馬 雙, 許繼飛, 劉宏博, 吳 昊, 崔思嘉,3, 周睫雅,4, 王旭明, 田書磊*

1.內(nèi)蒙古大學生態(tài)與環(huán)境學院, 環(huán)境污染控制與廢物資源化自治區(qū)重點實驗室, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021

2.中國環(huán)境科學研究院固體廢物污染控制技術(shù)研究所, 北京 100012

3.東北電力大學化學工程學院, 吉林 吉林 132012

4.河北科技大學環(huán)境科學與工程學院, 河北 石家莊 050080

5.北京市農(nóng)林科學院, 北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心, 北京 100097

作為一種殺菌和抑菌藥物，抗生素廣泛應(yīng)用于人們和動物的疾病防治過程中，如在新冠肺炎疫情中，患者后期易繼發(fā)細菌或真菌感染，抗生素可對該類患者進行及時有效救治[1]. 但抗生素生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量的抗生素菌渣，按1 t抗生素產(chǎn)生8～10 t的菌渣估算[2]，我國僅在2013年就產(chǎn)生了2.48×106t左右的抗生素菌渣[3]. 抗生素菌渣主要是由抗生素生產(chǎn)過程中發(fā)酵微生物菌體細胞、無機鹽、未發(fā)酵的固體有機物、提取抗生素過程中的殘余有機溶劑和殘留的抗生素等組成[4]. 因抗生素中含大量有機質(zhì)[5]、N、P、K和多種微量元素[2]，肥料化是實現(xiàn)其資源化利用的較好途徑. 但菌渣中殘留的抗生素直接進入環(huán)境中可能會構(gòu)成環(huán)境風險[6-7]. 調(diào)研結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同企業(yè)或不同生產(chǎn)工藝中抗生素殘留量存在差異，螺旋霉素鮮菌渣中螺旋霉素殘留量為750～800 mgkg[8]，青霉素鮮菌渣中青霉素殘留量為260～300 mgL，頭孢菌素鮮菌渣中頭孢菌素殘留量為530～550 mgL，若未經(jīng)無害化處理直接進入土壤、水體等環(huán)境介質(zhì)中會促使耐藥性細菌的產(chǎn)生及抗生素抗性基因的富集，對人體健康和生態(tài)環(huán)境造成潛在的巨大危害[9-11]，因此在對抗生素菌渣進行資源化利用前必須進行無害化處置以去除抗生素. 但目前我國尚缺少抗生素菌渣無害化處置技術(shù)要求、肥料中抗生素殘留以及土壤使用后生態(tài)風險評估等相關(guān)標準與技術(shù)規(guī)范. 中國環(huán)境科學研究院與抗生素菌渣國家工程技術(shù)中心已向國家標準化管理委員會提出制訂青霉素等典型大宗抗生素菌渣作為有機肥基料的無害化處置技術(shù)要求、環(huán)境風險評估方法等相關(guān)技術(shù)規(guī)范的立項申請并通過專家討論，將于2020年底完成立項程序，以期為抗生素菌渣肥料化利用奠定基礎(chǔ).

菌渣中抗生素殘留量對蔬菜種子萌發(fā)的生態(tài)毒性效應(yīng)是抗生素菌渣肥料化利用標準中一項重要的考量指標. 油麥菜、油菜、白菜和生菜作為人們?nèi)粘Ｊ秤妙l率較高的蔬菜，因其生長周期短、本體短小、易受抗生素影響等特點，已被國內(nèi)外學者廣泛用于評估抗生素對植物種子萌發(fā)的生態(tài)毒性效應(yīng)[12]. Hillis等[13]就磺胺類和大環(huán)內(nèi)脂類等抗生素對萵苣的生態(tài)毒性進行了研究，發(fā)現(xiàn)金霉素、左氧氟沙星和磺胺甲惡唑的生態(tài)毒性最為顯著. WANG等[14]采用水培法分別研究了土霉素和鹽酸多西環(huán)素濃度為0～90 mgL、乳酸恩諾沙星濃度為0～320 mgL時對油菜的生態(tài)毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在設(shè)定濃度范圍內(nèi)各種抗生素對根長的抑制作用均強于芽長. 劉娣等[15]的研究結(jié)果表明，白菜對四環(huán)素類抗生素的敏感性為根長>發(fā)芽率. PAN等[16]發(fā)現(xiàn)，生菜對四環(huán)素、磺胺二甲嘧啶、諾氟沙星和紅霉素等獸用抗生素較敏感，主要體現(xiàn)在其根長受到明顯的抑制作用. 然而目前國內(nèi)外關(guān)于環(huán)境中青霉素(Penicillin，簡稱“PG”)對蔬菜的生態(tài)毒性效應(yīng)尚不明確，可利用的生態(tài)毒性效應(yīng)數(shù)據(jù)也很少.

該試驗以油麥菜、油菜、白菜和生菜為研究對象，以發(fā)芽率、幼苗鮮質(zhì)量以及根長和芽長作為重要指標，分析不同ρ(PG)對4種蔬菜種子萌發(fā)的生態(tài)毒性效應(yīng)，并對ρ(PG)和蔬菜根長抑制率進行劑量-效應(yīng)關(guān)系擬合，以期為建立青霉素菌渣肥料化利用相關(guān)標準提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試4種蔬菜種子分別為油麥菜(Lactucasativavar longifoliaf. Lam)、油菜(BrassicacampestrisL.)、白菜〔Brassicapekinensis(Lour.) Rupr.〕和生菜(LactucasativaLinn. var. ramosa Hort.)，購于北京派得偉業(yè)科技發(fā)展有限公司；試驗所用青霉素為伊犁川寧生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的青霉素G鉀鹽，呈粉末狀，純度99.9%，化學式為C16H17KN2O4S，結(jié)構(gòu)式見圖1.

圖1 PG的結(jié)構(gòu)式

1.2 試驗方法

為準確排查PG對種子的生態(tài)毒性濃度范圍，根據(jù)預(yù)試驗中對4種蔬菜根長抑制率為10%～60%的ρ(PG)，針對不同蔬菜設(shè)置了不同ρ(PG)梯度(對于油麥菜和油菜，分別為10、100、200、400、800、1 200、1 600、2 000 和 2 400 mgL；對于生菜和白菜，分別為10、100、200、400、800、1 600、2 400、3 200 和 4 000 mgL).

預(yù)處理過程：首先配制體積分數(shù)為10%的H2O2溶液，然后對油菜、油麥菜、生菜和白菜4種蔬菜種子消毒10 min，再用蒸餾水反復(fù)沖洗并濾干，然后將一張濾紙放于直徑90 mm的培養(yǎng)皿中，將配置好的3 mL不同濃度的PG均勻涂在培養(yǎng)皿中，以此作為處理組；對照組(CK)中加入3 mL蒸餾水. 每組處理均設(shè)3個重復(fù)，用鑷子將已選取的大小一致、顆粒飽滿的15顆種子均勻點在培養(yǎng)皿中，保持胚根末端與生長方向呈直線，將培養(yǎng)皿置于智能型光照培養(yǎng)箱(GXZ-280，寧波江南儀器廠)中黑暗培養(yǎng)，保持溫度(25±1)℃. 每天用稱重法加蒸餾水保持恒質(zhì)量以補充蒸發(fā)的水分. 試驗第4天后收獲幼苗.

1.3 數(shù)據(jù)測定與分析

培養(yǎng)過程中每天觀察種子發(fā)芽數(shù)，并計算發(fā)芽率；收獲時用分析天平測量蔬菜幼苗鮮質(zhì)量；用游標卡尺測量發(fā)芽種子的芽長和根長(芽長是指下胚軸基部至芽頂端的長度，根長是指下胚軸基部至主根尖端的長度)，利用IBM SPSS Statistics 22對數(shù)據(jù)進行單因素(One-way ANOVA)方差分析和差異顯著性檢驗.

發(fā)芽率和根長抑制率的計算公式：

GP=nN×100%

(1)

RLI=(RL0-RLt)RL0×100%

(2)

式中：GP為發(fā)芽率，%；n為發(fā)芽種子數(shù)，個；N為供試種子數(shù)，個；RLI為根長抑制率，%；RL0為對照組根長，mm；RLt為處理組根長，mm.

利用Origin 2018軟件建立幼苗根長抑制率與ρ(PG)的散點圖并進行擬合，根據(jù)擬合方程計算根長抑制率為50%時對應(yīng)的青霉素濃度，即為根長半抑制濃度(IC50).

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度PG處理對4種蔬菜發(fā)芽率的影響

發(fā)芽率是反映外界環(huán)境變化對種子萌發(fā)影響的重要指標. 不同濃度PG對油麥菜、油菜、白菜和生菜發(fā)芽率的影響如表1所示. 從表1可知，各處理組的4種蔬菜種子發(fā)芽率均與對照組無顯著性差異(P>0.05)，這與Gomes等[17]研究環(huán)丙沙星對玉米種子萌發(fā)的影響結(jié)果相似. 究其原因：①種皮可阻礙抗生素對蔬菜種子萌發(fā)產(chǎn)生的負面影響[18]；②種子萌發(fā)是以吸水膨脹為主的物理過程[19-20]，且種子本身具有抗逆性，可通過自身的代謝反應(yīng)抵抗、削弱甚至修復(fù)抗生素的加入對發(fā)芽產(chǎn)生的影響[21]. 因此，發(fā)芽率不能全面反映青霉素污染的生態(tài)毒性效應(yīng).

表1 不同濃度PG對4種蔬菜種子發(fā)芽率的影響

2.2 不同濃度PG處理對4種蔬菜種子芽長的影響

與發(fā)芽率相比，PG對4種蔬菜種子芽長的影響較為明顯. 從圖2可知，不同濃度PG對油菜和白菜種子的芽長均起到了促進作用，隨著ρ(PG)的升高，處理組油菜種子的芽長受促進現(xiàn)象最為明顯，當ρ(PG)≥1 200 mgL時，其芽長增長率在60%左右且與對照組相比具有顯著差異(P<0.05)；處理組白菜種子的芽長均隨ρ(PG)的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢. 在試驗濃度范圍內(nèi)，PG對油麥菜種子的芽長呈現(xiàn)抑制作用，對生菜種子的芽長則呈現(xiàn)出先促進后抑制的現(xiàn)象，ρ(PG)為800 mgL時生菜種子的芽長達到最大值(26.51 mm)，較對照組增加了27.06%；當ρ(PG)>800 mgL，隨著ρ(PG)的增加其抑制作用逐漸增強. 魏子艷等[22]研究發(fā)現(xiàn)，金霉素濃度在30～90 mgL之間時，隨著濃度的升高，其對黃瓜種子芽長的抑制作用不斷增強. 這是因為種子胚根先與抗生素溶液接觸，吸收抗生素并輸送到胚中，當抗生素濃度在其中的積累超出其耐受范圍時，芽長則受到顯著抑制. 在該試驗中，油菜和白菜均屬于十字花科蕓薹屬，PG對其芽長表現(xiàn)為促進作用；油麥菜和生菜均屬于菊科萵苣屬，處理組中其芽長的變化趨勢表現(xiàn)為先升高后降低. 造成不同屬蔬菜芽長在青霉素脅迫下變化趨勢不同的原因，可能與蔬菜中營養(yǎng)物質(zhì)的儲存狀態(tài)有關(guān)[23]. 與萵苣屬蔬菜相比，蕓薹屬蔬菜種子中不具有淀粉粒，使得抗生素作用在不同屬蔬菜中的靶分子不同[24]，但其具體機制還需進一步研究.

注： 同種蔬菜不同字母表示差異顯著(P<0.05).

