馬 騰，李 彬，王新陸，謝世陽(yáng)，高 原，朱明軍，王永霞

（1. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 鄭州 450000；2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 鄭州 450000）

心力衰竭（簡(jiǎn)稱(chēng)“心衰”）是各種臨床心臟疾病發(fā)展到晚期階段的一種表現(xiàn)，其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程復(fù)雜，死亡率居高不下[1]。心衰時(shí)，心肌細(xì)胞處于能量代謝失衡狀態(tài)，可導(dǎo)致心肌收縮功能不全和心室重構(gòu)的進(jìn)展。線粒體是能量代謝的樞紐，是細(xì)胞中的“發(fā)電站”，也是脂肪、糖和氨基酸氧化和釋放能量的最后場(chǎng)所。而線粒體DNA(mtDNA)的表達(dá)，是電子傳遞鏈、氧化磷酸化和ATP 合成的重要組成部分，對(duì)心肌細(xì)胞能量代謝具有重要意義。

參附益心方源自于河南中醫(yī)藥大學(xué)，是孫建芝教授治療慢性心衰的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有益氣、溫陽(yáng)、活血、利水等功效。當(dāng)下認(rèn)為，中醫(yī)中的“氣”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“能量”、“ATP”具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)[4]，從氣血理論方面可對(duì)參附益心方改善心衰患者心功能、改善預(yù)后進(jìn)行闡述。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)參附益心方能改善心衰患者癥狀、心功能、提高生活質(zhì)量及改善預(yù)后[5]。另外，本課題組經(jīng)過(guò)前期相關(guān)基礎(chǔ)研究[6-9]，發(fā)現(xiàn)參附益心方可能通過(guò)調(diào)控相關(guān)miRNA、信號(hào)通路發(fā)揮改善心肌細(xì)胞能量代謝的作用，從而發(fā)揮改善心功能、抗心衰、延緩或逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)的作用。本試驗(yàn)在缺氧誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞損傷模型中，通過(guò)觀察參附益心方對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ATP 和LDH 含量，ND-1、ND-2、COX、tfam基因的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證參附益心方對(duì)心肌細(xì)胞線粒體DNA基因表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)1-3 d 新生SD 乳大鼠，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄不限，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（豫）2015-0005。

1.2 儀器設(shè)備

TDL-50B 型低速臺(tái)式大容量離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；MK3型酶標(biāo)儀（德國(guó)Thermo Scientific 公司）；JA203 型電子分析天平（上海?？惦娮觾x器廠）；IKAV-MAG HST 型磁力攪拌器（中國(guó)蘇州艾卡公司）；BCM-1000A型生物超凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈集團(tuán)安泰公司）；DMI 3006倒置熒光顯微鏡(德國(guó)萊卡公司)；CK 40倒置顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）；Rco-3000tvbb 二氧化碳培養(yǎng)箱（Revco，美國(guó)）；Inucyte zom 長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像分析系統(tǒng)（Sensi技術(shù)有限公司）；ABI 7300型熒光定量PCR儀（美國(guó)AB公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

Dulbecco's Modified EagleMedium（DMEM）培養(yǎng)基（Solarbio公司）；0.08%心肌細(xì)胞消化液（Trypsin 0.16 g；NaCl 1.6 g；NaHCO30.070 6 g）；胎牛血清（FBS，以色列Biological Industries 公司）；磷酸鹽平衡液PBS（NaCl 8.00 g；KCl 0.20 g；Na2HPO41.56 g；KH2PO40.24 g；ddH2O 1 000 mL）；胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）；葡萄糖0.198 2 g；KCl 0.059 6 g；HEPES 0.4 g；ddH2O 200 mL）；YOYO-1染料（美國(guó)Invitrogen公司）4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（美國(guó)西格瑪公司）；溴脫氧尿核苷（Brdu，美國(guó)Sigma 公司）；心肌肌鈣蛋白I（cTnI）抗體（武漢博士德公司）；Strept Actividin-Biotin Complex（SABC-FITC，小鼠IgG）（武漢博士德公司）；腺苷三磷酸（ATP）檢測(cè)試劑盒（瑞士羅氏公司）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司）；擴(kuò)增試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司）；0.4%臺(tái)盼藍(lán)（華美生物工程公司）；Opti-MEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司）；輔酶（能氣朗）Q10 片（Coenzyme Q10）（衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司，10 mg/片）；參附益心方（SF，山東步長(zhǎng)制藥有限公司），1 g 浸膏≈9.5 g 生藥，參附益心方浸膏得率10.5%。

