夏湘勤, 唐朱睿, 黃彩紅*, 席北斗, 郭 威

1.中國環(huán)境科學(xué)研究院， 環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100012

2.中國環(huán)境科學(xué)研究院， 國家環(huán)境保護(hù)地下水污染過程模擬與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100012

3.桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 廣西 桂林 541006

抗性基因(Antibiotic Resistance Genes, ARGs)是導(dǎo)致微生物擁有抗生素抗性的元兇，特別是存在于致病菌中時(shí)，會(huì)造成嚴(yán)重環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn). 據(jù)WHO (World Health Organization, 世界衛(wèi)生組織)2018年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，無論發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家抗生素耐藥菌發(fā)病率均居高不下[1]. 在歐盟地區(qū)，每年因耐藥菌感染造成超過 25 000×104人死亡，并造成經(jīng)濟(jì)損失超過15×108美元[2]. 在美國，每年至少200×104人的疾病和 23 000 人的死亡是由于抗生素抗性所導(dǎo)致[3]. 而此次新型冠狀病毒肺炎疫情期間，醫(yī)療衛(wèi)生體系中大量藥物使用，也可能會(huì)加劇ARGs在環(huán)境中的累積和傳播. 這些ARGs能夠轉(zhuǎn)移至與人類相關(guān)的微生物，如轉(zhuǎn)移至某些烈性致病菌(如鼠疫病原菌等)，將會(huì)對人類健康造成威脅. 因此，微生物耐藥性是一種“不定時(shí)炸彈”，一旦暴發(fā)后果不堪設(shè)想. WHO已宣布在全球范圍部署防控ARGs，并將微生物耐藥性列為21世紀(jì)人類面臨的最大挑戰(zhàn)之一[4].

我國是世界上最大的抗生素生產(chǎn)國和使用國，僅2013年，生產(chǎn)了16.20×104t抗生素，其中48%被用于醫(yī)學(xué)使用，其余部分則用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)[5]. 而氟喹諾酮類抗生素(Fluoroquinolones, FQs)作為一種廣譜抗菌抗生素廣泛用于畜禽養(yǎng)殖，其中以環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin, CIP)為典型代表[6]. 我國畜禽糞便中環(huán)丙沙星平均殘留濃度在0.49～45.6 mgkg之間[6-7]. 然而，大多數(shù)抗生素不能被動(dòng)物完全代謝，其攝入劑量的30%～90%以原型藥物和代謝產(chǎn)物形式排出[8]. 因此，畜禽糞便中殘存抗生素會(huì)通過選擇性壓力誘導(dǎo)ARGs的產(chǎn)生，使其成為潛在的耐藥菌和ARGs儲(chǔ)藏庫[9-10]. 2015年我國畜禽糞污產(chǎn)生量約為1.91×109t，其中豬糞產(chǎn)生量為6.5×108t，豬糞在總畜禽糞污中占比最高[10]，且豬糞中ARGs豐度要高于其他畜禽糞污[11]，表明豬糞中ARGs的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)更大.

好氧堆肥作為無害化和資源化再利用有機(jī)固廢的一種重要技術(shù)手段，其產(chǎn)品廣泛用于農(nóng)業(yè)、園藝和土壤修復(fù)[12]. 好氧堆肥能夠有效削減抗生素進(jìn)而減少殘留抗生素進(jìn)入土壤環(huán)境，而ARGs具有可復(fù)制性、可在微生物間水平轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特點(diǎn)，使得ARGs的削減在堆肥過程中變化規(guī)律不盡相同. 筆者所在課題組研究了生活垃圾好氧堆肥過程中ARGs的豐度變化趨勢及影響因素，發(fā)現(xiàn)在堆肥高溫期ARGs豐度顯著升高，腐熟階段降低. 同時(shí)，經(jīng)過堆肥處理能夠削減致病菌的豐度，這些致病菌種包括一些潛在宿主微生物[13]. 豬糞中往往會(huì)殘留一定量的抗生素，可能會(huì)脅迫產(chǎn)生ARGs，鑒于豬糞產(chǎn)生量大，且當(dāng)前我國畜禽糞便資源化技術(shù)與管理中尚沒有對ARGs等累積型新興污染物的控制標(biāo)準(zhǔn). 因而，有必要開展豬糞堆肥過程中ARGs豐度特征與影響因素研究. 基于此，該研究選取豬糞作為研究對象，選擇環(huán)丙沙星作為典型抗生素類型，以關(guān)鍵微生物解析為重點(diǎn)，研究殘留環(huán)丙沙星豬糞堆肥過程中ARGs豐度變化特征及其與微生物響應(yīng)關(guān)系，為豬糞無害化促進(jìn)資源化利用提供科學(xué)支撐.

