杜秀云 賽米·賽麥提 趙新勝 李贊林 李義亮

前 言

非糜爛性反流?。╪on?erosive reflux disease，NERD）是胃食管反流?。╣astroesoghageal reflux disease，GERD）當(dāng)中最常見(jiàn)的類(lèi)型，在GERD的發(fā)病率中占約70%；且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并對(duì)公共衛(wèi)生事業(yè)提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[1?3]。研究發(fā)現(xiàn)，NERD發(fā)病的重要病理生理機(jī)制與食管內(nèi)臟高敏感（viceral hypersensitivity，VH）相關(guān)，且目前其治療依賴(lài)于質(zhì)子泵抑制劑。但對(duì)部分NERD患者反流癥狀療效不佳，推測(cè)VH是NERD患者質(zhì)子泵抑制劑療效差的重要原因之一[4]。神經(jīng)肽類(lèi)物質(zhì)如P物質(zhì)（substance P，SP）和降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene?related peptide，CGRP）在NERD患者食管黏膜表達(dá)明顯增加，且與疼痛感覺(jué)閾值呈明顯負(fù)相關(guān)，推測(cè)SP和CGRP可能共同參與了NERD VH的外周機(jī)制[5]。

據(jù)研究報(bào)道，SP及白細(xì)胞介素?6（Interleukin?6，IL?6）的釋放有促炎性作用而使神經(jīng)興奮性增高引起感覺(jué)過(guò)敏，進(jìn)而形成神經(jīng)源性炎癥，該現(xiàn)象被稱(chēng)為傳人神經(jīng)的傳出功能，其可能是SP參與NERD食管VH性形成的重要機(jī)制之一[6]。近年來(lái)，研究神經(jīng)肽與NERD VH的相互關(guān)系成為熱點(diǎn)。本課題通過(guò)研究NERD患者和健康受試者食管粘膜層和血液中SP、CGRP的表達(dá)情況以及炎癥因子表達(dá)及分布情況，探討SP、CGRP以及炎癥因子在NERD發(fā)生發(fā)展中的作用。

資料與方法

一、一般資料

收集2018年10月至2019年4月間在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院住院就診的NERD患者25例和健康受試者10例。所有研究對(duì)象中：男性22例（68%），女性13例（32%），正常對(duì)照組和NERD組年齡平均數(shù)分別為29.52歲和33.65歲。所有研究對(duì)象均進(jìn)行GerdQ問(wèn)卷調(diào)查、24 h食管pH監(jiān)測(cè)、上消化道內(nèi)鏡等檢查。本研究經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院住院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬對(duì)本研究的目的及意義均充分知情，且簽署了知情同意書(shū)。

二、納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18～65歲；（2）存在典型的胃食管反流癥狀，并至少持續(xù)3個(gè)月以上，或合并有食管外表現(xiàn)；（3）胃鏡檢查陰性；（4）質(zhì)子泵抑制劑試驗(yàn)陽(yáng)性；（5）知情同意者。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）內(nèi)鏡下胃、十二指腸潰瘍（無(wú)論活動(dòng)期或靜止期），糜爛性十二指腸炎；（2）內(nèi)鏡下消化道腫瘤；（3）有上消化道手術(shù)史；（4）知情不同意者。

三、檢測(cè)指標(biāo)

1.食道測(cè)酸：應(yīng)用24 h食管pH監(jiān)測(cè)GERD嚴(yán)重程度是應(yīng)用電極檢測(cè)患者24 h食管pH，遠(yuǎn)端電極置于食管下括約肌線(xiàn)上20 cm，近端電極置于食管下括約肌線(xiàn)上5 cm，測(cè)定患者24 h pH＜4的總百分時(shí)間（總酸暴露時(shí)間），pH＜4的次數(shù)（酸暴露頻率），持續(xù)5 min以上的反流次數(shù)和最長(zhǎng)反流時(shí)間，分析DeMeester評(píng)分，評(píng)價(jià)GERD嚴(yán)重程度。

