史有陽，陳力新，秦悅農(nóng)，韓向暉，孫霃平＊＊，劉 勝

（1. 上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院 上海 200032；2. 上海中醫(yī)藥大學中醫(yī)外科研究所 上海 200032）

阿霉素（Doxorubicin，Dox）是蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤藥物，也是治療包括乳腺癌在內(nèi)的一線化療藥物。然而，多種毒副反應特別是心臟毒性限制了其在臨床的應用[1]。近年來，對阿霉素所致心臟毒性的機制考察主要著重于氧化應激、死亡受體、鐵代謝失衡、細胞自噬凋亡和線粒體損傷等方面，但阿霉素的心臟毒性機制尚未有明確的定論[2-4]。多項研究表明，中藥及有效活性成分有拮抗阿霉素心臟毒性的作用，但作用機制復雜，涉及多條信號通路[5]。

本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)[6]，桔梗能夠提高阿霉素化療后乳腺癌病人的左心室射血分數(shù)，減輕阿霉素化療帶來的心臟毒副反應。木犀草素（Luteolin，Lut）是桔梗的主要有效成分之一[7]。為進一步明確木犀草素是否有保護心臟的作用，本課題組設計了體外實驗，檢測了木犀草素對阿霉素誘導的人AC16 心肌細胞損傷治療作用。隨著基因測序技術不斷完善與發(fā)展，二代高通量測序技術已能全面、準確、快速地獲得藥物干預后細胞所有轉錄組信息，具有高通量、低成本和高精確率等優(yōu)點[8]。本研究采用二代高通量測序平臺Illumina No?voseq，分析木犀草素對人AC16 心肌細胞損傷治療作用基因差異表達，探究木犀草素治療阿霉素心臟毒性的可能靶點。

1 材料

1.1 細胞株

人AC16 心肌細胞購自上海中橋新舟生物有限公司。

1.2 試劑

本實驗的試劑包括：木犀草素（購自成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-17102605，純度≥98%）；MTT 粉 劑（美 國Sigma 公 司）；阿 霉 素、Hoechst33258 試劑盒（碧云天生物技術有限公司，批號：SC0159；批 號：C1017）；DMEM 培 養(yǎng) 基（美 國Hyclone公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清（FBS）、青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶（美國Gibico 公司）；Trizol（上海生工，貨號B511311）；Qubit2.0 DNA 檢測試劑盒（Life Q10212）；mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina?（南京諾唯贊NR601-02）。

1.3 儀器

本實驗的儀器包括：細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；Qubit2.0 熒光計Q32866 Invitrogen；PCR 儀T100TMThermal Cycler（BIO-RAD）；Benchmark PLUS 酶標儀（美國BIO-RAD 公司）；電泳儀DYY-11（北京市六一儀器廠）；生物電泳圖像分析系統(tǒng)FR-980A（上海復日科技）；倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

人AC16 心肌細胞在DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素和100 mg/L 鏈霉素），37℃、5%CO2飽和濕度下進行培養(yǎng)，隔日傳代。

2.2 阿霉素誘導人AC16心肌細胞損傷模型的建立

取5 × 103對數(shù)生長期AC16 細胞接種于96 孔板中，每孔150 μL，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h 后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入阿霉素溶液作用24 h。阿霉素終濃度為0.25 μM、0.5 μM、1 μM、2 μM、4 μM、8 μM，同時設置對照孔（加入正常培養(yǎng)基）。每孔加入15 μL MTT 反應4 h，棄上清，加入DMSO 150 μL，振蕩5 min，用酶標儀測定波長為490 nm 處的光密度值（OD 值），按下式計算：細細胞增殖抑制率=（對照組OD 值-實驗組OD值）/對照組OD值×100%。

2.3 木犀草素對阿霉素誘導的AC16 細胞存活率的影響

取5×103對數(shù)生長期AC16細胞接種于96孔板中，每孔150 μL，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h 后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入不同濃度的Lut 及Dox（1μM）作用24 h。每孔加入15 μL MTT 反應4 h，棄上清，加入DMSO 150 μL，振蕩5 min，用酶標儀測定波長為490 nm處的光密度值（OD值），按下式計算：細胞增殖抑制率=（對照 組OD 值- 實驗 組OD 值）/對照 組OD 值×100%。