1 材料與方法

1.1 堆肥與樣品采集

豬糞物料取自北京東華山村沼氣站(豬糞中環(huán)丙沙星本底值的平均濃度為0.89 mgkg)，鋸末取自附近木材廠，環(huán)丙沙星(C17H18FN3O3)購自上海MACKLIN公司，堆肥物料的理化性質(zhì)見表1. 兩臺(tái)自動(dòng)化堆肥設(shè)備購自日本靜岡機(jī)械有限公司，高0.4 m，直徑0.33 m，總?cè)莘e0.034 m3，設(shè)有滲濾液收集裝置、供氣計(jì)量系統(tǒng)及溫度調(diào)節(jié)裝置.

表1 堆肥初始物料理化性質(zhì)

采用特制有機(jī)玻璃隔板將堆肥裝置分為4個(gè)反應(yīng)區(qū)，即4個(gè)堆體，每個(gè)堆體中添加豬糞和鋸末共8 kg. 豬糞和鋸末按4∶5的質(zhì)量比混合，使得CN為25∶1 左右，含水率為57.84%～60.00%，保證連續(xù)通風(fēng)狀態(tài)，通風(fēng)量為4 Lmin. 4個(gè)反應(yīng)區(qū)環(huán)丙沙星添加量分別為0 mgkg(CK)、25 mgkg(A25)、50 mgkg(A50)、100 mgkg(A100). 堆肥溫度區(qū)間為22～58 ℃，高溫期(>50 ℃)四個(gè)堆體均持續(xù)保持5～7 d. 好氧堆肥周期為46 d，分別于第0、3、7、14、26、46天進(jìn)行樣品采集，均在堆體不同深度(表層以下5、10、15 cm處)取樣，過20目(0.9 mm)篩并充分混合后，分裝至自封袋(約50 g)，干冰儲(chǔ)存，用于后續(xù)試驗(yàn)開展.

1.2 DNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒提取樣品總DNA，于-80 ℃下保存待分析. 預(yù)試驗(yàn)后，選擇4個(gè)質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類藥物耐藥基因(Plasmid-mediated Quinolone Resistance Genes, PMQR)和1個(gè)可移動(dòng)遺傳元件(Mobile genetic elements, MGEs)作為目標(biāo)基因，即(qnrS、qnrD、gyrA、parC)和一個(gè)整合子(intl1)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR)檢測，設(shè)3次重復(fù). PCR擴(kuò)增條件可參考文獻(xiàn)[13]，引物設(shè)計(jì)如表2所示. qPCR定量分析后的絕對豐度用copiesg表示.

表2 目標(biāo)ARGs和引物設(shè)計(jì)[14-16]

1.3 16S rDNA基因測序

將DNA樣本送上海美吉生物制藥科技有限公司進(jìn)行16S rDNA基因測序. 測序平臺(tái)為Illumina MiSeq，構(gòu)建MiSeq PE300庫. 用引物338F (ACTCCT ACGGGAGGCAGCAG)和806R (GGACTACHVGGGT WTCTAAT)對細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增. 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，OD260 nm和OD280 nm均高于1.55，滿足后續(xù)試驗(yàn)條件. 使用正式的PCR測試TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA聚合酶，20 μL反應(yīng)系統(tǒng)包括10 ng模板DNA、0.8 μL正向引物(5 μmolL)、0.8 μL反向引物(5 μmolL)等. PCR熱循環(huán)條件：95 ℃，持續(xù)3 min；35個(gè)循環(huán)，95 ℃ 30 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 45 s；72 ℃下延長10 min. PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，按97%的相似度，對所有序列進(jìn)行OTU分區(qū)并進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS 25.0軟件和Origin 6.0軟件對ARGs、MGEs和細(xì)菌群落的豐度及其相關(guān)性進(jìn)行分析. ARGs豐度變化及微生物群落變化圖用Excel 2016軟件和R語言(pheatmap包)繪制. 根據(jù)ARGs、MGEs和微生物間的Pearson相關(guān)系數(shù)(P<0.05)，采用Cytoscape 3.7.1軟件對其進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 ARGs與可移動(dòng)遺傳元件豐度變化

