劉春霖，吳曉云，謝強(qiáng)勝，高天陽(yáng)，董蓬

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東省食品藥品安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101)

阿膠為馬科動(dòng)物驢(EquusasinmL.)的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠。它是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴補(bǔ)血中藥，具有補(bǔ)血滋陰，潤(rùn)燥，止血，增強(qiáng)體質(zhì)，增強(qiáng)免疫力等功效[1-3]。本次研究的阿膠口服液是以阿膠為主要原料，添加熟地黃、黨參、枸杞子、黃芪等中藥材，經(jīng)提取、濃縮、配制、灌裝等主要工藝制成的產(chǎn)品，具有增強(qiáng)免疫力的保健功能。上述添加的中藥材均含有多糖類成分，文獻(xiàn)研究報(bào)道具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗疲勞的作用[4-8]。近年來(lái)，很多學(xué)者對(duì)不同中藥材的粗多糖含量進(jìn)行了研究[9-10]，但是針對(duì)阿膠口服液中粗多糖的研究還比較少。本研究采用沉淀蛋白質(zhì)等前處理方法，使樣品中相對(duì)分子質(zhì)量大于10 000的高分子物質(zhì)與阿膠分離，然后在體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液中沉淀，與水溶液中單糖和低聚糖分離，用苯酚-硫酸反應(yīng)，其呈色強(qiáng)度與溶液中糖的濃度成正比，在485 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定粗多糖(以葡聚糖計(jì))含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Mettler Toledo Ms十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)梅特勒公司)；恒溫水浴鍋(上海樹立儀器儀表有限公司)；TDZ5-WS離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；XK96-B渦旋混合器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司)；TU-1901紫外分光光度計(jì)(北京普析通用公司)。

1.2 試劑試藥 乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、苯酚、無(wú)水乙醇、濃硫酸，分析純；水為去離子水；乙酸鋅溶液：稱取乙酸鋅[Zn(CH3COO)2·2H2O]21.9 g，加冰乙酸3 mL，加水溶解并稀釋至100 mL；亞鐵氰化鉀溶液：稱取亞鐵氰化鉀{K4[Fe(CN)6]·3H2O}10.6 g，加水溶解并稀釋至100 mL；80%(V/V)乙醇溶液：20 mL水中加入無(wú)水乙醇80 mL，混勻；苯酚溶液(50 g·L-1)：稱取精制苯酚5.0 g，加水溶解并稀釋至100 mL，混勻，備用。

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品：相對(duì)分子量500 000，批號(hào)：BCBN7863V，購(gòu)自Sigma公司。

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的葡聚糖對(duì)照品0.5 g，加水溶解，并定容至50 mL，混勻，置冰箱中保存。此溶液1 mL含葡聚糖10 mg。

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)使用液：吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.00 mL，置100 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻，置冰箱中保存。此溶液1 mL含葡聚糖100 μg。

阿膠：某阿膠制品公司提供，和樣品來(lái)源為同一家公司。

樣品：某阿膠制品公司提供，3批編號(hào)分別為1、2、3。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液制備 精密吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)使用液0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60 mL(相當(dāng)于葡聚糖0、10、20、40、60、80、100、120、140、160 μg)，分別置于25 mL比色管中，準(zhǔn)確加水補(bǔ)充至2.0 mL，加入50 g·L-1苯酚溶液1.0 mL，在旋轉(zhuǎn)混合器上混勻，小心加入濃硫酸10.0 mL，于旋轉(zhuǎn)混合器上小心混勻，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻后用分光光度計(jì)在485 nm波長(zhǎng)處，以試劑空白為試驗(yàn)參比，1 cm比色皿測(cè)定吸光度值。以葡聚糖濃度(μg)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 樣品溶液的制備

2.2.1 試樣沉淀蛋白質(zhì)處理 取混合均勻的試樣15 mL，置250 mL容量瓶中，加水50 mL，緩慢加入乙酸鋅溶液5 mL和亞鐵氰化鉀溶液5 mL，加水至刻度，混勻，靜置30 min，用干燥濾紙過濾，取續(xù)濾液備用。

2.2.2 沉淀粗多糖 準(zhǔn)確吸取上一步濾液5 mL，置于50 mL離心管中，加入無(wú)水乙醇20 mL，混勻，置4 ℃冰箱中冷藏過夜，以4 000 rpm離心30 min，棄去上清液，殘?jiān)皿w積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，以4 000 rpm離心15 min，離心后棄上清液，反復(fù)操作2次，殘?jiān)盟芙獠⒍ㄈ葜?5 mL，混勻，此溶液為樣品測(cè)定液。

2.2.3 樣品測(cè)定 分別吸取2.0 mL樣品測(cè)定液置25 mL比色管中，加入50 g·L-1苯酚溶液1.0 mL，混勻，加入濃硫酸10.0 mL，混勻，密塞，沸水浴加熱2 min，立即冷卻至室溫得待測(cè)溶液。在485 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出葡聚糖的質(zhì)量，計(jì)算，即得樣品粗多糖含量。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程線性范圍 取標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液進(jìn)儀器測(cè)定，結(jié)果表明葡聚糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液在10.8～172.8 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，結(jié)果見表1。

表1 線性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 取樣量考察 分別量取同一批號(hào)的樣品5、10、15、25 mL各2份，按上述樣品溶液的制備方法制得待測(cè)溶液，測(cè)得葡聚糖含量分別為244.6、253.1、285.7、280.9 mg·(100 mL)-1，結(jié)果表明取樣量為15 mL時(shí)蛋白質(zhì)沉淀完全，粗多糖沉淀量適當(dāng)，樣品溶液吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中段，所以確定15 mL為取樣量。

