對TG的抑制作用稍強(qiáng)于對照組大豆蛋白。

2.2.4 大豆多肽對HepG2細(xì)胞中LDL-C和HDL-C含量的影響[27]

以大豆蛋白為對照組，通過添加不同質(zhì)量濃度（10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL）的大豆多肽，研究其對HepG2細(xì)胞中LDL-C和HDL-C含量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同質(zhì)量濃度的大豆蛋白和大豆多肽對HepG2細(xì)胞中LDL-C（a）及HDL-C（b）含量的影響Fig.4 Effect of different concentrations of soybean protein and soybean peptides on LDL-C (a) and HDL-C (b)production in HepG2 cells

由圖4a可知，細(xì)胞中LDL-C的含量與大豆蛋白和大豆多肽的濃度呈負(fù)相關(guān)。10 μg/mL的大豆蛋白和大豆多肽對應(yīng)的LDL-C濃度分別為255.3 μmol/g和90.2 μmol/g，而當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到500 μg/mL時(shí)，對應(yīng)細(xì)胞中LDL-C濃度分別為55.8 μmol/g和2.7 μmol/g，對比降低了460%和3 340%。在相同的樣品質(zhì)量濃度下，大豆多肽對應(yīng)的細(xì)胞中LDL-C濃度要顯著低于大豆蛋白。這表明大豆多肽對細(xì)胞中LDL-C的抑制作用顯著高于大豆蛋白對照組（P＜0.05）。由圖4b可知，隨著大豆蛋白和大豆多肽濃度的升高，細(xì)胞中HDL-C的含量隨之升高。當(dāng)質(zhì)量濃度為500 μg/mL時(shí)，大豆蛋白和大豆多肽對應(yīng)的細(xì)胞中HDL-C濃度分別為54.0 μmol/g和69.2 μmol/g，與10 μg/mL時(shí)相比，分別增長了24.4%和37.3%。與對照組大豆蛋白相比，大豆多肽對細(xì)胞中HDL-C的產(chǎn)生具有更強(qiáng)的促進(jìn)作用。綜合以上分析，大豆多肽能夠抑制細(xì)胞中LDL-C的產(chǎn)生并促進(jìn)HDL-C的產(chǎn)生，且對HDL-C的促進(jìn)作用顯著高于對照組大豆蛋白（P＜0.05）。

2.2.5 大豆多肽對HepG2細(xì)胞中SOD活力的影響

以大豆蛋白為對照組，通過添加不同質(zhì)量濃度（10μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL）的大豆多肽，研究其對HepG2細(xì)胞中超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著大豆蛋白和大豆多肽質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞中SOD活力隨之增加。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度由10 μg/mL增加至500 μg/mL時(shí)，大豆多肽的SOD活力由0.634 U/g增加到0.987 U/g，增幅為35.71%。與對照組大豆蛋白相比，在相同質(zhì)量濃度下，大豆多肽對細(xì)胞中SOD活力的促進(jìn)作用極顯著增強(qiáng)（P＜0.01）。綜上所述，大豆多肽能夠在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞中SOD活力，且大豆多肽的促進(jìn)作用顯著高于對照組大豆蛋白（P＜0.05）。

圖5 不同濃度的大豆蛋白和大豆多肽對HepG2細(xì)胞中SOD活力的影響Fig.5 Effect of different concentrations of soybean protein and soybean peptides on SOD activity in HepG2 cells

2.3 大豆多肽的分離純化及鑒定

2.3.1 凝膠過濾層析法

采用Sephadex G-15凝膠柱對大豆多肽進(jìn)行分離純化，其結(jié)果見圖6。

圖6 大豆多肽分離純化凝膠層析圖Fig.6 Gel chromatogram of soybean peptide separation and purification

由圖6可知，經(jīng)過G-15葡聚糖凝膠色譜分離后得到三個(gè)主要的多肽峰，分別為E1、E2、E3，根據(jù)凝膠層析的原理可知，組分E3為分子量最小的組分，隨后將三個(gè)組分收集后濃縮、凍干，留待備用。

將上述三個(gè)組分用去離子水配制成質(zhì)量濃度10 mg/mL的溶液，分析各個(gè)組分的胰脂肪酶抑制率，結(jié)果見圖7。由圖7可知，純化后的組分E2、E3與未純化的大豆多肽相比，其抑制胰脂肪酶抑制率顯著性提高（P＜0.05），而與組分E1相比則沒有顯著性差異，其中組分E3的胰脂肪酶抑制率最高，達(dá)22.33%，因此選擇純化后的組分E3用于下一步的純化和鑒定。