依據(jù)堆體(CK、A25、A50、A100) 46 d內(nèi)的溫度變化，將堆肥的3個(gè)典型階段劃分如下，即升溫期(第0～2天)、高溫期(第3～10天)和腐熟期(第11～45天). 其中，腐熟期也是堆肥的降溫階段，進(jìn)一步分為降溫前期(第11～27天)和降溫后期(第28～46天). 所取堆肥樣品共24個(gè)，均檢測出4個(gè)喹諾酮類抗性基因(qnrS、qnrD、gyrA、parC)和一個(gè)移動(dòng)遺傳元件(整合子intl1).

2.1.1喹諾酮類ARGs的豐度變化

堆體ARGs總豐度變化如圖1所示，經(jīng)堆肥處理后，僅A50堆體中喹諾酮類ARGs總豐度升高，由初期的1.17×106copiesg升至4.37×106copiesg，增加了2.73倍；其他3個(gè)堆體(CK、A25、A100)中喹諾酮類ARGs總豐度均被削減，分別降低了95%、81%和98%. 在堆肥腐熟產(chǎn)品中，喹諾酮類ARGs總豐度大小依次為A50>CK>A100>A25. 其中，CK的喹諾酮類ARGs先在高溫期第7天升高至峰值，隨后降低，最后在腐熟期第46天略升高. 處理組A25和A100堆體的喹諾酮類ARGs總豐度變化趨勢相似，均在高溫期第7天降至最低水平，隨后在腐熟期略升高. 從堆肥第0天到高溫期第7天，對比4個(gè)堆體中ARGs變化豐度發(fā)現(xiàn)，CK組中喹諾酮類ARGs豐度升高，其他3個(gè)堆體(A25、A50、A100)中豐度則降低，分別降低了90%、85%和99%. 高溫期A25、A50和A100堆體中喹諾酮類ARGs均降低，這可能是由于添加環(huán)丙沙星影響了相關(guān)微生物菌群，從而影響喹諾酮類ARGs豐度變化. ZHANG等[17]發(fā)現(xiàn)抗生素施加產(chǎn)生的選擇性壓力對微生物群落有顯著影響，與該研究的結(jié)果類似.

各堆體中ARGs豐度變化具有差異性，結(jié)果(見圖1)顯示，gyrA的絕對豐度最高，其平均豐度在1.34×105～4.21×105copiesg之間，qnrS平均豐度在5.48×104～1.58×105copiesg之間，qnrD和parC的平均豐度甚至更低，分別在1.10×104～2.99×104、3.28×104～7.29×104copiesg之間，其平均豐度大小依次為gyrA>qnrS>parC>qnrD. A50堆體中，3個(gè)基因qnrS、qnrD、gyrA豐度顯著升高導(dǎo)致ARGs總豐度升高，而parC的豐度略有降低，對其總豐度升高趨勢的影響較小. 而堆肥第0天到高溫期第7天，CK組中喹諾酮類ARGs總豐度升高，是由于除qnrD豐度降低了41%外，qnrS、gyrA和parC的絕對豐度均顯著升高(P<0.01)，分別升高9.3、5.4和11.5倍，說明qnrS、gyrA和parC是導(dǎo)致CK堆體高溫期ARGs總豐度升高至峰值的主要貢獻(xiàn)基因. 目前研究[17-18]認(rèn)為，堆肥過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的組成變化是影響抗生素ARGs變化的主要原因. Selvam等[14,19]研究發(fā)現(xiàn)在堆肥高溫期過后，四環(huán)素ARGs與四環(huán)素類抗性細(xì)菌的變化都出現(xiàn)先升后降的趨勢，表明同一類抗性細(xì)菌與ARGs的變化呈顯著正相關(guān). 由此可見，堆肥微生物群落結(jié)構(gòu)可能在ARGs豐度變化過程中扮演了重要角色.