2.4 Hoechst33258 細胞熒光染色

將對數(shù)生長期AC16 細胞，調(diào)整細胞數(shù)為3 × 105個，種入6 孔板。分為正常組、Dox 組、Dox 加Lut 組。正常組加入空白培養(yǎng)基，Dox 組加入1 μM 的Dox，Dox加Lut 組加入1 μM 的Dox 及20 μM 的Lut。藥物處理24 h，棄培養(yǎng)基，PBS 洗3 次，4%多聚甲醛固定15 min，棄固定液，PBS 清洗3 次，加入Hochest33258 染液（濃度為5 μg/mL），每孔1 mL，室溫避光孵育15 min后，熒光顯微鏡下觀察并隨機選取3 個視野拍照，計數(shù)細胞中凋亡細胞的數(shù)目。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

2.5 總RNA提取與質(zhì)控

將對數(shù)生長期AC16 細胞，調(diào)整細胞數(shù)為3 × 105個，種入6 孔板。分組及給藥同2.4。藥物處理24 h后，棄培養(yǎng)基，每孔加入500 μL TRIzol。將3個重復孔細胞樣品轉移至RNase-free 的2 mL 離心管中，加入0.2 mL 氯仿，4℃12000 rpm 離心10 min。將上層水相移入干凈的離心管中，加入等體積異丙醇，12 000 rpm 4℃離心10 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀。室溫干燥10 min 后，加入50 μL RNase-free ddH2O，充分溶解RNA。Qubit 2.0檢測RNA 濃度，瓊脂糖凝膠檢測RNA完整性以及基因組污染情況。

2.6 mRNA文庫構建、測序

本研究利用Qubit2.0 RNA 檢測試劑盒對Total RNA 精確定量，以確定文庫構建所加入Total RNA 的量。用帶有oligo（dT）的磁珠將mRNA 進行富集并片段化，以短片段RNA 為模板，用六堿基隨機引物合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTP、RNase 和DNA polymeraseⅠ合成二鏈cDNA；將純化的雙鏈cDNA 再進行末端修復、加A 尾并連接測序接頭，連接產(chǎn)物純化和片段大小分選后再進行PCR 擴增，并通過純化獲得鏈特異性cDNA。按照1∶1 的比例等量混合后進行測序[4]。

2.7 差異表達基因篩選及功能富集分析

采用DESeq 進行顯著差異的基因分析，用Fold Change 值表示基因表達的差異倍數(shù)，按|log2（Fold Change）|＞1 且P ＜0.05，q ＜0.05 的原則篩選差異表達基因（differentiallyexpressed gene，DEG），并對篩選得到的DEG 進行聚類分析[4]。利用基因本體（Gene Ontology，GO）數(shù)據(jù)庫和基因組百科全書（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫，采用R clusterprofile3.12.0 包對交集的基因進行GO 與信號通路富集分析，以校正P ＜0.05為顯著性閾值[9]。

表1 不同濃度Dox對AC16細胞存活率的影響（± s，n = 4）

表1 不同濃度Dox對AC16細胞存活率的影響（± s，n = 4）

注：與正常組比較，*P ＜0.05

存活率%100.00 65.37±3.46*60.52±4.87*52.22±3.56*48.82±2.62*45.07±3.68*39.16±1.34*組別正常Dox濃度μM-0.25 0.5 1 2 4 8

表2 Lut對Dox誘導AC16細胞傷存活率影響（± s，n = 4）

表2 Lut對Dox誘導AC16細胞傷存活率影響（± s，n = 4）

注：與正常組比較，*P ＜0.05；與阿霉素組比，#P ＜0.05

存活率%100.00 54.57±2.48*63.78±2.56#64.97±6.15#68.27±3.59#組別正常Dox Dox+Lut濃度μM-1 1+5 1+10 1+20

