蘇 寧，呂志遠(yuǎn)，秦炳偉，張夢夢，邱振清，韓云翠，時(shí)雪萌，王瀅瀅，呂洪霞

（濟(jì)南趵突泉釀酒有限責(zé)任公司，山東濟(jì)南250115）

吡嗪是1,4位含氮的六元環(huán)化合物，具有明顯的焦香或炒堅(jiān)果、炒芝麻的香氣[1]。白酒中吡嗪類化合物具有閾值低，氣味強(qiáng)度高的特點(diǎn)，對焦香的形成具有很重要的作用，是白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，也是大曲揮發(fā)性香味物質(zhì)的重要組成成分。大曲在制作過程中產(chǎn)生的各類香味物質(zhì)，可隨著發(fā)酵和蒸餾過程進(jìn)入酒體，因此，大曲中的香味物質(zhì)對白酒的風(fēng)味特征和品質(zhì)具有一定的貢獻(xiàn)[2]。目前，對于吡嗪類化合物的研究主要集中于對白酒中該類化合物的檢測與分析[3]，對大曲中吡嗪類化合物的檢測方法研究較少，牛姣等[4]通過頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對仰韶陶香型高溫大曲中揮發(fā)性香味物質(zhì)進(jìn)行分析，共檢測出4種吡嗪類化合物。本研究采用GC-MS對高溫大曲中吡嗪類化合物進(jìn)行檢測，共檢出7種含一個(gè)或者多個(gè)甲基的吡嗪類化合物，為今后高溫大曲的香味物質(zhì)及最佳儲存期的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：選用培曲期間（第0天～25天）及前期儲存（第26天～80天）的高溫大曲。

試劑及耗材：無水乙醇（色譜純）；內(nèi)標(biāo)物，2-甲氧基-3-甲基吡嗪；吡嗪類標(biāo)準(zhǔn)品，2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2,5/2,6-二甲基吡嗪。內(nèi)標(biāo)物與標(biāo)準(zhǔn)品，純度均為99.9%，購自百靈威科技有限公司。

儀器設(shè)備：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890 A-5975 C），安捷倫科技有限公司；電子天平（精確到0.1 g）；分析天平（型號FA 2004，精確到0.0001 g），天津天馬衡基儀器有限公司；超聲波發(fā)生器（KQ 2200型），昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)準(zhǔn)備

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取0.01 g（精確至0.0001 g）的2-甲氧基-3-甲基吡嗪，使用60%乙醇水溶液溶解定容至100 mL，濃度為100 mg/L。

內(nèi)標(biāo)使用液：準(zhǔn)確吸取10 mL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使用60%乙醇水液稀釋并定容至100 mL，濃度為10 mg/L。

吡嗪類混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別稱取0.1 g（精確至0.0001 g）吡嗪類標(biāo)準(zhǔn)品，使用60%乙醇水溶液溶解后定容至100 mL，使標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度為1000 mg/L。

吡嗪類混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確吸取2,5/2,6-二甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)儲備200 μL，其余標(biāo)準(zhǔn)儲備液100 μL，使用60%乙醇水溶液定容至100 mL,使2,5/2,6-二甲基吡嗪的濃度為2 mg/L，其余吡嗪類濃度為1 mg/L。配制標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度：2,5/2,6-二甲基吡嗪濃度梯度為0.2 mg/L、0.4 mg/L、1 mg/L、1.6 mg/L、2 mg/L，其余吡嗪類濃度梯度為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.5 mg/L、0.8 mg/L、1.0 mg/L，且內(nèi)標(biāo)濃度均為1 mg/L，待測。

1.2.2 試驗(yàn)前處理及優(yōu)化

樣品前處理：稱取10 g（精確至0.1 g）大曲于三角瓶中，加入45 mL乙醇水溶液和5 mL內(nèi)標(biāo)使用液，超聲，離心取上層清液，0.45 μm濾膜過濾，準(zhǔn)確吸取1 mL濾液至進(jìn)樣瓶中，供GC-MS分析。