2.1.2移動(dòng)遺傳元件的豐度變化

移動(dòng)遺傳元件(MGEs)是參與ARGs水平轉(zhuǎn)移的主要載體. 結(jié)果(見圖1)顯示，4個(gè)堆體中intl1的豐度變化較為相似，從開始到結(jié)束階段均呈增長趨勢，增長倍數(shù)分別為151.88倍(CK)、39.02倍(A25)、68.45倍(A50)、105.41倍(A100). 其中，豐度增加最大的是CK堆體，由初始絕對豐度的8.23×106copiesg增至1.25×109copiesg. 整個(gè)堆肥階段，所有堆體中intl1的總豐度均比每個(gè)PMQR的豐度高2～4個(gè)數(shù)量級(jí). 有研究[20]認(rèn)為，可移動(dòng)遺傳元件作為ARGs的載體比ARGs具有更高的豐度. 研究[21-22]表明，MGEs的豐度變化類似于ARGs，且二者之間存在密切的關(guān)系. LIU等[23]在四環(huán)素廢水處理系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)intl1與四環(huán)素類ARGs的增殖有關(guān)；DUAN等[24]發(fā)現(xiàn)intl1與tetW、ermF和sul1基因呈顯著正相關(guān)，且sul1和intl1之間相關(guān)性最強(qiáng)(R=0.994). 但試驗(yàn)結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)可移動(dòng)遺傳元件intl1與PMQR豐度變化有顯著相關(guān). 這可能是由于攜帶4個(gè)喹諾酮類ARGs的作用MGEs并不是intl1，它們之間的潛在宿主沒有共性.

2.2 微生物群落演替規(guī)律

堆肥24個(gè)樣品中獲得 1 233 189 個(gè)高質(zhì)量序列，按最小樣本序列數(shù)進(jìn)行抽平，序列以97%的相似度聚類到 1 468 個(gè)OTU. 稀釋曲線表明，測序深度(29 371)可以檢測樣品中的大多數(shù)細(xì)菌群落. 目前研究[18,25]認(rèn)為，細(xì)菌群落的演替可能會(huì)影響ARGs的豐度變化. 結(jié)果(見圖2)顯示，細(xì)菌群落組成在堆肥不同階段表現(xiàn)出明顯的聚集(P<0.01). 在堆肥高溫期第7天微生物組成與其他階段離散最大，說明高溫期是堆肥細(xì)菌群落變化最顯著的階段.

注： D0、D3、D7、D14、D26和D46分別表示第0、3、7、14、26、46天中的4個(gè)堆體樣品. 下同.

堆肥不同階段中細(xì)菌群落的α-多樣性差異大(見表3). 在高溫期第7天，4個(gè)堆體中Shannon-Wiener指數(shù)和ACE指數(shù)均明顯降低，是整個(gè)堆肥階段的最低水平，即第7天的堆肥中微生物多樣性最低且物種數(shù)最少. 這主要由于堆肥中嗜溫性細(xì)菌無法在高溫期生存，會(huì)隨著溫度升高而降低[26]. 抗生素對堆肥微生物群落多樣性有一定的影響，到堆肥腐熟階段，A100堆體的Shannon-Wiener指數(shù)和ACE指數(shù)均低于其他3組，說明高濃度抗生素可能會(huì)降低堆肥產(chǎn)品中微生物多樣性. 為進(jìn)一步了解PMQR與堆肥微生物多樣性及生物量的相關(guān)性，將Shannon-Wiener指數(shù)、ACE指數(shù)與PMQR、MGEs豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)CK、A25堆體中，intl1和微生物多樣性呈顯著相關(guān)(P<0.05). 這說明可移動(dòng)遺傳元件intl1的豐度變化與堆肥中細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)，但是否與攜帶PMQR的潛在宿主有相關(guān)性還需進(jìn)一步探究.