表3 Lut對Dox誘導的AC16細胞凋亡的影響（± s，n = 3）

表3 Lut對Dox誘導的AC16細胞凋亡的影響（± s，n = 3）

注：與正常組比*P ＜0.05；與阿霉素比#P ＜0.05

凋亡率%6.00±1.00 43.67±2.08*23.33±2.52#組別正常Dox Dox+Lut濃度μM-1 1+20

2.8 統(tǒng)計方法

運用SPSS 21.0 進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(xˉ±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 不同濃度阿霉素對AC16細胞存活率的影響

正常組AC16 細胞生長良好，經(jīng)過0.25-8 μM Dox處理24 h 后，細胞生長活力呈現(xiàn)出不同程度的抑制，并呈明顯的濃度依賴性（P ＜0.05），結果見表1。根據(jù)Dox 對AC16 細胞生長抑制的情況，后續(xù)實驗選用Dox 1μM作用24 h建立心肌細胞損傷模型。

3.2 木犀草素對阿霉素誘導AC16 細胞損傷存活率影響

與正常組比較，Dox組AC16細胞存活率顯著降低（P ＜0.05）；與Dox 組比較，不用濃度Lut 處理后，AC16細胞的存活率明顯提升，細胞的存活率較Dox 組有顯著差異（P ＜0.05）。具體見表2。

3.3 Hoechst33258 染色檢測細胞凋亡的形態(tài)學

正常AC16 細胞核呈現(xiàn)均勻低強度藍色熒光，形態(tài)規(guī)則，呈橢圓形狀，存在一定比例的凋亡細胞，細胞凋亡率為6.00%±1.00%。經(jīng)Dox 處理后，細胞核呈固縮致密濃染，形態(tài)不規(guī)則染，凋亡細胞比例為43.67%±2.08%，顯著高于正常組（P ＜0.05）；Dox 加Lut 組細胞核形狀由不規(guī)則固縮致密濃染轉為規(guī)則橢圓形，可不同程度減輕Dox 引起的細胞凋亡，凋亡細胞比例降至23.33%±2.52%（P ＜0.05）。見圖1、表3。

3.4 各組細胞差異基因表達情況

將各組AC16 細胞轉錄組測序獲得的基因表達量進行標準化處理，兩組進行比較，篩選出差異基因，篩選條 件 為P-value＜0.05 且qValue＜0.05，和Fold change 大于2 倍及小于0.5 倍。如圖2、表4 所示，Dox組與正常組進行比較得到3637個差異基因，其中上調(diào)基因1 723 個，下調(diào)基因1 914 個；Dox 加Lut 組與Dox組進行比較得到212 個差異基因，其中上調(diào)基因52個，下調(diào)基因160個。

圖1 Hoechst 33258熒光染色法觀察AC16細胞凋亡的結果，白色箭頭所示為凋亡細胞（400 X）

圖2 細胞差異表達基因散點圖

圖3 細胞交集基因韋恩圖

表4 細胞差異表達基因統(tǒng)計表

3.5 差異表達基因GO富集分析

為了找到與用藥相關的差異基因，選取Dox 組對比正常組中上調(diào)且Dox加Lut組對比Dox組下調(diào)的137個基因；選取Dox組對比正常組中下調(diào)且Dox加Lut組對比Dox 組上調(diào)的32 個基因（圖3），對以上的交集基因進行GO 富集分析。鑒于差異表達基因數(shù)目較多，本研究從細胞組分、生物過程和分子功能3 大功能類別中各選取富集最顯著的10個GO term繪制柱狀圖進行展示。圖4顯示，生物過程富集的基因變化最強，其次是細胞組分，最后是分子功能。在生物過程類別中，主要變化的有細胞骨架、囊泡微管運輸，以及順向軸突輸送、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、鈣離子內(nèi)流等功能；在細胞組分類別中，主要變化是高爾基腔、細胞突觸和基底膜，在分子功能中，富集差異基因也主要與細胞膜結構相關，主要包括細胞周期蛋白調(diào)節(jié)，氧化應激、囊泡微管運輸?shù)?。上述結果表明，Dox主要對AC16心肌細胞骨架造成損傷，Lut 能夠從細胞骨架結構功能等方面改善Dox對AC16心肌細胞造成的損傷。