2.食管測(cè)壓：運(yùn)用高分辨率食管測(cè)壓分析食管下段括約肌（lower esopheagel sphincter，LES）長(zhǎng)度、LES靜息壓、LES殘余壓、收縮前沿速度、食團(tuán)內(nèi)部壓力及食管遠(yuǎn)端收縮積分等指標(biāo)。

四、組織標(biāo)本處理

要求各組患者簽署知情同意文件，收集各組患者食管粘膜組織標(biāo)本，置于-80℃冰箱備用。同步采集病人的清晨空腹血液3 ml，離心取血清，置于-20℃或-80℃冰箱備用。

五、組織病理學(xué)檢查

食管組織標(biāo)本4%中性甲醛固定24 h后水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，制成5 μm厚切片行H&E染色。

六、定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription?Polymerase Chain Reaction，RT?PCR）

采用實(shí)時(shí)定量RT?PCR方法檢測(cè)SP、CGRP、白細(xì)胞介素?1β（Interleukin?6，IL?1β）、IL?6、干擾素?α（Interferon?α，IFN?α）、及腫瘤壞死因子?α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）的表達(dá)。每例組織標(biāo)本置于TRIzol試劑（LIFE公司生產(chǎn)）提取總RNA，采用Fast Quant RT試劑盒（Foregene公司生產(chǎn)）合成第一鏈cDNA。由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成引物，各指標(biāo)及GAPDH引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。RT?PCR反應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。實(shí)時(shí)定量RT?PCR，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為95℃2 min，然后95℃20 s，60℃20 s，72℃20 s，共40循環(huán)。采用2—△△CT計(jì)算出各組目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。

表1 定量RT?PCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

七、統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間計(jì)量資料比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩組間計(jì)數(shù)資料比較采用方差分析及χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、本研究病例的一般情況

經(jīng)過(guò)對(duì)研究對(duì)象的臨床表現(xiàn)，GERDQ評(píng)分及內(nèi)鏡檢查，研究對(duì)象分為NERD組和正常對(duì)照組。表2表示，性別、年齡以及體質(zhì)量指數(shù)（Body mass index，BMI）等一般情況在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.232，P＞0.05）、（t=2.143，4.895；P＞0.05）。

表2 各組患者一般情況的比較

二、食管酸反流分析結(jié)果

如表3所示，食管24 h pH監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，NERD組患者弱酸反流（4＜pH＜7）次數(shù)、酸反流（pH≤4）次數(shù)、食管近端酸反流及DeMeester評(píng)分等指標(biāo)明顯高于對(duì)照組，兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 兩組GERD患者24 h食管酸反流的比較

三、高分辨率食管測(cè)壓

食道高分辨率觀測(cè)結(jié)果顯示，NERD組和對(duì)照組食管下段括約肌LES長(zhǎng)度、LES靜息壓、LES殘余壓、收縮前沿速度、食團(tuán)內(nèi)部壓力及食管遠(yuǎn)端收縮積分等指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)表4）。

表4 NERD組和對(duì)照組食管動(dòng)力學(xué)比較

四、組織學(xué)特點(diǎn)

鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組粘膜組織形態(tài)基本完整，未見(jiàn)水腫或免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)。NERD組食管黏膜可見(jiàn)中性粒細(xì)胞（以箭頭所示）的浸潤(rùn)和炎癥前反應(yīng)（圖1A）。組織炎癥評(píng)分顯示（圖1B），NERD組食管粘膜的炎癥損傷評(píng)分明顯高于對(duì)照組，P值0.003，兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 兩組食管粘膜組織H&E染色及炎癥評(píng)分比較A示兩組食管組織H&E染色（10×40）；B示兩組食管炎癥評(píng)分比較；**P＜0.01 vs對(duì)照組

五、食管粘膜SP和CGRP表達(dá)的結(jié)果

兩組食管粘膜組織RT?PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NERD組SP及CGRP的mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著上升，P值分別為0.0046，0.002，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

六、食管粘膜炎癥因子

IL?1β、IL?6、IFN?γ、TNF?α等炎癥因子指標(biāo)的RT?PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NERD組食管粘膜中，IL?1β、IL?6、IFN?γ以及TNF?α的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增高，P值分別為0.0034，0.0043，0.004，0.0028，兩組間比較具有明顯地統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 兩組食管粘膜組織SP及CGRP的mRNA表達(dá)**P＜0.01 vs對(duì)照組

七、相關(guān)性分析

通過(guò)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，NERD組酸反流評(píng)分（DeMeester）分別與SP、CGRP及炎癥因子（IL?1β、IL?6、IFN?γ、TNF?α）的mRNA表達(dá)之間有強(qiáng)相關(guān)性，P值分別為0.003，0.000，0.002，0.005，0.004，0.000，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.96、0.95、0.91、0.98。

圖3 兩食管粘膜組織炎癥因子的mRNA表達(dá)**P＜0.01 vs對(duì)照組

討 論

NERD患者典型的燒心、反流、胸痛癥狀和其內(nèi)鏡下觀察食管黏膜病變陰性的特征，表明了在既往已知的GERD發(fā)病機(jī)制，如抗返流屏障功能降低、食管清除功能障礙、胃排空延遲之外另有他因[7]。近年來(lái)，隨著對(duì)NERD研究的不斷發(fā)展，VH在NERD發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸被重視，被認(rèn)為是可以解釋產(chǎn)生燒心的病理生理機(jī)制和致使食管黏膜VH相關(guān)的神經(jīng)肽（如SP、CGRP）也漸漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[8]。有研究證實(shí)，神經(jīng)肽類(lèi)物質(zhì)SP、CGRP引起VH的過(guò)程中，食管黏膜中炎癥因子出現(xiàn)了高表達(dá)的現(xiàn)象[9]。

GERD癥狀的產(chǎn)生除了與反流物的酸性程度及其量有關(guān)外，還可能與食管VH的產(chǎn)生有關(guān)。食管VH的產(chǎn)生機(jī)制尚不明確，可能與多種離子通道或相關(guān)受體表達(dá)的變化有關(guān)[10]。瞬時(shí)電位香草酸亞型1和蛋白酶激活受體2（Protease?activated receptor，PAR?2）作為兩種重要的酸敏感受體，可能與食管VH的產(chǎn)生有關(guān)[11]。研究組的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同亞型GERD患者食管組織中瞬時(shí)電位香草酸亞型1和PAR?2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均明顯強(qiáng)于正常組，且其mRNA的表達(dá)水平在GERD組患者中呈高表達(dá)，并由瞬時(shí)電位香草酸亞型1和PAR?2介導(dǎo)的VH產(chǎn)生機(jī)制中，PAR?2可能處于主導(dǎo)作用[12?15]。

研究發(fā)現(xiàn)，在功能性消化不良疾病的研究中提出CGRP和SP參與消化道VH發(fā)病機(jī)制[16]。CGRP和SP是食管痛覺(jué)產(chǎn)生及傳導(dǎo)的兩種重要物質(zhì)，CGRP可以抑制與SP降解有關(guān)的內(nèi)肽酶，使SP的作用增加或延長(zhǎng)，兩者在疼痛信息傳遞中可能存在協(xié)同作用[17]。高云等[18]通過(guò)測(cè)定NERD組及健康對(duì)照組血清CGRP和SP的含量并與GerdQ評(píng)分進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)NERD患者血清CGRP和SP表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組；且CGRP和SP表達(dá)與GerdQ評(píng)分呈正相關(guān)。因此，推測(cè)CGRP和SP可能在NERD VH的發(fā)病機(jī)制起重要作用。本研究，通過(guò)對(duì)NERD和正常組之間食管黏膜CGRP和SP含量對(duì)比分析的研究發(fā)現(xiàn)，NERD患者食管黏膜中CGRP和SP的含量和正常人組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，我們有理由推測(cè)CGRP和SP在食管黏膜中的過(guò)度表達(dá)可能和NERD患者VH有關(guān)。