圖7 不同組分對應(yīng)的胰脂肪酶抑制率Fig.7 Pancreatic lipase inhibition rate of different components

2.3.2 Nano-HPLC-MS/MS

采用Nano-HPLC-MS/MS技術(shù)對大豆多肽組分E3進(jìn)行進(jìn)一步的分析與鑒定，根據(jù)二級質(zhì)譜中母離子和碎片離子的特性，在數(shù)據(jù)庫中篩選出匹配度最高的多肽序列，該方法為數(shù)據(jù)庫比對法。對于數(shù)據(jù)庫中未匹配到的肽段，可利用碎片離子的質(zhì)量差，得到對應(yīng)的氨基酸殘基，采用從頭測序法進(jìn)行進(jìn)一步的分析。通過以上兩種方法，可以對大豆多肽進(jìn)行全面地篩選。

（1）數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果分析

通過數(shù)據(jù)庫搜庫比對匹配后得到的大豆肽段有6744條，最小的大豆多肽為七肽，最大的大豆多肽為四十五肽，分子質(zhì)量分布在500～5 000 Da，電荷數(shù)在1～7之間，大豆多肽最大的峰面積為4.21×109。其中多肽百分含量最高的是九肽，為11.09%，共有748個(gè)；其次是十一肽，百分含量為10.97%，共有740個(gè)，第三是十二肽；百分含量為9.83%，共有663個(gè)；二十肽到四十五肽共有335個(gè)，百分含量為4.97%，其中LIDSVLDVVRK百分含量最高，其分子質(zhì)量為1 255.75 Da，占比為0.31%。

（2）從頭測序法結(jié)果分析

利用從頭測序法鑒定出10 540種多肽，含有2～39個(gè)氨基酸，其中十五肽以下的游離肽占比為92.89%，十六肽到三十九肽的數(shù)量為749個(gè)、十五肽226個(gè)、十四肽331，十三肽389個(gè)、十二肽460個(gè)、十一肽443個(gè)、十肽540個(gè)、九肽552、八肽690個(gè)、七肽973個(gè)、六肽1 514個(gè)、五肽1 603個(gè)、四肽1 439、三肽630個(gè)、二肽為1個(gè)，含量排在前三位的分別是五肽、六肽和四肽，其中五肽的百分含量最高，占多肽總含量的15.21%。

氨基酸局部置信度（amino acid local confidence，ACL）為從頭測序數(shù)據(jù)結(jié)果的置信度，通常認(rèn)為結(jié)果較為可信的，其ACL＞80%，非常可信時(shí)ACL＞95%，對此將從頭測序結(jié)果中ACL＞95%、百分含量最高的4個(gè)多肽結(jié)果統(tǒng)計(jì)在表2中，結(jié)果顯示，這4個(gè)肽中包括1個(gè)五肽、2個(gè)六肽和1個(gè)七肽，對其多肽序列分別為LLDTN、FLEHAF、DFGKFF和LVGLKLY，對應(yīng)的分子質(zhì)量分別為574.30 Da、762.37 Da、759.36 Da、804.51 Da。

表2 從頭測序法分析的游離肽Table 2 The free peptides using de novo sequencing methods

3 結(jié)論

結(jié)果表明，大豆多肽的分子質(zhì)量＜1 500 Da的組分占比＞87%，主要由小分子肽構(gòu)成。通過HepG2肝癌細(xì)胞構(gòu)建高膽固醇細(xì)胞模型，以大豆蛋白為對照組，分析大豆多肽對細(xì)胞內(nèi)TC、TG、HDL-C、LDL-C和SOD活力的影響。大豆多肽對細(xì)胞中TG、TC、LDL-C的產(chǎn)生具有一定的抑制作用，對細(xì)胞中HDL-C的產(chǎn)生和SOD活力具有促進(jìn)作用，且大豆多肽對TG、LDL的抑制作用及對HDL-C和SOD活力的促進(jìn)作用均強(qiáng)于對照組大豆蛋白，具有良好的體外降血脂活性。通過凝膠過濾層析法和Nano-HPLC-MS/MS技術(shù)對大豆多肽進(jìn)行純化和鑒定，最終篩選出5個(gè)多肽，分別為LLDTN、FLEHAF、DFGKFF、LVGLKLY和LIDSVLDVVRK，對應(yīng)的分子質(zhì)量為574.30 Da、762.37 Da、759.36 Da、804.51 Da和1 255.75 Da。本研究表明，大豆多肽具有良好的體外降血脂活性，同時(shí)對大豆多肽進(jìn)行了分離和結(jié)構(gòu)鑒定，這為降血脂大豆多肽的開發(fā)和工業(yè)化應(yīng)用提供了新思路和理論基礎(chǔ)。