表3 豬糞堆肥4個(gè)處理組中不同階段的細(xì)菌多樣性指數(shù)

微生物作為堆肥過程中的主力軍，是ARGs和MGEs豐度變化的關(guān)鍵因素[27]. 堆肥微生物門水平群落組成見圖3，在所有堆肥樣品中，占主導(dǎo)地位的菌門有放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和綠彎菌門(Chloroflexi). 與已有的研究[28-29]相似，F(xiàn)irmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria在整個(gè)堆肥環(huán)境中約占76.2%，是堆肥過程中主要菌門.

為進(jìn)一步解析微生物群落結(jié)構(gòu)對ARGs豐度變化的影響，對堆肥不同階段屬水平群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析. 在前25個(gè)屬(見圖4)中，狹義梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)(占比為10.2%)、水微菌屬(Aquamicrobium)(占比為9.4%)、乳桿菌屬(Lactobacillus)(占比為9.4%)、交替赤桿菌屬(Altererythrobacter)(占比為4.5%)、和黃桿菌屬(Flavobacterium)(占比為4.0%)為優(yōu)勢菌屬. 其中，Clostridium_sensu_stricto_1和Lactobacillus，作為Firmicutes的主要菌屬，主要出現(xiàn)在堆肥升溫期和高溫期，而其他3種菌屬主要分布在腐熟期. LIAO等[20]研究廚余垃圾堆肥中ARGs潛在宿主微生物發(fā)現(xiàn)，堆肥不同階段微生物群落具有差異性，高溫期的優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌(Bacillus)、海洋芽孢桿菌(Oceanobacillu)和棒狀桿菌(Corynebacterium)，說明不同物料堆肥中優(yōu)勢菌屬具有差異性.

圖3 各堆肥中不同階段門水平群落結(jié)構(gòu)及分析

圖4 各堆肥中不同階段屬水平群落結(jié)構(gòu)及分析

畜禽糞便是病原微生物的主要載體，一些病原細(xì)菌(在物種水平上)攜帶了ARGs[30]. 盡管病原菌的相對豐度較低，仍存在一定的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn). 該研究中檢測出的主要10種致病菌的豐度變化情況見圖5. 由圖5可見，隨著堆肥進(jìn)行，病原微生物的相對豐度(屬水平)逐漸降低，而多樣性增加. 這可能是由于堆肥高溫期會(huì)抑制病原微生物生長，使得病原微生物總體豐度降低. 而腐熟期堆肥反應(yīng)條件較溫和，有利于整體微生物菌群的多樣性增加，其中包括部分病原菌. 根據(jù)美國EPA標(biāo)準(zhǔn)[31]，當(dāng)堆肥系統(tǒng)滿足一定條件，即40 ℃以上維持工作5 d且超過55 ℃至少持續(xù)4 h，才能實(shí)現(xiàn)病原體的有效滅活. 試驗(yàn)中4個(gè)堆體高溫期的溫度變化均已達(dá)到美國EPA滅活標(biāo)準(zhǔn)，但病原菌均未能完全被去除. 檢測發(fā)現(xiàn)4個(gè)堆體中10種病原菌的初始總相對豐度為4.75%，經(jīng)堆肥46 d后，CK、A25、A50和A100堆體的去除率分別為73.2%、77.7%、87.8%和79.2%. Soobhany[32]在城市有機(jī)固廢堆肥試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，堆肥可減少大腸桿菌數(shù)量，但不能完全滅活該微生物. 同樣，Pourcher等[33]研究顯示，即使溫度高達(dá)66 ℃也不能完全使病原菌失活. 此外，研究發(fā)現(xiàn)堆肥高溫期第7天，4個(gè)堆體中病原菌去除率分別為69.0%(CK)、54.6%(A25)、51.1%(A100)、45.8%(A50)，致病菌的相對豐度均降低了45%以上，說明高溫期是去除致病菌的主要階段.