2.5 重復(fù)性考察 精密量取同一批號(hào)混合均勻的樣品6份，按上述方法制得待測(cè)溶液，比色測(cè)定后計(jì)算葡聚糖含量，結(jié)果6份樣品葡聚糖含量的RSD為1.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 精密度考察 取制得的待測(cè)溶液，按上述方法連續(xù)測(cè)定6次吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葡聚糖含量，結(jié)果6次葡聚糖含量的RSD為0.11%，表明該方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性考察 取制得的待測(cè)溶液，按上述方法分別于比色后0、1、2、4 h測(cè)定吸光度，結(jié)果4次葡聚糖含量的RSD為0.96%，表明比色后供試品溶液在室溫條件下4 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率考察 精密量取同一批號(hào)混合均勻的樣品9份，分為3組濃度，每組濃度3份樣品，每組分別精密稱取葡聚糖對(duì)照品約18、22.5、27 mg，置250 mL容量瓶中，分別精密加入混勻的試樣7.5 mL，依法制備加標(biāo)樣品。按上述方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果平均回收率在97.1%～100.1%，表明該方法回收率好，結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.9 方法檢出限 參照GB/T 5009.1-2003《食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法理化部分總則》中附錄A.2.2規(guī)定，檢出限為3倍空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(測(cè)定次數(shù)n≥20)相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量，吸光法按國(guó)際理論與應(yīng)用化學(xué)家聯(lián)合(IUPAC)規(guī)定。檢出限按下式進(jìn)行計(jì)算：檢出限=Ks/b；b-標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中的斜率；s-20次空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；K-一般為3，結(jié)果見表3。

表3 檢出限試驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品測(cè)定

2.10.1 沉淀蛋白質(zhì)方法 精密量取3批混合均勻的樣品15 mL，按上述方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算葡聚糖含量，結(jié)果見表4。

表4 沉淀蛋白質(zhì)方法樣品測(cè)定結(jié)果

2.10.2 未沉淀蛋白質(zhì)方法 按樣品企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢測(cè)方法，精密量取3批混合均勻的樣品5 mL，置于100 mL容量瓶中，加水80 mL左右，于沸水浴上加熱2 h，冷卻至室溫后補(bǔ)加水至100 mL刻度，混勻，過濾，棄去初濾液，收集續(xù)濾液供沉淀粗多糖。沉淀粗多糖及樣品測(cè)定等步驟均同“2.2”項(xiàng)下方法，結(jié)果見表5。

表5 未沉淀蛋白質(zhì)方法樣品測(cè)定結(jié)果

由表4～5可知，未沉淀蛋白質(zhì)方法比沉淀蛋白質(zhì)方法測(cè)得的葡聚糖含量高約106 mg·(100 mL)-1，結(jié)果差異較大。為找到結(jié)果差異的原因，我們做了以下方面的研究。

2.11 含阿膠陰性空白對(duì)照溶液測(cè)定及比較 根據(jù)企業(yè)提供33 kg阿膠制成20 000支口服液(20 mL/支)的配方量，計(jì)算得口服液中阿膠濃度為82.5 mg·mL-1。為得到和樣品相同阿膠含量的陰性空白對(duì)照，本研究取阿膠，粉碎，過篩，精密稱定8.25 g，置100 mL量瓶中，加水80 mL，水浴煮沸溶解，冷卻，加水，定容至刻度，4 000 r·min-1，離心20 min，取上清液備用。

2.11.1 含阿膠沉淀蛋白質(zhì)陰性空白溶液的制備 精密量取上述上清液15 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制得樣品測(cè)定液。

2.11.2 含阿膠未沉淀蛋白質(zhì)陰性空白溶液的制備 精密量取上述上清液5 mL，按“2.10.2”項(xiàng)下方法制得樣品測(cè)定液。

將上述兩種樣品測(cè)定液按“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算葡聚糖含量，結(jié)果見表6。

表6 含阿膠陰性空白對(duì)照溶液測(cè)定結(jié)果

由表6可知，阿膠中的蛋白質(zhì)對(duì)粗多糖測(cè)定干擾顯著，未沉淀蛋白質(zhì)的樣品溶液比沉淀蛋白質(zhì)的樣品溶液測(cè)定結(jié)果高約91 mg·(100 mL)-1，這與表4～5兩種方法測(cè)定結(jié)果差值約106 mg·(100 mL)-1相吻合，驗(yàn)證了本研究采用的沉淀蛋白質(zhì)前處理方法，能夠有效去除阿膠口服液中蛋白質(zhì)對(duì)粗多糖測(cè)定的嚴(yán)重干擾。

3 討論

3.1 本研究中阿膠口服液企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的粗多糖檢測(cè)方法有提取步驟，該操作是針對(duì)固體樣品的，且長(zhǎng)時(shí)間沸水浴可能引起糖結(jié)構(gòu)變化，甚至使碳鍵斷裂而導(dǎo)致所測(cè)多糖含量偏低。阿膠口服液是均勻澄清的液體，經(jīng)驗(yàn)證本法采用沉淀蛋白質(zhì)的前處理可有效避免上述問題，且能夠有效去除蛋白質(zhì)帶來(lái)的測(cè)定干擾。

3.2 比色法測(cè)定多糖并非特異性反應(yīng)，出現(xiàn)測(cè)定結(jié)果平行偏差較大，所以試驗(yàn)中沉淀、洗滌、棄上清液、樣液的轉(zhuǎn)移等操作都要嚴(yán)謹(jǐn)，實(shí)際操作時(shí)可增加平行樣的測(cè)定[11]。