2 方法

2.1 藥液制備（現(xiàn)用現(xiàn)配）

2.1.1 參附益心方藥液制備

參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]，電子分析天平稱(chēng)取SF 浸膏干粉0.25 g，添加DMEM 培養(yǎng)液10 ml，吹打混勻，過(guò)濾器（0.22 μm）用于過(guò)濾和去除細(xì)菌，制成參附益心方母液（25 mg/ml）。

2.1.2 輔酶Q10藥液制備

取輔酶Q10 片5 片，研磨壓碎，加入5.8 ml DMEM培養(yǎng)基，用過(guò)濾器（0.22 μm）過(guò)濾，制成輔酶Q10 母液（1×10-2mol/L）。

2.2 原代心肌細(xì)胞的分離

取1-3 d 的SD 乳鼠，無(wú)菌條件下開(kāi)胸取乳鼠心臟，棄去心房與心耳部位，獲得心室部分，預(yù)冷PBS 緩沖液沖洗干凈后將其剪成組織塊（大小約1-2 mm3）。添加心肌細(xì)胞消化液后移至玻璃瓶中，放入37℃水浴鍋中，振蕩水浴6 min，多次消化，直到組織塊變?yōu)榘咨该鳎s7-8次），第一次消化后，自然沉淀，去上清，之后自然沉淀后留取上清。向上清液中加入相同量含10%FBS+DMEM 培養(yǎng)液后輕輕吹打制成細(xì)胞懸液，離心（1000 r/min）10 min。棄去上清，加入適量10%FBS+DMEM 培養(yǎng)基，吹打混勻，200 目篩網(wǎng)過(guò)濾，獲得細(xì)胞懸液。

2.3 原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)

取“2.2”細(xì)胞懸液，種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱，差速貼壁法1.5 h，抽出上清液，1000 r/min 離心5 min 后，棄上清得到心肌細(xì)胞，加入含10%FBS + DMEM 培養(yǎng)液吹打混勻，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞數(shù)目，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL，接種于培養(yǎng)板，加入BrdU（0.1 mmol/L）抑制成纖維細(xì)胞的增殖。培養(yǎng)48 h，棄去上清液，加入DMEM 培養(yǎng)液，無(wú)血清同步化24 h。

2.4 原代心肌細(xì)胞的鑒定

培養(yǎng)3 d 后，棄培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛固定（10～20 min），滴加cTnI 多克隆抗體（兔多克隆抗體1∶50），4℃冰箱中孵育過(guò)夜。SABC-FITC 標(biāo)記二抗（羊抗兔1∶100）避光孵育2 h 后，DAPI 染料避光5 min，水溶性封片劑封孔，在熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。取拍照視野6 個(gè)，鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)為（N1），計(jì)數(shù)熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)作為心肌細(xì)胞數(shù)(n1)，根據(jù)公式：心肌細(xì)胞比例=n1/N1×100%。

2.5 CCK-8篩選藥物最合適濃度

將心肌細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞板上，培養(yǎng)48 h后，無(wú)血清同步化24 h，分為Normal組、SF（參附益心方）組（濃度分別為0.1 mg/ml、0.25 mg/ml、0.5 mg/ml、0.75 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml）、Coenzyme Q10 組（濃度分別為1×10-3mol/L、1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L），培養(yǎng)24 h 后，更換新鮮培養(yǎng)基，并且每孔加入CCK-8 試劑10 ul，CO2培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值（λ=450 nm）。

2.6 建立缺氧模型

提取的原代心肌細(xì)胞在常氧條件下放置48 h，無(wú)血清同步化24 h，各缺氧組中加入YoYo-1 染料2 ul，通過(guò)惰性氣體法制造心肌細(xì)胞缺氧模型，液氮罐供氣，使得溫箱氣體成分調(diào)整為90%N2、5%O2、5%CO2，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像分析系統(tǒng)分析后，檢測(cè)每組活細(xì)胞個(gè)數(shù)，最終確定最合適的缺氧時(shí)間為6 h。正常組氧含量正常。

