劉溯源 海思嬈 王 鑫 徐文寧 伍 亮 汪 寅 姚 利 張志強(qiáng)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥，230036)

選擇適用于脊椎動(dòng)物研究使用的免疫學(xué)參數(shù)，是新興學(xué)科-免疫生態(tài)學(xué)(immunological ecology)需要解決的主要問題之一[1-3]。血液成分和血細(xì)胞的數(shù)量動(dòng)態(tài)與脊椎動(dòng)物免疫功能的變化有關(guān)[4]，盡管這些指標(biāo)易受外界環(huán)境條件及自身身體狀態(tài)的影響，但若能在嚴(yán)格受控的環(huán)境條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，仍不失為比較研究的好方法之一[3-5]。研究表明，變態(tài)前后兩棲動(dòng)物血液中各型白細(xì)胞的百分比具有可塑性(plasticity)[5-6]，但對(duì)爬行動(dòng)物免疫功能的發(fā)育可塑性，仍所知甚少[7-9]，多集中于成體蛇物種間各型白細(xì)胞的百分比和紅細(xì)胞大小的比較研究[10-15]。蛇類中，除對(duì)陸生的30日齡內(nèi)的王錦蛇(Elaphecarinata)[7]和50日齡內(nèi)的滑鼠蛇(Ptyasmucosus)[8]各型白細(xì)胞的百分比，以及食物蛋白濃度對(duì)王錦蛇生長(zhǎng)和血液學(xué)參數(shù)的影響做過研究外[9]，尚無(wú)關(guān)于蛇類免疫功能發(fā)育生物學(xué)方面的研究。

蛇類普遍有耐受極端環(huán)境條件的能力，是研究表型可塑性(phenotypic plasticity)理論的理想動(dòng)物類群之一[16-17]。赤鏈華游蛇(Sinonatrixannularis)又名水赤鏈等，是華東及華南地區(qū)稻田、池塘、溪流等水域及其附近常見的一種中型游蛇，白天活動(dòng)，吃魚，也食蛙類及蝌蚪，卵胎生，懷仔蛇量8—28個(gè)，9月前后產(chǎn)仔蛇10條左右(3—14條)[18]。目前，大多數(shù)研究與胚胎發(fā)育[19]及成蛇的形態(tài)、生理等有關(guān)[20-22]，對(duì)出生后各器官大小和血液學(xué)參數(shù)的可塑性變化仍未見研究。出殼或產(chǎn)出后1—2個(gè)月通常是幼蛇成活的關(guān)鍵階段，涉及出生、第一次蛻皮和開口等生活史過程[23]。本研究以室內(nèi)產(chǎn)出的赤鏈華游蛇幼蛇為研究對(duì)象，對(duì)出生后3、7—10(第一次蛻皮)、20、30、40和50 d的幼蛇，分別測(cè)定了重長(zhǎng)比、脾臟濕重指數(shù)、血液學(xué)參數(shù)和各型白細(xì)胞百分比的變化，旨在建立出生后特定生活史階段與免疫功能建立的對(duì)應(yīng)關(guān)系，豐富爬行動(dòng)物免疫生態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物來源與分組

試驗(yàn)用9條懷孕母蛇，于2018年9月購(gòu)自安徽省池州市貴池區(qū)某蛇場(chǎng)，暫養(yǎng)于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物生理生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，每個(gè)飼養(yǎng)箱(48.0 cm×30.0 cm×30.0 cm)飼養(yǎng)一條母蛇。9條母蛇共產(chǎn)9窩幼蛇，每窩8—14條，同一窩幼蛇飼養(yǎng)于爬寵用亞克力盒子(26.0 cm×17.5 cm×12.5 cm)，盒內(nèi)置小木板，供幼蛇上陸棲息，水為曝氣24 h以上的自來水?？照{(diào)和加熱棒分別控制室溫和水溫，使水溫穩(wěn)定在(29±1)℃。首次蛻皮后，喂食解凍后剪成小條狀的小塊鯽魚肉，方便幼蛇進(jìn)食，每2 d喂食一次。在幼蛇出生后3 d、首次蛻皮，以及開口后10、20、30和40 d，每窩隨機(jī)取幼蛇1條，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取幼蛇8條，6個(gè)時(shí)間點(diǎn)共取樣48條幼蛇，測(cè)量體重、體長(zhǎng)和尾長(zhǎng)后，斷頭處死，采集血液。

1.2 血液學(xué)參數(shù)的測(cè)定

血紅蛋白含量采用改良的沙利氏法通過血紅蛋白計(jì)(泰州市姜堰區(qū)匯虹實(shí)驗(yàn)儀器廠)測(cè)定[24]，即在比色管中先加入400 μL 1.1 mol/L HCl，再加入5 μL血液混勻至呈黃褐色，靜置10 min后，用蒸餾水稀釋，與標(biāo)準(zhǔn)色比色，用標(biāo)準(zhǔn)色的絕對(duì)值表示血紅蛋白含量。

