侯東敏 賈 婷 章 迪 諶立新 王政昆 朱萬(wàn)龍，3，4*

(1.云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動(dòng)植物生態(tài)適應(yīng)進(jìn)化及保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明，650500；2.云南經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，昆明，650106；3.生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心，昆明，650500；4.云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明，650500)

化學(xué)通訊交流在動(dòng)物的生殖和社會(huì)行為中起著重要的作用，包括性吸引[1]、性沖動(dòng)[2]、領(lǐng)域標(biāo)記[3]以及個(gè)體識(shí)別[4]等。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，借助氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)動(dòng)物化學(xué)通訊中尿液、血液或腺體分泌物化學(xué)成分的分析已成為研究熱潮[5-6]。

尿液是動(dòng)物化學(xué)通訊中傳遞信息的重要途徑之一。動(dòng)物尿液中的許多低分子量的化學(xué)成分可以通過(guò)嗅覺(jué)器官被感知，從而引起特定的行為反應(yīng)[7-8]。嚙齒類動(dòng)物尿液中含有較多的信息素，如3-乙基-2，7-二甲基辛烷(3-ethyl-2，7-dimethyl octane)是一種雄性小家鼠(Musmusculus)中特有的化學(xué)成分，具有釋放信息素的作用，其產(chǎn)生受雄性激素控制[9]；戊醛到癸醛的脂肪族醛作為小鼠氣味成分而被其主要嗅覺(jué)器官感知，因此這些成分可能對(duì)小鼠同種群個(gè)體識(shí)別具有重要作用[10]；小鼠尿液中的6-羥基-6-甲基-3-庚酮(6-hydroxy-6-methyl-3-heptanone)是一種獨(dú)特成分，它能夠加速雌性小鼠的青春期[11]；小鼠尿液中還含有諸如年齡[12]、健康[13]、繁殖[14]及親屬和個(gè)體識(shí)別[15]等大量信息。哺乳動(dòng)物的尿液成分較為復(fù)雜，如大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)可以通過(guò)尿液進(jìn)行親緣識(shí)別，避免近親交配[16]；獅(Pantheraleo)雄性尿液中2-丁酮(2-butanone)的相對(duì)含量顯著高于雌性，而雌性丙酮(acetone)的相對(duì)含量顯著于雄性[17]；短尾貓(Lynxrufus)的尿液能夠減少土撥鼠的氣味標(biāo)記活動(dòng)，而且能夠減少美洲兔(Lepusamericanus)和黑尾鹿(Odocoileushemionus)的攝食行為[18]。動(dòng)物尿液中包含許多重要信息，對(duì)于其他物種或者同種群個(gè)體都是化學(xué)感知的豐富來(lái)源。

動(dòng)物常通過(guò)將尿液、糞便或腺體分泌物遺留于環(huán)境中來(lái)進(jìn)行個(gè)體信息的交互響應(yīng)，但這種社會(huì)活動(dòng)往往受到遺傳和空間距離的影響[19]。通過(guò)對(duì)小鼠尿液與遺傳相關(guān)性的研究表明，小鼠尿液揮發(fā)性成分的相對(duì)豐度與遺傳相關(guān)性程度有關(guān)，這一關(guān)系可能在該物種的化學(xué)信號(hào)傳遞和遺傳特性中起到關(guān)鍵作用[20]。同樣親緣關(guān)系和空間距離對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠(Merionesunguiculatus)的尿標(biāo)記行為具有一定影響，這與長(zhǎng)爪沙鼠的繁殖或貯食行為相適應(yīng)[21]。因此尿液揮發(fā)性成分可以提供有關(guān)遺傳相關(guān)性的嗅覺(jué)信息，并作為表型匹配的遺傳標(biāo)識(shí)符。

中緬樹鼩(Tupaiabelangeri)屬攀鼩目(Scandentia)，樹鼩科(Tupaiidae)，分布于南亞、東南亞以及中國(guó)南部和西南部地區(qū)，為東洋界特有的晝行性小型哺乳動(dòng)物[22]。因其在生物學(xué)特征及生理生化等方面與人類較為相近，已被用作非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的替代模型廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究[23]。本研究通過(guò)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)野外親屬中緬樹鼩的尿液化學(xué)成分進(jìn)行測(cè)定，旨在探索尿液對(duì)野外中緬樹鼩的作用，為揭示中緬樹鼩的通訊機(jī)制提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

動(dòng)物樣本采集于昆明市海口林場(chǎng)，共捕捉成體42只，捕捉后采集動(dòng)物樣本糞便，低溫保存，溫度為(-20±1)℃。采集動(dòng)物樣本糞便，提取糞便DNA，選擇高度多態(tài)性的微衛(wèi)星引物擴(kuò)增并進(jìn)行測(cè)序，所得結(jié)果采用Cervus 3.0軟件進(jìn)行親緣關(guān)系模擬鑒定，檢測(cè)得到具親緣關(guān)系共計(jì)16只成年個(gè)體(9♀∶7♂)，分為A、B、C、D、E共5組，5組之間的動(dòng)物個(gè)體無(wú)親緣關(guān)系，組內(nèi)個(gè)體具有親緣關(guān)系。所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在昆明市?？诹謭?chǎng)飼養(yǎng)房?jī)?nèi)飼養(yǎng)。

1.2 尿液采集

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食12 h后放入尿液采集籠中，采集籠下端放置漏斗及12 mL樣品瓶(寧波哈邁，HM-1266A)；漏斗內(nèi)部放置薄脫脂棉以防糞便污染；尿液收集時(shí)間為10 min，收集完成后迅速使用封口膜密封瓶口，并置于-20℃密封避光保存。

1.3 尿液樣品前處理

使用固相微萃取法進(jìn)行尿液樣品吸附處理[24]：(1)萃取頭(50/30 μm DVB/Caron PDMS，Supelco公司，美國(guó))老化：將萃取頭置入氣相色譜進(jìn)樣口，進(jìn)樣口溫度250℃，老化30 min。(2)取動(dòng)物尿液樣品5 mL置于15 mL頂空瓶中，頂空瓶?jī)?nèi)放置磁子，50 ℃水浴30 min，然后將固相微萃取裝置插入瓶?jī)?nèi)，吸附萃取40 min，然后將萃取頭置于氣相色譜儀的進(jìn)樣口進(jìn)樣。

1.4 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

尿液化學(xué)成分測(cè)定采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GCMS-QP2010，島津公司，日本)；色譜柱：INNWAX(30 m×0.32 mm×0.50 μm)；色譜條件：進(jìn)樣口溫度為250 ℃；載氣：He，純度為99.999%；柱流速：2.54 mL/min；程序升溫：初始40 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。質(zhì)譜條件：離子源溫度220 ℃；傳輸線溫度220 ℃；全掃描方式；掃描范圍：40—500 amu。所得質(zhì)譜圖利用計(jì)算機(jī)譜庫(kù)NIST(National Institute of Standards and Technology)進(jìn)行相似度檢索，根據(jù)質(zhì)譜庫(kù)中物質(zhì)的匹配度，再結(jié)合物質(zhì)保留時(shí)間和文獻(xiàn)資料[25]來(lái)鑒定尿液樣品中的化學(xué)成分。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010和Cervus 3.0進(jìn)行親緣關(guān)系的鑒定，采用Excel 2010進(jìn)行尿液化學(xué)成分的統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 8.5軟件制作色譜圖。

2 結(jié)果

2.1 野外親屬中緬樹鼩尿液的化學(xué)成分

通過(guò)對(duì)野外親屬中緬樹鼩尿液檢測(cè)共得到化學(xué)成分450種，其中有效化學(xué)成分(≧3個(gè)樣本中檢測(cè)到某化學(xué)成分)145種(表1)，包括醇類46種、酮類30種、烴類21種、醛類15種、酯類8種、酚類7種、吡嗪5種、酸類3種、醚類3種、吡啶1種、腈類1種、芳香烴1種、其他4種。

表1 野外親屬中緬樹鼩尿液化學(xué)成分Tab.1 Chemical composition of urine in wild Tupaia belangeri

2.2 野外親屬中緬樹鼩不同性別個(gè)體尿液的特有化學(xué)成分

野外親屬中緬樹鼩雌雄個(gè)體尿液中包含特有的化學(xué)成分(表2)。雄性個(gè)體中的特有化學(xué)成分有5種，分別為苯酚(phenol)、2，2，6-三甲基環(huán)庚烷(2，2，6-trimethyl-cyclohexanone)、2-乙基-5-甲基吡嗪(2-ethyl-5-methyl-pyrazine)、3-乙基-2，5-二甲基吡嗪(3-ethyl-2，5-dimethyl-pyrazine)、1，6-二甲基環(huán)辛基-1，5-二烯(1，6-dimethyl-1，5-cyclooctadiene)。其中吡嗪2種、烴類、酮類、酚類各1種。尿液化學(xué)成分的代表性(C1)色譜圖見圖1。

表2 野外中緬樹鼩雌雄尿液特有化學(xué)成分Tab.2 Chemical constituents of male and female urine in wild Tupaia belangeri

圖1 野外親屬中緬樹鼩尿液代表性色譜圖(C1)Fig.1 Representative GC profile of urine in wild Tupaia belangeri(C1)

雌性個(gè)體中的特有化學(xué)成分有11種，分別為2-甲基-1-辛醇(2-methyl-1-octanol)、反式-3-壬烯-1-醇(E-3-nonen-1-ol)、乙酸橙花叔醇酯(nerolidyl acetate)、戊醇(1-pentanol)、二氫月桂烯醇(dihydromyrcenol)、3，7-二甲基-1-辛醇(3，7-dimethyl-1-octanol)等。其中醇類7種、酯類2種、烴類、酮類各1種。

2.3 野外親屬中緬樹鼩組內(nèi)單獨(dú)缺失和特有化學(xué)成分

通過(guò)對(duì)不同組親屬中緬樹鼩尿液的比較發(fā)現(xiàn)，每組均含有單獨(dú)缺失的化學(xué)成分(表3)。其中A組6種、B組4種、C組2種、D組8種、E組10種。而僅有C組親屬中緬樹鼩的尿液中含有特有的化學(xué)成分，即3-庚醇(3-heptanol)，且在C組每個(gè)樣本中均檢測(cè)到此成分存在。其余各種物質(zhì)均存在于兩組以上。

表3 野外中緬樹鼩尿液組內(nèi)單獨(dú)缺失和特有化學(xué)成分Tab.3 Individual deletions and unique chemical constituents in wild Tupaia belangeri

3 討論

動(dòng)物識(shí)別個(gè)體的能力對(duì)于維持其穩(wěn)定的社會(huì)群體、親子動(dòng)態(tài)、避免近親繁殖以及調(diào)節(jié)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系至關(guān)重要[26]。本研究檢測(cè)得到野外中緬樹鼩尿液有效化學(xué)成分145種，遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)室馴化和繁殖中緬樹鼩的51種[27]。這可能是由于野外食物和棲息地相較于實(shí)驗(yàn)室更為豐富復(fù)雜。本研究中野外親屬中緬樹鼩尿液的化學(xué)成分種類與實(shí)驗(yàn)室繁殖親屬中緬樹鼩大致相似，但是野外親屬中緬樹鼩尿液的化學(xué)成分的數(shù)量與實(shí)驗(yàn)室繁殖親屬中緬樹鼩相比較多[24]。這可能是因?yàn)橐巴馀c實(shí)驗(yàn)室繁殖中緬樹鼩屬于同一物種，因此尿液化學(xué)成分種類相似，但由于兩者生存環(huán)境和食物資源的不同導(dǎo)致尿液化學(xué)成分?jǐn)?shù)量不同。

尿液化學(xué)通訊動(dòng)物個(gè)體識(shí)別或親緣識(shí)別的途徑之一，動(dòng)物尿液中含有大量可用于化學(xué)通訊的微量化學(xué)成分[28]。研究表明，狼(Canislupus)尿液中吡嗪類化學(xué)成分能夠通過(guò)刺激小鼠的副嗅球來(lái)誘發(fā)其躲避和恐懼僵化行為[29]，其中3-乙基-2，5-二甲基吡嗪(3-ethyl-2，5-dimethyl-pyrazine)、5-乙基-2，3-二甲基吡嗪(5-ethyl-2，3-dimethyl-pyrazine)和2，3-二乙基吡嗪(2，3-diethyl-pyrazine)是誘發(fā)小鼠產(chǎn)生恐懼最活躍的化學(xué)成分[30]。本研究中，同樣檢測(cè)到3-乙基-2，5-二甲基吡嗪(3-ethyl-2，5-dimethyl-pyrazine)和2-乙基-5-甲基吡嗪(2-ethyl-5-methyl-pyrazine)兩種吡嗪類成分，且為雄性個(gè)體特有物質(zhì)，由此推測(cè)野外中緬樹鼩能夠通過(guò)尿液傳遞信息。

在動(dòng)物尿液中，有許多化學(xué)成分是編碼信息的關(guān)鍵組成部分，如丁酸(butyric acid)、2-甲基丁酸(2-methyl butyric acid)和4-庚酮(4-heptanone)等可能影響小鼠的社會(huì)等級(jí)、個(gè)體年齡和繁殖經(jīng)歷[31]。本研究中也檢測(cè)出類似成分，且不同親屬關(guān)系的中緬樹鼩檢測(cè)出的化學(xué)成分存在差異，其中3-庚醇(3-heptanol)僅在一組野外親屬中緬樹鼩中出現(xiàn)且組內(nèi)樣本均檢測(cè)存在。實(shí)驗(yàn)所用野外中緬樹鼩均捕獲自同一地區(qū)，食物資源及生存環(huán)境極為相似，由此推測(cè)導(dǎo)致野外不同親屬關(guān)系中緬樹鼩尿液成分不同的原因可能為親屬關(guān)系的遠(yuǎn)近或者社會(huì)等級(jí)的分化。而其他組均含有單獨(dú)缺失的不同種類的化學(xué)成分，由此推測(cè)野外中緬樹鼩的親屬信息由多種組分共同編碼，但不同化學(xué)成分是否通過(guò)其含量變化影響親屬識(shí)別還須進(jìn)一步探索。

綜上所述，食物和棲息地的復(fù)雜性影響野外中緬樹鼩尿液化學(xué)成分種類；雌雄個(gè)體中尿液成分不同，吡嗪類化學(xué)成分可能影響其種內(nèi)爭(zhēng)斗或種間競(jìng)爭(zhēng)；親屬關(guān)系的遠(yuǎn)近或者社會(huì)等級(jí)的分化導(dǎo)致野外不同親屬關(guān)系中緬樹鼩尿液成分的不同。野外中緬樹鼩可能通過(guò)尿液進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和親緣識(shí)別，這為進(jìn)一步揭示中緬樹鼩的通訊機(jī)制提供了科學(xué)理論依據(jù)。

續(xù)表1

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