2.7 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法

確定各組最合適濃度及缺氧時(shí)間后，取“2.3”中培養(yǎng)成的原代心肌細(xì)胞，每孔中加入含10%FBS +DMEM 培養(yǎng)液2 mL，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組，即Model組、Normal 組、Coenzyme Q10 組（1 × 10-4mol/L）、SFL組（0.25 mg/mL）、SFH 組（0.5 mg/mL）五組，置于5%O2、5%CO2、90%N2條件下培養(yǎng)6 h，進(jìn)行缺氧損傷（正常組除外）。

2.8 試劑盒檢測(cè)原代心肌細(xì)胞ATP含量

采用熒光素酶發(fā)光法，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)心肌細(xì)胞中ATP 的含量，前期處理方案及分組同“2.7”，給藥和造模后，將上清液吸出丟棄，用PBS 在室溫下洗滌2-3次，每次1 分鐘，嚴(yán)格按照三磷酸腺苷（ATP）檢測(cè)試劑盒的規(guī)定操作。

2.9 試劑盒檢測(cè)原代心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶（LDH）含量

具體步驟如下：2 μmol/mL 丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品用雙蒸水稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品孔中分別加入20 μl 樣血清，25 μl底物緩沖液(含0.3 M 乳酸），對(duì)照孔以蒸餾水替代血清，37℃孵育15 min，然后加入25 μl的2,4二硝基苯肼溶液（1 mM），37℃孵育15 min，然后加入氫氧化鈉溶液（0.4 M），混勻，室溫孵育5 min，酶標(biāo)儀上測(cè)定OD 值（λ=420 nm）。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合公式，計(jì)算乳酸脫氫酶含量。

2.10 RT-PCR 檢測(cè)線粒體ND-1、ND-2、COX、tfam 基因表達(dá)

前期處理方案及分組同“2.7”，缺氧條件培養(yǎng)6 h，RNA 提取 試劑盒 提取RNA，1 ug 總RNA 逆轉(zhuǎn) 錄 為cDNA，GAPDH 為內(nèi)參，20 ul 體系擴(kuò)增線粒體ND-1、ND-2、COX、tfam 基因，反應(yīng)條件為：首先進(jìn)行90 s 的95℃預(yù)變性后進(jìn)行PCR 循環(huán)，然后進(jìn)行10 s 的95℃變性，30 s 的60℃退火，共循環(huán)40 次。擴(kuò)增結(jié)束后，緩慢加熱升溫，從65℃至95℃，建立關(guān)于PCR 的產(chǎn)物溶解曲線。2-ΔΔCT法計(jì)算各組基因的相對(duì)含量，具體各引物序列如下：ND-1 序列：上游引物：CTACATACAACTACGCAAAGGC，下游引物：GCTTAGAGCTAGTGTAAGGGAG，擴(kuò)增 長(zhǎng) 度166；ND-2 序 列：上 游引 物：TACCCGAAGTCACCCAAGGA，下游引物：GGCGCCAACAAAGACTGATG，擴(kuò)增長(zhǎng)度155；COX 序列：上游引物GTCTTGTTTGCTTTCTTTGC，下游引物：GGTACTGTCGTTCCAGACTATC，擴(kuò)增長(zhǎng)度：142；tfam 序列：上游引物：GTCAGCCTTATCTGTATTCCGA，下游引物：ACTTTTGCATCTGGGTGTTTAG，擴(kuò)增長(zhǎng)度131；GAPDH序列：上游引物：ACAGCAACAGGGTGGTGGAC，下游引物：TTTGAGGGTGCAGCGAACTT，擴(kuò)增長(zhǎng)度252 bp。2.11 用SPSS19.0 軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，P＜0.05 提示數(shù)據(jù)的變化趨勢(shì)有差異性，P＜0.01 提示有顯著差異性。組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 原代心肌細(xì)胞的鑒定

此次實(shí)驗(yàn)以山羊抗大鼠cTnI 作為一抗、采用免疫熒光法檢測(cè)鑒定原代心肌細(xì)胞的純度。使用差速貼壁法1.5 h 后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，鏡下觀察原代心肌細(xì)胞呈星形或者梭形交織聚集生長(zhǎng)，融合成單細(xì)胞層，局部致密區(qū)形成細(xì)胞簇，可見(jiàn)同步化搏動(dòng)。cTnI 一抗熒光染料細(xì)胞胞質(zhì)染色均勻，純度達(dá)標(biāo)（85%），符合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)要求，具體數(shù)據(jù)參照前期本團(tuán)隊(duì)發(fā)表文章[9]。