分別采用15%、25%、50%、60%乙醇水溶液作為提取溶劑，確定最優(yōu)提取溶劑濃度。

加入乙醇水溶液后，分別采用20 min、30 min、60 min超聲提取吡嗪類化合物，確定最優(yōu)超聲提取時(shí)間。

1.2.3 GC條件

色譜柱為HP-5 MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為250℃；載氣為氦氣，流速1 mL/min；程序升溫起始溫度為40℃，保留5 min，然后以3.5℃/min升至90℃，再以15℃/min升至270℃，保留5 min；分流進(jìn)樣，分流比10∶1，分流流量10 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。

1.2.4 MS條件

電子轟擊離子源（EI）；電子能量70 eV；傳輸線溫度280℃；離子源溫度230℃。

1.2.5 定性定量方法

定性：SCAN模式下采集圖譜，利用NIST 08標(biāo)準(zhǔn)譜庫定性，確定監(jiān)測離子參數(shù)。

定量：根據(jù)SCAN檢測模式得到的離子檢測參數(shù)，建立SIM檢測模式，采用內(nèi)標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)曲線法，對吡嗪類化合物定量,每個(gè)樣品測量3次。

1.2.6 方法檢出限、回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

以信噪比S/N為3計(jì)算出方法檢出限。利用優(yōu)化的前處理方法，進(jìn)行回收率與精密度實(shí)驗(yàn)：分別取10 g大曲（同一個(gè)樣品）于三角瓶中，加入45 mL乙醇水溶液和5 mL內(nèi)標(biāo)使用液，然后添加不同濃度的吡嗪類化合物標(biāo)品，其中，2,5/2,6-二甲基吡嗪添加水平分別為0.4 mg/L、1 mg/L、2 mg/L，其余吡嗪類添加水平分別為0.2 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L，超聲，離心取上層清液，0.45 μm濾膜過濾，準(zhǔn)確吸取1 mL濾液至進(jìn)樣瓶中，待測，作為加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)；每個(gè)添加水平分別做6個(gè)平行樣品，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，作為該方法的精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)品和樣品的定性檢測

定性分析：對大曲樣品圖譜的每個(gè)峰，利用NIST 08檢索每個(gè)吡嗪類化合物，然后利用2 mg/L 2,5/2,6-二甲基吡嗪和1 mg/L其余吡嗪類的標(biāo)準(zhǔn)品，對保留時(shí)間和定性離子驗(yàn)證，最后確定了大曲中7種吡嗪類化合物，其中保留時(shí)間和定性離子見表1。

表1 7種吡嗪類化合物監(jiān)測離子參數(shù)

定量分析：通過表1的定性分析，確定了7種吡嗪類化合物的定量離子，通過保留時(shí)間與定量離子，建立7種吡嗪類化合物的SIM檢測模式，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法，建立吡嗪類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，大曲樣品色譜圖見圖1。

圖1 大曲樣品7種吡嗪類化合物和內(nèi)標(biāo)的色譜圖

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取液的優(yōu)化

分別采用蒸餾和浸泡的方式對大曲吡嗪類物質(zhì)進(jìn)行提取。與浸泡方式相比，蒸餾過程極易產(chǎn)生大量氣泡，導(dǎo)致液體溢出，危險(xiǎn)且造成提取物的損失。

浸泡溶劑濃度優(yōu)化：色譜柱為弱極性色譜柱，用水作為提取劑的樣液，經(jīng)過色譜柱時(shí)，會(huì)有一定的柱流失，影響色譜柱的壽命。結(jié)合柱損與乙醇（色譜級）價(jià)格，試驗(yàn)初步定乙醇水溶液作為提取溶劑，其濃度分別為15%、25%、50%和60%，對同一大曲樣品浸泡超聲30 min提取，檢測過程相同，結(jié)果對比見圖2。

圖2 同一曲樣不同濃度乙醇水溶液吡嗪類化合物檢測結(jié)果

由圖2可知，同一大曲樣品在25%、50%、60%乙醇水溶液分別作為提取溶劑時(shí)，7種吡嗪類化合物的檢測結(jié)果相差較小，而15%乙醇水溶液作為提取溶劑，檢測結(jié)果含量最低。因此，選用濃度較低的25%乙醇水溶液對大曲進(jìn)行浸泡處理最優(yōu)。

2.2.2 超聲時(shí)間優(yōu)化

用25%乙醇水溶液，提取同一大曲樣品中吡嗪類化合物，超聲時(shí)間分別為20 min、30 min、60 min，檢測過程相同，結(jié)果對比見圖3。

圖3 同一曲樣不同超聲時(shí)間吡嗪類化合物檢測結(jié)果

由圖3可看出，對同一樣品、同一乙醇水溶液浸泡，不同超聲時(shí)間提取對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30 min與60 min超聲對比，檢測結(jié)果相差不大；與20 min超聲相對比，檢測結(jié)果含量明顯高于20 min超聲結(jié)果含量。因此，30 min是最優(yōu)超聲時(shí)間。

對標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測分析，系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中各組分含量（mg/L）與內(nèi)標(biāo)含量（mg/L）的比值為X橫坐標(biāo)，吡嗪類各組分與其內(nèi)標(biāo)的峰面積的比值為Y縱坐標(biāo)，得到7種吡嗪類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 7種吡嗪類化合物線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

方法檢出限、試驗(yàn)回收率與精密度，結(jié)果見表3。

表3 方法檢出限、回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

由表2、表3可得，7種吡嗪類化合物線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，方法檢出限在2～26 μg/L之間，加標(biāo)回收率為86%～118%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.61%～6.55%。說明該方法適用于高溫大曲中7種吡嗪類化合物的檢測。

2.4 樣品檢測驗(yàn)證分析

按照試驗(yàn)方法對培曲及前期儲存期間的高溫大曲樣品進(jìn)行檢測，其7種吡嗪類化合物含量的動(dòng)態(tài)變化見圖4。

圖4 7種吡嗪類化合物在培曲及前期儲存期間的變化曲線

由圖4可得，7種吡嗪類化合物在培曲及前期儲存期間的高溫大曲中均被檢測出。其中，2,5/2,6-二甲基吡嗪的含量均明顯高于其他6種吡嗪類化合物，四甲基吡嗪的含量最低；隨發(fā)酵天數(shù)的增長，這7種吡嗪類化合物的總含量也不斷增加。吡嗪類化合物主要由芽孢桿菌屬代謝產(chǎn)生[5-7]，梁晨等[8]對大曲儲存過程中原核生物群落結(jié)構(gòu)及風(fēng)味成分演替規(guī)律研究表明，儲存前期芽孢桿菌屬在高溫大曲中的含量增加，這也與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果符合。

3 結(jié)論

通過優(yōu)化試驗(yàn)方法，采用GC-MS技術(shù)，建立了一種高溫大曲中7種吡嗪類化合物的檢測方法，本方法用25%乙醇水溶液，超聲30 min對大曲進(jìn)行浸泡處理，既最大程度的減少了目標(biāo)化合物的損失，也節(jié)約了成本，同時(shí)，該方法操作簡單，檢出限低，靈敏度可靠，適用于高溫大曲中吡嗪類化合物的檢測。

培曲期間（0～25 d）及前期儲存（第26天～80天）的高溫大曲，7種吡嗪類化合物的總含量在第80天時(shí)達(dá)到最高，可達(dá)5.455 mg/kg，其中，2,5/2,6-二甲基吡嗪的含量最高，均明顯高于其他6種吡嗪類化合物。本實(shí)驗(yàn)只對0～80 d的高溫大曲進(jìn)行了檢測，所以高溫大曲中7種吡嗪類化合物的具體變化規(guī)律及最佳儲存期的選擇需進(jìn)一步擴(kuò)大范圍進(jìn)行研究。