紅細(xì)胞總數(shù)和白細(xì)胞總數(shù)測(cè)定簡(jiǎn)述如下[24]：取995 μL的0.9%氯化鈉溶液作為紅細(xì)胞稀釋液，加入5 μL血液混勻；另取10 μL血液，加入190 μL的白細(xì)胞稀釋液(冰醋酸1.5 mL，1%龍膽紫1 mL，蒸餾水定容至100 mL)，混勻。各取混勻后的紅細(xì)胞和白細(xì)胞混合液各10 μL，充入血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)池與蓋玻片的縫隙中，靜置2—3 min后，待細(xì)胞下沉后，鏡檢觀察并計(jì)數(shù)。紅細(xì)胞數(shù)總數(shù)=N×50×106×200=N× 1010，式中N為四角及中間各16個(gè)中方格內(nèi)的紅細(xì)胞總數(shù)；白細(xì)胞數(shù)總數(shù)=四角各16個(gè)中方格內(nèi)的白細(xì)胞總數(shù)×10×20×106/4。

1.3 血涂片制作和各型白細(xì)胞百分比的測(cè)定

移取約20 μL血液，制作2張血涂片。通過南京建成生物工程有限公司生產(chǎn)的快速瑞姬氏染液(產(chǎn)品編號(hào)：D010)處理血涂片，參照孫嘉珞等[7]和張志強(qiáng)等[8]描述的操作步驟，用智能血球分類計(jì)數(shù)器(姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：TL-2000A)計(jì)數(shù)每張血涂片中嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的總數(shù)至100個(gè)為止，計(jì)算各型白細(xì)胞占白細(xì)胞總數(shù)的百分比，以2張血涂片各型白細(xì)胞的平均值表示每條幼蛇各型白細(xì)胞占白細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 19.0 for windows進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。用單因素方差分析(one-way ANOVA)及多重比較(multiple comparisons)統(tǒng)計(jì)不同發(fā)育階段赤鏈華游蛇重長(zhǎng)比、脾臟濕重指數(shù)、血紅蛋白含量、經(jīng)常用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的紅細(xì)胞總數(shù)和白細(xì)胞總數(shù)、各型白細(xì)胞的百分比及嗜中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比值(ratio of neutrophils to lymphocyte，N/L的比值)的組間差異。文中數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 50日齡內(nèi)赤鏈華游蛇重長(zhǎng)比和脾臟濕重指數(shù)的變化

由表1所示，赤鏈華游蛇的重長(zhǎng)比3和7—10日齡組顯著高于30、40和50日齡組(P<0.05)，脾臟濕重指數(shù)7—10日齡組顯著高于40和50日齡組(P<0.05)。

2.2 50日齡內(nèi)赤鏈華游蛇血液學(xué)參數(shù)的變化

由表1所示，血紅蛋白含量30日齡組與40和50日齡組均無(wú)顯著差異，3日齡組最低，30日齡組顯著高于3、7—10和20日齡組(P<0.05)。經(jīng)常用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，紅細(xì)胞總數(shù)不隨日齡而變化(P>0.05)，白細(xì)胞總數(shù)20日齡組與30日齡組接近，但顯著高于3、7—10、40和50日齡組(P<0.05)。

2.3 50日齡內(nèi)赤鏈華游蛇各型白細(xì)胞的百分比的變化

由表1所示，淋巴細(xì)胞的百分比和嗜堿性粒細(xì)胞的百分比占比居于前兩位。淋巴細(xì)胞的百分比7—10日齡組顯著高于30日齡組，30日齡組又顯著高于50日齡組(P<0.05)。嗜堿性粒細(xì)胞的百分比40日齡組顯著高于7—10和20日齡組(P<0.05)。嗜中性粒細(xì)胞的百分比7—10和20日齡組均顯著高于50日齡組(P<0.05)。嗜酸性粒細(xì)胞的百分比50日齡組顯著高于3、7—10、20和30日齡組(P<0.05)。單核細(xì)胞的百分比50日齡組顯著高于其他日齡組(P<0.05)。N/L的比值無(wú)明顯的日齡差異(P>0.05)。

表1 赤鏈華游蛇重長(zhǎng)比、脾臟濕重指數(shù)、血液學(xué)參數(shù)和各型白細(xì)胞的百分比的變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab.1 Changes of the ratio of body mass to total body length，spleen wet mass index，hematological parameters and different subtypes of leukocyte in Sinonatrix annularis(mean±SEM)

3 討論

3.1 不同發(fā)育階段赤鏈華游蛇重長(zhǎng)比和脾臟濕重指數(shù)的變化

重長(zhǎng)比是指示蛇體健康狀態(tài)的重要指標(biāo)[7-9，25]，赤鏈華游蛇開口前主要依賴出生后體內(nèi)積累的脂肪來保證存活，因此從出生至開口前重長(zhǎng)比急速下降，但在開口攝食后趨于穩(wěn)定的低水平。理論上，主動(dòng)攝食后，隨著營(yíng)養(yǎng)水平的提高，重長(zhǎng)比應(yīng)快速上升[25]。例如，滑鼠蛇生后3、7—10、20、30、40和50日齡，重長(zhǎng)比3—20日齡增長(zhǎng)緩慢，之后陡增，50日齡最高[8]。赤鏈華游蛇雖然終生生長(zhǎng)，但50日齡內(nèi)生長(zhǎng)較緩慢，重長(zhǎng)比表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。這可能與兩方面的原因有關(guān)：一是本研究投喂的是冰凍后又解凍的鯽魚肉，幼蛇雖有攝食，但并非是其最喜好的食物；二是50 d的處理時(shí)間偏短，赤鏈華游蛇對(duì)非鮮活食物需要較長(zhǎng)時(shí)間的適應(yīng)過程。野外條件下，赤鏈華游蛇主要靠攝食小魚或蝌蚪來補(bǔ)充能量[18]。

變溫脊椎動(dòng)物中，脾臟濕重指數(shù)不受季節(jié)[26-27]等環(huán)境因素的影響，但在鳥類中可用于指示其機(jī)能狀態(tài)[28]。赤鏈華游蛇首次蛻皮后的脾臟濕重指數(shù)顯著高于40和50日齡組，這與脊椎動(dòng)物的淋巴器官大小隨年齡增加而趨于萎縮的趨勢(shì)一致。

3.2 赤鏈華游蛇血液學(xué)參數(shù)和各型白細(xì)胞的發(fā)育可塑性

赤鏈華游蛇血紅蛋白含量30日齡時(shí)最高，與40和50日齡組接近，但顯著高于3、7—10和20日齡組，而紅細(xì)胞總數(shù)未見日齡差異。血紅蛋白是紅細(xì)胞的主要成分，由珠蛋白和血色素組成，能與氧結(jié)合，運(yùn)輸氧和二氧化碳，臨床上可作為反映身體貧血程度的一個(gè)指標(biāo)[5]。赤鏈華游蛇首次蛻皮后開始主動(dòng)攝食，活動(dòng)加強(qiáng)，隨日齡而增加的血紅蛋白含量有助于滿足日益增加的能量代謝需求、抵御不良環(huán)境條件的侵襲。

赤鏈華游蛇的白細(xì)胞總數(shù)在開口攝食后10和20 d時(shí)顯著增加，各型白細(xì)胞的百分比隨發(fā)育進(jìn)程動(dòng)態(tài)波動(dòng)。其中，嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的百分比均在首次蛻皮和/或開口攝食后增加，而嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的百分比卻降低，N/L的比值未見明顯的日齡差異。研究表明，成蛇血液中各型白細(xì)胞的百分比不但具有物種特異性，而且易于受外界環(huán)境條件和蛇類自身生理狀態(tài)的影響[10-15]。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)格受控的環(huán)境條件下，30日齡內(nèi)的王錦蛇在出殼后血液中就已存在不同類型的白細(xì)胞，20日齡內(nèi)單核細(xì)胞的百分比下降，嗜酸性粒細(xì)胞的百分比明顯增加，這可能與開口后的食物刺激有關(guān)，也可能與王錦蛇幼蛇喜好彼此撕咬的生物學(xué)習(xí)性有關(guān)[7]；50日齡內(nèi)的滑鼠蛇淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的百分比占比居前兩位，但兩者的百分比及N/L的比值均無(wú)組間差異；嗜堿性粒細(xì)胞的百分比7—10日齡組與3日齡組接近，但7—10日齡組高于其他日齡組[8]。王錦蛇和滑鼠蛇都是適于人工養(yǎng)殖的陸生無(wú)毒蛇，兩種蛇也都在出殼后就發(fā)育出完善的各型白細(xì)胞，這與赤鏈華游蛇相同，提示蛇類在出生前免疫系統(tǒng)可能就已建立[7-8]。此外，與滑鼠蛇相同，赤鏈華游蛇N/L的比值也不隨發(fā)育階段而大幅度波動(dòng)，說明該比值并不能準(zhǔn)確反映蛇體的應(yīng)激狀態(tài)[8]。然而，出生后早期階段赤鏈華游蛇、王錦蛇和滑鼠蛇血液中各型白細(xì)胞的百分比的變化模式迥異，提示由于生活環(huán)境、食性等方面的差異，出生、首次蛻皮和開口時(shí)間早晚對(duì)多種蛇類的生活史過程可能會(huì)有完全不同的影響[7-8]。

4 結(jié)論

赤鏈華游蛇重長(zhǎng)比和脾臟濕重指數(shù)均隨發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)而下降，白細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白含量、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞均在首次蛻皮和/或開口攝食后數(shù)量較多，其他類型的白細(xì)胞數(shù)量較少，但紅細(xì)胞總數(shù)和N/L的比值無(wú)組間差異，說明赤鏈華游蛇在出生后的發(fā)育早期就已建立起較為完善的免疫功能，在耗能較多的蛻皮、開口攝食等生活史階段，能通過調(diào)整白細(xì)胞總數(shù)、各型白細(xì)胞的比例來適應(yīng)特定階段的營(yíng)養(yǎng)和能量需求，促進(jìn)幼蛇快速生長(zhǎng)。