圖5 堆肥過程中致病菌(屬水平)的相對豐度變化

2.3 潛在宿主菌和ARGs共現(xiàn)分析

試驗(yàn)中4個(gè)堆體為相對獨(dú)立的堆肥體系，而不同抗生素濃度脅迫下，堆體中宿主微生物存在差異性. 為了進(jìn)一步解析ARGs的潛在宿主微生物，進(jìn)行了不同堆體中潛在宿主菌的網(wǎng)絡(luò)共現(xiàn)分析識(shí)別(見圖6). 由圖6可見，堆肥環(huán)境中與PMQR相關(guān)的潛在宿主菌一共有17種，其中8種為致病菌. 這些潛在宿主菌主要分布在厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)中，尤其是厚壁菌門、變形菌門的潛在宿主菌數(shù)量最多，豐度最高. 所有潛在宿主中，僅發(fā)現(xiàn)屬于放線菌門的白喉?xiàng)U菌(Corynebacterium)與intl1呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，其他宿主菌均與PMQR、MGEs呈顯著正相關(guān)(P<0.05). 已有研究[34-36]也表明，F(xiàn)irmicutes和Proteobacteria可能是與ARGs水平轉(zhuǎn)移相關(guān)的主要菌門. 所關(guān)注的前10種致病菌中除芽孢桿菌和假單胞菌(Pseudomonas)外，其他均為潛在宿主. 其中，Streptococcus作為潛在宿主菌在4個(gè)堆體中均存在；在A25堆體的ModuleⅡ中，發(fā)現(xiàn)Clostridium_sensu_stricto_1不僅是4個(gè)PMQR的共同潛在宿主，也是致病菌中豐度最高的菌屬，表明豬糞堆肥環(huán)境中存在ARGs向致病菌轉(zhuǎn)移的環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn). 因此，建議在25 mgkg環(huán)丙沙星環(huán)境中，以堆肥技術(shù)控制削減PMQR時(shí)，Clostridium_sensu_stricto_1應(yīng)作為需首要關(guān)注的作用微生物. Jechalke等[37]研究表明，intl1位于質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子上，側(cè)翼是插入序列，該序列通常與ARGs變化具有相關(guān)性. 但是，關(guān)于潛在宿主與可移動(dòng)遺傳元件intl1共現(xiàn)分析(見圖6). 由圖6可見：A25、A50、A100堆體中，可移動(dòng)遺傳元件intl1的潛在宿主菌與影響PMQR變化的潛在宿主沒有共性；CK堆體中，也僅發(fā)現(xiàn)白喉?xiàng)U菌是intl1和qnrS的共同潛在宿主. 綜上，整合子intl1所在的ARGs簇可能沒有攜帶這4種喹諾酮類ARGs，所以intl1與ARGs豐度相關(guān)性不顯著.

注： 三角形()表示致病菌(P.genus)，圓圈()表示細(xì)菌(Genus)，正方形()表示MGE，菱形()表示PMQR；粉色填充表示厚壁菌門(Firmicutes)，藍(lán)色填充表示變形菌門(Proteobacteria)，綠色填充表示擬桿菌門(Bacteroidetes)，黃色填充表示放線菌門(Actinobacteria).

3 結(jié)論

a) 不同濃度環(huán)丙沙星脅迫下，豬糞堆肥過程中喹諾酮類ARGs的變化規(guī)律有所不同，CK、A25和A100堆體中喹諾酮類ARGs總豐度均受到不同程度削減，A50堆體中ARGs的總豐度反而升高. 而在高溫期，除了CK組，處理組中ARGs豐度顯著降低(P<0.05)，分別降低了90%、85%和99%，表明堆肥高溫期或是削減ARGs豐度的關(guān)鍵階段.

b) 對ARGs豐度變化與微生物響應(yīng)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)狹義梭菌屬、水微菌屬、乳桿菌屬和交替赤桿菌屬既是堆肥環(huán)境中優(yōu)勢菌屬，也是喹諾酮類ARGs潛在宿主微生物，主要分布在厚壁菌門和變形菌門.

c) 經(jīng)46 d好氧堆肥，4個(gè)堆體中致病菌均未被完全去除，去除率分別為87.8%(A50)、79.2%(A100)、77.7%(A25)、73.2%(CK)，且豐度較高的致病菌狹義梭菌屬和鏈球菌均是喹諾酮類ARGs的潛在宿主菌，表明豬糞堆肥環(huán)境中存在ARGs向致病菌轉(zhuǎn)移的環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn).