張 松，繆禮鴻*，張明春，劉蒲臨，廖衛(wèi)芳

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430023；2.湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司，湖北松滋 434200）

傳統(tǒng)固態(tài)白酒發(fā)酵與酒醅中的優(yōu)勢微生物密切相關(guān)，白酒中的風(fēng)味物質(zhì)在很大程度上由其釀造的微生物所決定[1-6]。乳酸菌在白酒釀造過程中具有重要作用，其種類及動態(tài)變化對于白酒品質(zhì)及產(chǎn)量具有重要影響[7-8]。通過對白酒釀造中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵輪次的增加，乳酸菌含量不斷增加，往往是酒醅發(fā)酵后期的優(yōu)勢細(xì)菌[9-13]。在生產(chǎn)上通過調(diào)控乳酸菌的數(shù)量可以控制乳酸乙酯的含量，從而保證白酒的品質(zhì)[14]。有研究表明，清香型和醬香型白酒發(fā)酵中優(yōu)勢乳酸菌的種類和含量均有不同，并通過可培養(yǎng)和未培養(yǎng)的方法確定了醬香型白酒中的主要乳酸菌是同型腐酒乳桿菌（Lactobacillus homohiochii）和布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）[15-16]。

布氏乳桿菌（L.buchneri）常見于畜牧行業(yè)飼用菌的相關(guān)報道，具有增加青貯飼料有氧穩(wěn)定性的作用[17-20]。同時，布氏乳桿菌（L.buchneri）還具有產(chǎn)細(xì)菌素的能力，能明顯抑制某些細(xì)菌等微生物的生長，并可促進(jìn)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、拜耳結(jié)合酵母（Saccharomyces baillii）等白酒釀造中優(yōu)勢酵母菌的生長[21-25]。

本研究對濃醬兼香型酒醅中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，并對分離自不同輪次酒醅的多株L.buchneri的耐酸、耐乙醇、耐高溫等能力及液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行比較分析，旨在為揭示白酒相關(guān)發(fā)酵機(jī)理和功能菌種選育提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

濃醬兼香型酒醅樣品：采自湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司釀酒車間（第三輪次、第四輪次、第五輪次和第六輪次），各輪次的入池和出池酒醅樣品采集數(shù)量均為2份，各酒醅樣品pH值在3.2～4.5之間。

1.1.2 化學(xué)試劑

溶菌酶（20 000 U/mg）：蓋云天（武漢）生物技術(shù)有限公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物：生工生物工程（上海）股份有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）、DNA聚合酶（5 U/μL）：寶生物工程（大連）有限公司；蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏（均為生化試劑）：安琪酵母有限公司；葡萄糖、吐溫80、磷酸氫二鉀、無水乙酸鈉、乙酸、檸檬酸氫二銨、七水硫酸鎂、一水硫酸錳（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸乙酯、正丙醇、叔戊醇（均為色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基[26]：牛肉膏10 g、蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、葡萄糖5 g、無水乙酸鈉5 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸氫二銨2 g、吐溫-80 1 mL、七水硫酸鎂0.2 g、一水硫酸錳0.05 g、蒸餾水1 000 mL，pH值調(diào)至6.5～6.8，分裝滅菌，115 ℃高壓滅菌30 min。

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉20 g，115 ℃高壓滅菌30 min。

改良MRS固體培養(yǎng)基[27]：在MRS固體培養(yǎng)基中添加1.5%的CaCO3。

酸度耐受性培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，使用乙酸-乳酸（1∶1，V/V）混合酸調(diào)整其pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.5。

乙醇耐受性培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，按體積分?jǐn)?shù)分別加入2%、4%、6%、8%、10%的無水乙醇。

1.2 儀器與設(shè)備

ECLIPSE80i相差顯微鏡：日本Nikon公司；ZHJH-C1115B超凈工作臺、ZXDP-A2160全自動新型電熱培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；T3000PCR儀：德國Biometra公司；SYDR/1305凝膠成像儀：美國Syngene公司；UV-5900PC紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；YXQ-LS-50Sll立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；7890A氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、1260c高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 濃醬兼香型酒醅乳酸菌的分離[28]

稱取不同輪次酒醅樣品10g，加入90mL無菌水中，30℃、170 r/min搖床振蕩0.5 h，經(jīng)系列稀釋后，取適當(dāng)稀釋度的菌液各1 mL涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，封口，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱72 h靜置培養(yǎng)。待乳酸菌長出后，隨機(jī)挑取形態(tài)不同的單菌落，在改良MRS固體培養(yǎng)基上劃線分離純化2～3次，挑取產(chǎn)生透明圈的單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，進(jìn)行革蘭氏染色和過硫化氫實(shí)驗(yàn)，將革蘭氏染色呈陽性且過硫化氫實(shí)驗(yàn)呈陰性的菌株初步確定為乳酸菌。分離乳酸菌時MRS培養(yǎng)基中均添加100 U/mL制霉菌素，以抑制酒醅中酵母菌的生長。

1.3.2 濃醬兼香型酒醅乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定

挑取純化后的乳酸菌單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃、靜置培養(yǎng)48 h，用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，完成后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。以分離菌株的基因組DNA為模板，采用乳酸菌16S rDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）與1492R（5'-TA-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對其16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：2×PowerTaqMaserMix 25 μL，DNA模板1 μL，引物27F和1492R各1 μL，雙蒸水（ddH2O）22 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，54 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min[24]。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。取1 400 bp左右的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。采DNAStar軟件對測序結(jié)果進(jìn)行人工校對。校正以后的序列提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源序列搜索，比較測試菌株和已知乳酸菌菌株之間的親緣關(guān)系及其系統(tǒng)地位。根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，用DNAMAN6.0校準(zhǔn)排齊序列，采用MEGA5.2軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法，1 000次Bootstrap檢驗(yàn)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[29]。

1.3.3 不同輪次布氏乳桿菌生長特性的測定

耐酸能力的測定：挑取布氏乳桿菌單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基，裝液量20 mL/25 mL，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，進(jìn)行活化。按1%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，裝液量20 mL/25 mL，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，作為種子液。將種子液按1%（V/V）的接種量分別接種到不同pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.5）的MRS液體培養(yǎng)基中，裝液量20 mL/25 mL，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，將菌液稀釋一定倍數(shù)，采用紫外分光光度計測菌液的OD600nm值。

耐乙醇能力的測定：將布氏乳桿菌種子液按1%（V/V）的接種量分別接種于含不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%）的MRS液體培養(yǎng)基中，裝液量20 mL/25 mL，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，將菌液稀釋一定倍數(shù)，采用紫外分光光度計測菌液的OD600nm值。

耐高溫能力的測定：將布氏乳桿菌種子液按1%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，裝液量20 mL/25 mL，分別在37 ℃、41 ℃、45 ℃、50 ℃條件下，靜置培養(yǎng)48 h，將菌液稀釋一定倍數(shù)，采用紫外分光光度計測菌液的OD600nm值。

1.3.4 不同布氏乳桿菌株液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將布氏乳桿菌種子液按2%（V/V）的接種量接種于200mL MRS液體培養(yǎng)基，搖勻，用無菌不透氣保鮮膜封口，密閉，28 ℃恒溫靜置發(fā)酵3 d。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液過膜處理，采用高效液相色譜分析發(fā)酵產(chǎn)物差異。

1.3.5 發(fā)酵產(chǎn)物中有機(jī)酸的測定

取布氏乳桿菌發(fā)酵液，渦旋振蕩混勻，直接用5 mL的注射器（不帶針頭）取不同菌株發(fā)酵液5 mL，先用0.45 μm有機(jī)濾膜初步過濾，再用0.22 μm有機(jī)濾膜注入2 mL的液相進(jìn)樣瓶中，每一個處理?xiàng)l件平行三次。采用高效液相色譜法檢測有機(jī)酸[30]，HPLC條件：Bio-RadAminexHPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm×9 μm），柱溫30 ℃，檢測器二極管陣列紫外-可見光檢測器，檢測波長210 nm，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，流動相為4 mmol/L硫酸溶液。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

通過SPSS22.0軟件分析不同樣本間是否存在顯著性差異，對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，使用Tukey方法，假設(shè)樣本間方差相等，若Tukey HSD檢驗(yàn)P＞0.05則無顯著性差異；0.01＜P＜0.05則差異顯著；P＜0.01則差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 濃醬兼香型不同輪次酒醅中乳酸菌的分離鑒定

采用稀釋平板分離法從濃醬兼香型不同輪次酒醅中共分離獲得30株乳酸菌，編號分別為ZS-B1～ZS-B21、ZS～Z4、ZS-RSP1、ZS-RSP2、ZS-WT1、ZS-WT2、ZS-FC1。采用MEGA5.2軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。

圖1 基于16S rDNA序列不同輪次酒醅分離乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria isolated from different rounds of fermented grains based on 16S rDNA sequences

由圖1可知，30株分離的乳酸菌分屬于3個屬共5個種，其中，布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）21株，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）4株，糞腸球菌（Enterococcusfaecalis）1株，乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）2株，戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）2株，說明從不同輪次酒醅中分離的乳酸菌主要為布氏乳桿菌（L.buchneri），約占總分離菌株數(shù)的70%，其具體菌株編號及來源酒醅信息見表1。

表1 21株布氏乳桿菌分離材料來源信息Table 1 Source information of isolation material of 21 strains of Lactobacillus buchneri

由表1可知，21株布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）中，第三和第四輪次出池酒醅中分離的L.buchneri菌株數(shù)較多，分別為6株、5株。與濃醬兼香型高溫大曲中分離的乳酸菌比較，從酒醅中分離的這3個屬的乳酸菌均在大曲中出現(xiàn)，但優(yōu)勢菌種明顯不同[31]，這與酒醅發(fā)酵與制曲發(fā)酵環(huán)境條件有明顯差異有關(guān)。

2.2 不同布氏乳桿菌株生長特性研究結(jié)果

2.2.1 不同布氏乳桿菌株耐酸能力的測定結(jié)果

圖2 不同布氏乳桿菌株耐酸能力比較Fig.2 Comparison of acid tolerance of different strains of Lactobacillus buchneri

由于菌株ZS-B11和菌株ZS-B15生長過于緩慢，不符合實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)，故除去。由圖2可知，各菌株的最適生長pH范圍在4.5～5.5之間；當(dāng)培養(yǎng)基pH值＜4.5之前，L.buchneri生長會受到明顯抑制；當(dāng)培養(yǎng)基pH值進(jìn)一步降低至4.0時，絕大多數(shù)菌株不能生長，部分L.buchneri菌株間耐酸能力也存在差異（P＜0.05）。結(jié)果顯示，菌株ZS-B3、ZS-B9在pH4.0時能微弱生長，而其他菌株均停止生長；菌株ZS-B2、ZS-B5和ZS-B8在培養(yǎng)基pH4.5和pH5.0時，菌液OD600nm值在0.6～1.1之間，生長明顯低于其他菌株；耐酸能力較好的菌株共11株，最適pH值均在4.5左右，分別是菌株ZS-B19、ZS-B16、ZS-B20、ZS-B21、ZS-B17、ZS-B4、ZS-B14、ZS-B18、ZS-B12、ZS-B10、ZS-B7；其中菌株ZS-B10不僅耐酸能力好，菌株生長能力較好，pH4.5時其OD600nm值可以達(dá)到2.23。

2.2.2 不同布氏乳桿菌株耐乙醇能力的測定結(jié)果

圖3 不同布氏乳桿菌株耐乙醇能力比較Fig.3 Comparison of ethanol tolerance of different strains of Lactobacillus buchneri