2.3 不同濃度PG處理對4種蔬菜種子根長和幼苗鮮質(zhì)量的影響

胚根是種子萌發(fā)后首先出現(xiàn)的器官，具有固著、貯存合成氨基酸和植物激素等有機物質(zhì)的作用，其主功能是吸收環(huán)境中水分及養(yǎng)分，并通過維管組織輸送給莖[25]. 由圖3可以看出，在試驗濃度范圍內(nèi)，與對照組相比，處理組4種蔬菜種子的根長均隨ρ(PG)的增加而呈現(xiàn)抑制作用逐漸增強的現(xiàn)象. 這與多位學者的研究結(jié)果相似，例如，魏子艷等[22]采用水培法研究磺胺對甲氧嘧啶的濃度對油菜、黃瓜和白菜根長的影響，發(fā)現(xiàn)在磺胺對甲氧嘧啶濃度為0～90 mgL時，處理組3種蔬菜根長隨其濃度的升高而受到明顯抑制作用，與對照組根長差異性顯著(P<0.01)；LUO等[26]研究表明，在四環(huán)素濃度為5～200 μmolL時，隨著濃度的增加，白菜種子根長呈顯著下降的趨勢，與對照組相比具有極顯著差異(P<0.01). 目前，關(guān)于抗生素對植物根長抑制的原因主要包括：①植物根與抗生素直接接觸而最先受到污染[27-28]；②抗生素溶液改變了植物抗氧化防御系統(tǒng)中超氧化物歧化酶、過氧化物酶等酶的活性，導(dǎo)致可溶性糖減少，從而影響了根的形成[29-30]；③抗生素通過影響DNA和RNA的合成，抑制根部細胞的分裂[31].

根是吸收環(huán)境中水分的主要營養(yǎng)器官，而水分是蔬菜鮮質(zhì)量的主要限制因子，所以根的發(fā)育狀態(tài)直接影響蔬菜幼苗鮮質(zhì)量. 如圖3所示，4種蔬菜幼苗鮮質(zhì)量隨ρ(PG)的變化情況不盡相同. 各處理組中油菜、白菜和生菜的鮮質(zhì)量均隨ρ(PG)的升高呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當ρ(PG)為200 mgL時，生菜鮮質(zhì)量為0.29 g，較對照組增加10.37%；當ρ(PG)為400 mgL時，白菜鮮質(zhì)量達到峰值，較對照組增加5.76%. 油麥菜鮮質(zhì)量隨ρ(PG)的升高則呈現(xiàn)下降趨勢. 當ρ(PG)為 2 400 mgL時，油麥菜、油菜、白菜和生菜的鮮質(zhì)量較對照組分別下降了48.07%、16.56%、27.12%和40.78%，這表明在相同濃度(2 400 mgL)下，PG對油麥菜幼苗鮮質(zhì)量的影響高于其他3種蔬菜.

注： 不同小寫字母表示鮮質(zhì)量差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示根長差異顯著(P<0.05).

2.4 4種蔬菜不同毒性指標對PG敏感程度分析

根是蔬菜主要的吸收和代謝器官，同時也是最容易受毒物分子影響的部位，且與PG直接接觸，可通過影響蔬菜根部的抗氧化防御系統(tǒng)和細胞分裂來影響根長[30-31]. 有研究指出，種子萌發(fā)發(fā)生在植物暗生芽期，此時胚根是快速生長的器官，對抗生素敏感[23]，因此4種蔬菜根長在PG存在下均受到抑制. 由圖3可知，PG對部分處理組油菜、白菜和生菜的鮮質(zhì)量呈促進作用，對所有處理組油麥菜均呈抑制作用. 在高濃度(1 200 mgL)下，油麥菜幼苗鮮質(zhì)量與對照組相比具有顯著差異(P<0.05)，而在較低濃度(200 mgL)時，其根長與對照組相比已具有顯著差異(P<0.05)，因此4種蔬菜幼苗鮮質(zhì)量對PG的敏感性小于根長.

抗生素對芽長的作用機制主要是種子胚根先吸收抗生素并沿著胚軸向上輸送給芽，所以與芽相比，根中抗生素累積量最多[32]. 已有研究[33-35]指出，隨著抗生素濃度的升高，蔬菜芽長和根長逐漸受到抑制，且受抑制程度表現(xiàn)為根長>芽長. 在試驗濃度范圍內(nèi)，生菜芽長隨ρ(PG)的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；與其幼苗鮮質(zhì)量相比，芽長在較高濃度(800 mgL)時達到最大值. PG對各處理組油菜和白菜芽長均呈促進作用，但對部分處理組油菜和白菜鮮質(zhì)量呈促進作用. 油麥菜芽長在PG存在下受到抑制，且在較高濃度(2 000 mgL)下與對照組相比具顯著差異(P<0.05). 所以與幼苗鮮質(zhì)量相比，4種蔬菜芽長對PG較不敏感. 將PG與4種蔬菜不同毒性指標進行顯著性差異分析，P值均表現(xiàn)為發(fā)芽率>芽長>鮮質(zhì)量>根長(見表2)，所以4種蔬菜的生長指標對PG的生態(tài)敏感性均表現(xiàn)為根長>鮮質(zhì)量>芽長>發(fā)芽率，即根長對PG較敏感. CHENG等[36]指出，有機化合物在相同濃度下對幼苗根長的抑制作用大于其他參數(shù)，林琳等[29]的研究結(jié)果表明，與鮮質(zhì)量和莖長相比，白菜根長對四環(huán)素更敏感，與筆者試驗結(jié)果相似.

表2 PG與4種蔬菜不同指標的顯著性差異分析(P值)

2.5 PG對4種蔬菜根長抑制率的劑量-效應(yīng)關(guān)系

目前，研究者多采用半抑制濃度(IC50)來評估污染物對動植物的生態(tài)毒性[37]，IC50越小，表明污染物對研究對象的毒性越強. 如圖4所示，為進一步評估PG對4種蔬菜的生態(tài)毒性，建立了不同濃度PG對4種蔬菜根長抑制率的響應(yīng)曲線，并以此推導(dǎo)出ρ(PG)與根長抑制率回歸方程用以解析IC50. 通過數(shù)據(jù)擬合，解析出油麥菜、油菜、白菜和生菜根長抑制率與ρ(PG) 的關(guān)系均符合Allometric模型，即y=axb〔其中，x為ρ(PG)，y為根長抑制率，a和b均為常數(shù)〕. 如表3所示，油麥菜、油菜、白菜和生菜根長抑制率對ρ(PG)的回歸分析的R2分別為0.91、0.98、0.92和0.95，表明試驗數(shù)據(jù)與該模型符合度良好.

表3 PG與4種蔬菜根長抑制率的回歸分析

通過劑量-效應(yīng)曲線計算得到PG對油麥菜、油菜、白菜和生菜4種蔬菜根長的IC50，分別為 1 675.11、995.67、3 736.40 和 2 510.24 mgL. 由此可知，4種蔬菜對PG的敏感程度表現(xiàn)為油菜>油麥菜>生菜>白菜(P<0.05). 這表明在試驗濃度范圍內(nèi)，相比于其他3種蔬菜，PG對油菜根長的抑制作用較顯著，即油菜更適合作為PG生態(tài)毒性指示植物. 研究[22]指出，在同種試驗方法下，金霉素、諾氟沙星和磺胺對甲氧嘧啶對油菜根長的IC50分別為31.27、532.95和0.06 mgL，遠小于筆者試驗中PG對小油菜根長的IC50(995.67 mgL)，主要是因為各類抗生素親水和疏水性不同及化學或物理性質(zhì)(如分子量)不同[38]. 較其他種類抗生素而言，PG具強親水性，且具有β-內(nèi)酰胺環(huán)，化學性質(zhì)不穩(wěn)定，這可能是造成蔬菜根長IC50較高的原因.

圖4 4種蔬菜根長在PG脅迫下的劑量-效應(yīng)曲線

3 結(jié)論

a) 油麥菜、油菜、白菜和生菜4種蔬菜發(fā)芽率、鮮質(zhì)量、根長和芽長對PG的生態(tài)敏感性均表現(xiàn)為根長>鮮質(zhì)量>芽長>發(fā)芽率.

b) 在試驗所設(shè)濃度范圍內(nèi)，PG對油麥菜、油菜、白菜和生菜4種蔬菜根長抑制率的劑量-效應(yīng)關(guān)系均符合Allometric模型，即y=axb〔其中，x為ρ(PG)，y為根長抑制率，a和b均為常數(shù)〕.

c) 采用根長的IC50來評估PG對4種蔬菜的生態(tài)毒性，4種蔬菜對PG的生態(tài)毒性敏感程度表現(xiàn)為油菜>油麥菜>生菜>白菜(P<0.05)，PG對油菜根長的IC50最小，為995.67 mgL，表明與其他3種蔬菜相比，油菜更適合作為PG的生態(tài)毒性指示植物.