CGRP和SP通過(guò)炎癥反應(yīng)參與到VH的過(guò)程中，食管黏膜末梢神經(jīng)接受化學(xué)物質(zhì)或機(jī)械擴(kuò)張刺激后，CGRP和SP在食管黏膜中的過(guò)度表達(dá)，同時(shí)伴隨著炎癥因子的大量堆積，引起局部炎癥反應(yīng)[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，NERD患者在食管黏膜中和血清中的炎癥因子IL?1β、IL?6、IL?8和TNF?α水平、炎癥密切相關(guān)的PAR?2、環(huán)氧合酶?2均明顯高于正常人組[20]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，NERD患者食管下段粘膜組織中SP、CGRP及促炎因子（IL?1β、IL?6、IFN?γ以及TNF?α）的mRNA表達(dá)水平顯著上升，并且與酸反流評(píng)分（DeMeester）存在正相關(guān)關(guān)系。這可能是酸反流可直接激活食管組織中神經(jīng)肽類(lèi)物質(zhì)和炎癥因子，從而引起VH和炎癥的作用機(jī)制。至于神經(jīng)肽物質(zhì)、炎癥因子、VH性之間的如何互相影響并最終導(dǎo)致NERD的發(fā)生發(fā)展，仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究加以證實(shí)。

綜上所述，疼痛感覺(jué)的產(chǎn)生需要神經(jīng)末梢感受器感受到相關(guān)物理或化學(xué)刺激產(chǎn)生神經(jīng)信號(hào)，途徑各級(jí)神經(jīng)突觸傳導(dǎo)到大腦中樞神經(jīng)處理相關(guān)刺激信號(hào)并作出疼痛感應(yīng)。所有參與信號(hào)傳導(dǎo)的各個(gè)環(huán)節(jié)均有可能影響NERD患者常見(jiàn)燒心的感覺(jué)。臨床研究同樣證實(shí)了NERD和焦慮之間有明顯的關(guān)聯(lián)，已經(jīng)證明，焦慮和抑郁的程度越高，酸抑制療法的效果越差，因此，心理因素可以用作抗返流治療的預(yù)測(cè)指標(biāo)。[39?41]因此未來(lái)的相關(guān)研究需把精神因素考慮作為相關(guān)指標(biāo)十分必要。NERD和精神疾病互為因果的關(guān)系商不得而知，但這些研究提醒我們中樞神經(jīng)的異常亦有可能影響相關(guān)癥狀的產(chǎn)生，例如Martinez等研究提到的與反流無(wú)關(guān)的患者，其癥狀與胃酸反流無(wú)關(guān)，但與其它形式的反流或心理因素有關(guān)，約占NERD患者的32.0%。同樣有研究指出，在大腦皮層層面或是脊髓神經(jīng)亦或是周?chē)┥疑窠?jīng)層面的病變，均有可能影響或引起內(nèi)臟高敏感性。鑒于實(shí)驗(yàn)的倫理道德，目前絕大部分研究關(guān)注點(diǎn)都只在食管黏膜的病變，尚未有涉及從感受器傳入神經(jīng)再到中樞神經(jīng)整條反應(yīng)線(xiàn)路的研究，因此NERD發(fā)病機(jī)制的探索注定艱辛曲折。但即便是一小步的探索發(fā)現(xiàn)，亦有可能為眾多對(duì)PPI治療無(wú)效的NERD患者提供新的藥物研發(fā)思路。本次研究可能具有重大的臨床意義，在臨床實(shí)踐中我們應(yīng)更加注意內(nèi)臟高敏感性，尤其是對(duì)于酸抑制療法反應(yīng)較差的患者。此外，應(yīng)研究新的NERD治療方法，這些藥物可以靶向刺激知覺(jué)鏈的每個(gè)組成部分，包括神經(jīng)遞質(zhì)的新激動(dòng)劑/拮抗劑，例如被SP激活的CGRP受體。能夠降低超敏反應(yīng)的藥物可能具有治療功能性疾?。ㄈ鏝ERD）的潛力。