由圖3可知，不同L.buchneri菌株間耐乙醇能力存在顯著性差異（P＜0.05）。與未添加乙醇組比較，2%乙醇組明顯抑制菌株ZS-B12、ZS-B10、ZS-B17、ZS-B2、ZS-B13、ZS-B14、ZS-B1、ZS-B7的生長，但所測試菌株抑制效果強(qiáng)弱存在差異。初始培養(yǎng)基中含6%乙醇時，部分L.buchneri菌液的OD600nm值已經(jīng)＜0.5，但菌株ZS-B6、ZS-B21、ZS-B9、ZS-B8、ZS-B18、ZS-B19、ZS-B20、ZS-B16這8株L.buchneri菌液的OD600nm值仍能達(dá)到0.7以上。當(dāng)培養(yǎng)基中乙醇添加到8%時，菌株ZS-B10、ZS-B2、ZS-B14、ZS-B12、ZS-B1、ZS-B7、ZS-B5、ZS-B17幾乎停止生長，有少數(shù)L.buchner有微弱的生長，但菌株ZS-B8、ZS-B19、ZS-B21、ZS-B18、ZS-B20、ZS-B16這8株菌液的OD600nm值仍能達(dá)到0.7。當(dāng)培養(yǎng)基中添加10%乙醇時，大多數(shù)L.buchner完全受到抑制，僅有菌株ZS-B18、ZS-B16生長良好，菌液OD600nm值達(dá)到0.7左右。當(dāng)培養(yǎng)基中乙醇含量達(dá)到12%時，菌株ZS-B18、ZS-B16生長也受到明顯抑制，幾乎不能生長。經(jīng)過對比，有3株布氏乳桿菌耐乙醇能力較好，分別是菌株ZS-B20、ZS-B18、ZS-B16，它們的最大耐乙醇含量可以達(dá)到10%。由圖3亦可知，其中部分L.buchneri出現(xiàn)了添加少量乙醇（2%）反而比不添加乙醇的培養(yǎng)基生長狀況好的情況。

2.2.3 不同布氏乳桿菌株耐高溫能力測定結(jié)果

由圖4可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為37 ℃時，19株L.buchneri生長較好，菌液OD600nm值在1.5～2.1之間；當(dāng)培養(yǎng)溫度為41 ℃時，菌液OD600nm值在1.1～1.7之間，說明L.buchneri生長受到一定的抑制；當(dāng)培養(yǎng)溫度提升至45 ℃時，L.buchneri菌液的OD600nm值均＜0.4，其中菌株ZS-B20、ZS-B17、ZS-B14、ZS-B16有微弱生長，具有一定的耐高溫生長能力，其余菌株幾乎不生長；當(dāng)培養(yǎng)溫度進(jìn)一步提升至50 ℃，所有菌株均停止生長。

圖4 不同布氏乳桿菌株耐高溫能力比較Fig.4 Comparison of high temperature tolerance of different strains of Lactobacillus buchneri

2.3 不同布氏乳桿菌株液體發(fā)酵產(chǎn)有機(jī)酸能力的測定結(jié)果

以植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ZR1為對照，探究6株L.buchneri代表菌株純菌種液體發(fā)酵產(chǎn)有機(jī)酸能力，其中3株L.buchneri為綜合耐受性較差菌株（ZS-4、ZS-B7和ZS-B8），3株為綜合耐受性優(yōu)良菌株（ZS-16、ZS-B18和ZS-B21）。由表2可知，6株L.buchneri在發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸方面相較于植物乳桿菌（L.plantarum）ZR1存在很大差異。6株L.buchneri的檸檬酸平均產(chǎn)量為3.761 g/L，而L.plantarum的檸檬酸產(chǎn)量只有0.338 g/L，L.buchneri檸檬酸產(chǎn)量是L.plantarum的11.13倍。6株L.buchneri與L.plantarum間檸檬酸產(chǎn)量存在極顯著差異（P＜0.01）。對6株L.buchneri間的檸檬酸產(chǎn)量進(jìn)行顯著性差異分析，得出菌株ZS-B16與ZS-B4、ZS-B8、ZS-B21間的檸檬酸產(chǎn)量也存在顯著性差異（P＜0.05）。由于MRS培養(yǎng)基本身含有2 g/L的檸檬酸氫二銨，造成布氏乳桿菌與植物乳桿菌發(fā)酵液中檸檬酸含量的差異主要是由于布氏乳桿菌具有合成檸檬酸的能力，還是由于布氏乳桿菌只能利用檸檬酸氫二銨中的銨鹽而不能利用檸檬酸根導(dǎo)致檸檬酸的積累所致尚不清楚，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

表2 7株乳酸菌發(fā)酵液有機(jī)酸分析結(jié)果Table 2 Analysis results of organic acid in fermentation broth of 7 strains of lactic acid bacteria

L.plantarumZR1的乳酸產(chǎn)量為7.228 g/L，而6株L.buch-neri的乳酸平均產(chǎn)量為4.810 g/L，前者的乳酸產(chǎn)量是后者的1.50倍。在產(chǎn)乙酸方面，6株L.buchneri相較于L.plantarum也存在顯著差異（P＜0.01）。6株L.buchneri的乙酸平均產(chǎn)量在4.222 g/L，L.plantarum的乙酸產(chǎn)量為2.335 g/L，L.buchneri的乙酸產(chǎn)量是L.plantarum的1.80倍。分析其原因，主要是由于L.plantarum屬同型乳酸發(fā)酵，而L.buchneri屬異型乳酸發(fā)酵乳酸菌，在發(fā)酵生成乳酸的同時還會生成少量的乙酸、CO2等物質(zhì)[32]。

3 結(jié)論

本研究從濃醬兼香型不同輪次的酒醅中共分離到30株乳酸菌，歸屬于3個屬共5個種，分別為布氏乳桿菌、植物乳桿菌、糞腸球菌、乳酸片球菌和戊糖片球菌，其中布氏乳桿菌（L.buchneri）最多，為21株，占總分離菌株數(shù)的70%，是第三、第四輪出池酒醅中的優(yōu)勢乳酸菌。

不同輪次酒醅中分離的19株L.buchneri的耐酸、耐乙醇和耐高溫生長能力存在一定差異，最適生長pH值大多在4.5左右，其中，菌株ZS-B3、ZS-B9和ZS-B10耐酸性較好，pH 4.0條件下培養(yǎng)48 h后，OD600nm值可以達(dá)到0.2；對乙醇的耐受能力在2%～10%之間，約有50%的菌株乙醇耐受能力達(dá)到6%，其中菌株ZS-B18和ZS-B16乙醇耐受能力最強(qiáng)，在含10%乙醇的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，OD600nm值仍能達(dá)到0.7；最適生長溫度均為37 ℃，在41 ℃條件下，L.buchneri生長均受到抑制，當(dāng)溫度升高到45℃時，所有菌株均停止生長。

6株布氏乳桿菌代表菌株表現(xiàn)出了較強(qiáng)的發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸和乙酸的能力。其平均檸檬酸產(chǎn)量為3.761 g/L，平均乙酸產(chǎn)量為4.222 g/L，分別是L.plantarumZR1的11.13倍和1.80倍。檸檬酸是良好的食物酸味劑，具有抗氧化、增加酸味、抑制細(xì)菌等作用。傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵白酒中主要呈香物質(zhì)乙酸乙酯的形成又與乙酸有直接相關(guān)。對布氏乳桿菌在白酒發(fā)酵系統(tǒng)中的存在狀態(tài)及其功能進(jìn)行研究，對于調(diào)控白酒中檸檬酸和乙酸乙酯含量具有一定的指導(dǎo)意義。