3.2 參附益心方對(duì)原代心肌細(xì)胞活性的影響

結(jié)果顯示，0.1、0.25、0.5 mg/mLSF 組細(xì)胞活性與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；0.75、1.0、1.5 mg/mLSF 組可使細(xì)胞活性明顯下降，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）證明此濃度范圍對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用?；诖藵舛让?，之后選擇SF濃度為0.25 mg/mL、0.5 mg/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 缺氧條件下參附益心方對(duì)原代心肌細(xì)胞LDH含量的影響(± s)

表1 缺氧條件下參附益心方對(duì)原代心肌細(xì)胞LDH含量的影響(± s)

組別正常組模型組輔酶Q10組LDH，mU/ml 93.10±2.79 418.75±30.18 109.51±15.37組別參附益心方低劑量組參附益心方高劑量組LDH，mU/ml 167.66±18.41 116.87±9.12

圖1 缺氧條件下參附益心方對(duì)原代心肌細(xì)胞LDH含量的影響

3.3 Coenzyme 10對(duì)原代心肌細(xì)胞活性的影響

結(jié)果顯示，1×10-3mol/L Coenzyme 10組細(xì)胞活性與對(duì)照組相比，細(xì)胞活性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L Coenzyme 10 組細(xì)胞活性與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；基于此濃度摸索，選擇Coenzyme 10 濃度1 ×10-4mol/L組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.4 缺氧條件下參附益心方對(duì)原代心肌細(xì)胞ATP 含量的影響

前期結(jié)果表明，缺氧條件下原代心肌細(xì)胞ATP 含量與正常組相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與Model 相比，SFH 組、輔酶Q10 均可提高缺氧條件下原代心肌細(xì)胞ATP含量（P＜0.01）。具體數(shù)據(jù)參照前期本團(tuán)隊(duì)發(fā)表文章[10]。

3.5 缺氧條件下參附益心方對(duì)原代心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶（LDH）含量的影響

結(jié)果表明，缺氧條件下原代心肌細(xì)胞LDH 含量與Normal 組相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；參附益心方、輔酶Q10 均可降低缺氧條件下原代心肌細(xì)胞LDH含量，與Model組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1、圖1。

3.6 缺氧條件下參附益心方對(duì)mtDNA 相關(guān)基因表達(dá)的影響

缺氧條件下，ND-1、ND-2、COX、tfam 基因表達(dá)與其他各組相比明顯降低，與Normal 組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。SFH組、輔酶Q10組ND-1基因表達(dá)可見(jiàn)明顯升高，與Model組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SFH 組、SFL 組、輔酶Q10 組ND-2 基因表達(dá)可見(jiàn)明顯升高，與Model組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SFH組、SFL組、輔酶Q10組COX基因表達(dá)可見(jiàn)明顯升高，與Model組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SFH 組、SFL 組、輔酶Q10 組tfam 基因表達(dá)與Model組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

4 討論

線粒體是細(xì)胞的能量工廠，在能量生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。人類(lèi)線粒體DNA 包含16569 對(duì)堿基，編碼基因37 個(gè)，其中有13 種編碼呼吸鏈復(fù)合體和ATP 合成酶，包含NADH 脫氫酶亞基1（ND-1）、NADH脫氫酶亞基2（ND-2）、環(huán)氧化酶（cycloxygenase，COX）等，它們是氧化磷酸化、電子傳遞鏈和ATP 合成的重要部分，其基因的突變或者表達(dá)的下降，都會(huì)影響呼吸鏈復(fù)合體I 酶活性降低，細(xì)胞內(nèi)ATP 合成減少[11-13]。COX 基因?qū)τ诰€粒體呼吸鏈而言非常重要，是其重要組成部分之一，對(duì)ATP 的產(chǎn)生和功能意義重大[14]，ND-1、ND-2 不僅是線粒體DNA 的編碼基因，也是NADH脫氫酶的一個(gè)亞單位，而NADH 是線粒體呼吸鏈的起始酶和標(biāo)志物，線粒體內(nèi)ATP 大多數(shù)是經(jīng)過(guò)NADH 的電子傳遞產(chǎn)生[15]，故線粒體DNA 相關(guān)因子ND-1、ND-2、COX 基因在ATP 合成、能量代謝中的作用至關(guān)重要，其表達(dá)水平可以反映出線粒體能量代謝的水平[16]，研究其表達(dá)對(duì)研究心衰治療藥物的作用靶點(diǎn)亦具有重要的意義。此外，線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（tfam）是一種核基因編碼的DNA 結(jié)合蛋白。tfam 基因不僅有助于維持線粒體DNA的結(jié)構(gòu)，改善線粒體損傷[17-19]，同時(shí)也參與氧化磷酸化及ATP 的合成，研究發(fā)現(xiàn)，tfam 對(duì)mtDNA 的轉(zhuǎn)錄、數(shù)量、功能維持起關(guān)鍵作用[20]，其表達(dá)水平的提高，能促進(jìn)線粒體的合成和數(shù)量，從而促進(jìn)ATP 的合成[21]。綜上所述，ND-1、ND-2、COX、tfam 基因的表達(dá)水平的改變可以反映出SF 對(duì)線粒體能量代謝的影響。乳酸脫氫酶是參與糖酵解和糖異生的重要酶，心力衰竭時(shí)心肌細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)，LDH 代償性增加，通過(guò)糖無(wú)氧酵解以代償性產(chǎn)生ATP 維持心肌細(xì)胞能量[22]。

圖2 缺氧條件下參附益心方對(duì)原代心肌細(xì)胞ND-1、ND-2、COX、tfam基因表達(dá)的影響

祖國(guó)醫(yī)學(xué)沒(méi)有“心衰”病名，但其臨床癥狀似屬中醫(yī)典籍水腫、喘癥、心悸、胸痹范疇，且對(duì)此早有描述，如《金匱要略》：“心水者，其身重而少氣，不得臥，煩而燥，其人陰腫”明確的說(shuō)明其病理因素為“水”。另外，已有前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)西方醫(yī)學(xué)中“ATP”“能量”與祖國(guó)醫(yī)學(xué)之“氣”具有相似的理論與物質(zhì)基礎(chǔ)[4]，心衰患者ATP 合成減少，心肌細(xì)胞能量匱乏，從而造成心臟儲(chǔ)備力耗竭，中醫(yī)典籍《傷寒明理論》言：“其心氣虛者，由陽(yáng)氣內(nèi)弱，心下空虛，正氣內(nèi)動(dòng)而為悸也”對(duì)心衰的癥狀做了描述，且指出其“心氣虛”，與ATP 合成減少、能量匱乏不謀而合。參附益心方是河南名醫(yī)孫建芝教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，配伍精良，選方得當(dāng)，其具體成分為人參、附子、桂枝、丹參、赤芍、益母草、豬苓、澤瀉、葶藶子、砂仁、大棗，經(jīng)前期研究此方辯證立足于心氣虛[23]，方中君藥為人參，具有補(bǔ)益心氣的功效，從西方醫(yī)學(xué)來(lái)說(shuō)，人參能改善心肌細(xì)胞的能量代謝，增加ATP 含量。參附益心方總括于陰陽(yáng)，參之以“水”“淤”等病理因素，以活血化瘀、益氣溫陽(yáng)、利水消腫為治法，對(duì)于心衰患者效如桴鼓。

經(jīng)過(guò)前期臨床研究和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，心衰時(shí)心肌收縮力降低，心臟輸出量減少，缺血缺氧的病理狀態(tài)使得心衰癥狀加重，而參附益心方可以增加心肌收縮力、增加ATP 合成，以保護(hù)心肌細(xì)胞，減輕心力衰竭癥狀[5-7]。本次實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谔骄咳毖鯒l件下參附益心方對(duì)心肌細(xì)胞線粒體DNA 基因的表達(dá)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Normal 組對(duì)比，Model 組ATP 合成減少，LDH 合成增加，ND-1、ND-2、COX、tfam 基因表達(dá)下降，說(shuō)明缺氧條件下，原代心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)下降，ATP 合成減少，能量代謝障礙；與Model組對(duì)比，SF 組可提高大鼠心肌細(xì)胞ATP 含量，降低LDH 含量，增加ND-1、ND-2、COX 基因的表達(dá)，因此參附益心方可能通過(guò)作用于心肌細(xì)胞線粒體的基因表達(dá)，來(lái)提高ATP的合成，降低LDH 合成，以保護(hù)心肌細(xì)胞，穩(wěn)定線粒體膜電位，對(duì)緩解心衰患者臨床癥狀與維持心肌細(xì)胞能量代謝意義重大。