趙勝斌

(汝州市人民醫(yī)院藥械科，河南 汝州 467500)

橘核為蕓香科植物橘及其栽培變種干燥成熟種子，在我國(guó)有悠久的藥用歷史，早在五代時(shí)期的本草專著《日華子本草》中就有其應(yīng)用的相關(guān)記載[1]。該藥物味苦，平，無(wú)毒，主要用于治療膀胱氣痛、腎冷等，現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果顯示橘核具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛抗炎、抗腫瘤等作用[2-3]。對(duì)于橘核的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)從《中國(guó)藥典》1963年版至2015年版均有相關(guān)的記載，但目前橘核的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍以性狀及顯微鑒別為主，對(duì)其薄層色譜鑒別及含量測(cè)定等現(xiàn)代鑒別手段并無(wú)相關(guān)要求，已不能適應(yīng)目前的用藥要求，因此有必要對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提高以進(jìn)一步提高質(zhì)量控制水平，規(guī)范其質(zhì)量[4]。經(jīng)過(guò)多年研究發(fā)現(xiàn)，橘核內(nèi)生物活性成分以檸檬苦素、諾米林、黃柏酮為主，本研究擬采用高效液相色譜法對(duì)橘核中上述成分進(jìn)行定量分析，以期為橘核的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 采用美國(guó)安捷倫公司生產(chǎn)的1200型高效液相色譜儀(檢測(cè)器：DAD二極管陣列檢測(cè)器，色譜工作站為安捷倫公司專用工作站，四元梯度泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器)。AUW220D型十萬(wàn)分之一天平(日本島津公司)；BP121S萬(wàn)分之一天平(德國(guó)賽多利斯公司)。

1.2 試藥 檸檬苦素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110800-201707)；諾米林(赫澎生物上海科技有限公司，批號(hào):1063-77-0)；黃柏酮(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111923-201604)；乙腈、甲醇為色譜純購(gòu)自德國(guó)默克化工技術(shù)有限公司，試驗(yàn)用水為自制純化水。石油醚(60～90 ℃)、乙醚、乙醇、甲醇為分析純均購(gòu)自天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司。橘核分別購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)、廣州清平藥材市場(chǎng)、廣西玉林藥材市場(chǎng)及河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，均經(jīng)汝州市藥品檢驗(yàn)所弓西方副主任中藥師鑒定為蕓香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培變種的干燥成熟種子，詳見(jiàn)表1。

表1 橘核藥材來(lái)源

1.3 色譜條件 色譜柱：Agilent SB-C18(4.5 mm×250 mm,5 μm)，流動(dòng)相乙腈-水(64∶36)等度洗脫，柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm，流速：1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量：10 μL。

1.4 溶液的制備

1.4.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取檸檬苦素、諾米林、黃柏酮對(duì)照品適量，分別置10 mL量瓶，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到含檸檬苦素、諾米林、黃柏酮對(duì)照品分別為0.99、1.01、0.98 mg·L-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液各2 mL置入同一10 mL量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，得到檸檬苦素、諾米林、黃柏酮濃度分別為0.198、0.202、0.196 mg·L-1的混合對(duì)照品溶液。

1.4.2 供試品溶液的制備 精密稱取本品粉末0.5 g(過(guò)三號(hào)篩)，精密加入無(wú)水乙醇25 mL，超聲提取30 min，濾過(guò)、濾液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓?0 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，得到供試品溶液。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取“1.4.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、5、10、15、20 μL，分別按“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積為Y軸，對(duì)照品進(jìn)樣量為X軸進(jìn)行線性回歸，得到檸檬苦素、諾米林、黃柏酮回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各對(duì)照品回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.1.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“1.4.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)行6次測(cè)定，記錄檸檬苦素、諾米林、黃柏酮峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，檸檬苦素、諾米林、黃柏酮分別為0.65%、0.62%、0.37%。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份3號(hào)樣品粉末，每份約0.5 g，精密稱定，按“1.4.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，以“1.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行含量測(cè)定，記錄檸檬苦素、諾米林、黃柏酮峰面積，計(jì)算RSD值分別為1.26%、1.09%和1.33%。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取3號(hào)樣品粉末約0.5 g，精密稱定，按“1.4.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，在配置后0、2、4、8、12、24 h后分別按“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，記錄檸檬苦素、諾米林、黃柏酮峰面積，計(jì)算RSD值分別為0.89%、1.27%、1.03%，提示24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.1.5 定量限與檢測(cè)限考察 取“1.4.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量進(jìn)行倍比稀釋，再“1.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)行6次進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰記錄檸檬苦素、諾米林、黃柏酮峰面積。分別對(duì)定量限及檢測(cè)限進(jìn)行計(jì)算，以信噪比為10∶1時(shí)為定量限，信噪比為3∶1時(shí)為檢測(cè)限，檸檬苦素、諾米林、黃柏酮定量限分別為1.07、1.34、1.48 ng；檸檬苦素、諾米林、黃柏酮檢測(cè)限分別為0.39、0.22、0.35 ng。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品(3號(hào)樣品)6份，各0.25 g，精密稱定，分別加入一定量的檸檬苦素、諾米林、黃柏酮對(duì)照品，分別按“1.4.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，以“1.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2 樣品含量測(cè)定結(jié)果 取11批樣品，“1.4.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，以“1.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行含量測(cè)定，分別計(jì)算各批次檸檬苦素、諾米林、黃柏酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)(以干燥品計(jì))，結(jié)果見(jiàn)表4。11批樣品中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.702%、0.412%、0.072%，以均值-20%為其限度標(biāo)準(zhǔn)，暫定為橘核中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮含量不得低于0.56%、0.33%、0.06%。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 供試品制備工藝的考察 制備工藝方面因橘核為種子類藥材，含有大量的脂肪油，因此考慮先對(duì)藥材進(jìn)行脫脂處理，本研究先后對(duì)不脫脂無(wú)水乙醇超聲提取30 min、以石油醚(60～90 ℃)超聲脫脂處理30 min后棄去石油醚液再乙醇超聲30 min及乙醚超聲脫脂處理30 min后棄去乙醚液再乙醇超聲30 min，發(fā)現(xiàn)3種提取方法所提取的檸檬苦素、諾米林、黃柏酮得率RSD在3%以內(nèi)，加上節(jié)能、減排的考慮，在提取前不做脫脂處理[5-6]。在提取方法上，本研究考察了超聲、回流及高速勻漿3種提取方法，發(fā)現(xiàn)超聲與回流提取所提取的檸檬苦素、諾米林、黃柏酮得率RSD在3%以內(nèi)，故選擇超聲操作更為簡(jiǎn)便，另外高速勻漿法雖然目標(biāo)物得率有所提高，但因該方法所使用的高速勻漿儀目前國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室普及率不高，考慮到標(biāo)準(zhǔn)的普適性暫未將該提取方法納入本標(biāo)準(zhǔn)中，將來(lái)待該儀器在國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室普及率較高時(shí)可考慮使用高速勻漿法進(jìn)行提取，該方法提取效率高、操作時(shí)間短，具有較明顯的優(yōu)勢(shì)[7]。另外本研究還對(duì)提取時(shí)間、提取溶劑及料液比進(jìn)行考察，提取時(shí)間方面考察了提取10、20、30、40、60 min，發(fā)現(xiàn)在提取30 min后各目標(biāo)成分含量并無(wú)明顯上升，因此選擇30 min作為提取時(shí)間。提取溶劑方面考察了二氯甲烷、無(wú)水乙醇、甲醇，發(fā)現(xiàn)無(wú)水乙醇提取效率高且毒性小，料液比方面在1∶50時(shí)提取效率最高，隨后料液比升高目標(biāo)物得率并無(wú)明顯上升。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 取檸檬苦素、諾米林、黃柏酮對(duì)照品溶液，以DAD檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)檸檬苦素、諾米林、黃柏酮最大吸收峰波長(zhǎng)分別為210、211、214 nm，分別選擇上述波長(zhǎng)下色譜圖分析發(fā)現(xiàn)在210 nm時(shí)各色譜峰分離效果最佳，理論塔板數(shù)較高，故選作本次研究的測(cè)定波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的選擇 流動(dòng)相方面在查閱文獻(xiàn)[8-9]的基礎(chǔ)上本研究先對(duì)甲醇-水(62∶38)、乙腈-水(62∶38)進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)乙腈-水系統(tǒng)色譜峰峰形更尖銳，理論塔板數(shù)更高，故選擇該系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，在乙腈-水(64∶36)時(shí)分離效果最佳，對(duì)照品及供試品均可在15 min完成檢測(cè)。另外本研究還對(duì)不同品牌液相色譜儀及色譜柱進(jìn)行分析，結(jié)果顯示具有較高的重現(xiàn)性。

橘核具有理氣、散結(jié)、止痛的功效，臨床上常用于治療疝氣疼痛、睪丸疼痛等疾病，臨床應(yīng)用較多[10]。但目前現(xiàn)行的《中國(guó)藥典》2015年版中橘核的指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)僅收載性狀及顯微鑒別方法，對(duì)其含量并未作要求。本研究開(kāi)發(fā)的中藥橘核中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮高效液相色譜含量測(cè)定方法，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性高，穩(wěn)定性、精密性良好，可用于提高橘核質(zhì)量評(píng)價(jià)。