3.6 差異表達基因KEGG通路富集分析

以P ＜0.05 為顯著性閾值，對交集基因進行KEGG 富集分析，以最顯著變化的25 個通路繪制散點圖（見圖5），其中涉及的信號通路包括：化學致癌信號通路、細胞衰老、轉錄失調(diào)、代謝通路、AMPK 信號通路、細胞凋亡通路、mTOR信號通路等。

4 討論

圖4 細胞交集基因GO富集分析結果

化療是治療惡性腫瘤的主要手段之一，但很多化療藥物具有顯著心臟毒性，尤其以蒽環(huán)類藥物最為明顯。阿霉素亦稱多柔比星，是一種抗腫瘤抗生素，可抑制細胞RNA 和DNA 的合成，屬周期非特異性藥物，對多種腫瘤均有作用[10]。阿霉素存在嚴重的心臟毒性，主要表現(xiàn)為長期使用導致心肌病和慢性充血性心力衰竭[11]。有研究表明，當阿霉素累計使用劑量超過550 mg/m2時心臟毒性尤為明顯[12]。目前，右丙亞胺是唯一被FDA 批準用于預防蒽環(huán)類藥物所致心臟毒性的藥物，然而由于價格昂貴及嚴格的適應癥限制了其臨床應用[13]。

隨著中西醫(yī)結合防治腫瘤研究的不斷深入，以傳統(tǒng)中醫(yī)理論為指導，與現(xiàn)代前沿的醫(yī)學理論和研究成果相結合，從中藥中篩選出具有降低化療藥物心臟毒性的研究上取得了一些進展。周君等[14]觀察三黃抗氧化方改善乳腺癌患者術后蒽環(huán)類藥物化療心臟毒性的效果，結果表明，三黃抗氧化方通過抗氧化應激機制，效清除體內(nèi)過度自由基和氧化物，保護心肌細胞，從而緩解乳腺癌術后蒽環(huán)類藥物化療所致的心臟毒性。許茸茸等[15]發(fā)現(xiàn)，當歸紅芪超濾膜提取物可減輕阿霉素對心肌細胞DNA 的損傷，提高Bcl-2/Bax 表達水平從而抑制心肌細胞的凋亡，具有抗心肌細胞凋亡的保護作用。曲震理等[16]報道，川芎嗪具有對阿霉素所致心肌細胞氧化損傷的保護作用，其機制可能與其抗氧化、抗自由基作用有關。

桔梗為桔?？浦参锝酃latycodon grandiflorus(Jacq.)A.DC.的干燥根，味苦辛、性平，歸肺經(jīng)，具有宣肺利咽、祛痰排膿的功效。前期研究表明[17]，在治療乳腺癌肺轉移小鼠中，桔梗與阿霉素聯(lián)合應用，可在一定程度上提升乳腺癌肺轉移小鼠左心射血分數(shù)（LVEF）和左室短軸縮短率（LVFS）水平，增強心臟泵血功能；同時，桔梗與阿霉素聯(lián)合應用可促進阿霉素向靶向組織肺臟聚集并減緩消除，減少其向非靶向組織心臟的分布并加快消除。但其具體藥物活性成分及作用機制并不明確。

圖5 細胞交集基因KEGG富集分析結果

木犀草素是一種天然黃酮類物質(zhì)，具有多種藥理活性，存在于包括桔梗在內(nèi)的多種藥用植物中。Xiong等[18]實驗表明，木犀草素通過HO-1 介導的抗炎和抗氧化作用，保護脂多糖誘導的小鼠重癥急性胰腺炎。心肌缺血再灌注可發(fā)生嚴重的心律失常而導致猝死。Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)，木犀草素預處理對體外心肌細胞及缺血再灌注大鼠心肌有保護作用，其機制可能與下調(diào)NOX2 表達及p38/MAPK 磷酸化水平有關。本實驗通過體外建立阿霉素誘導的心肌細胞損傷模型，通過檢測細胞存活率及凋亡相關指標，觀察木犀草素對人AC16 心肌細胞損傷治療作用。研究結果顯示，阿霉素干預人AC16 心肌細胞后，心肌細胞生存率降低，細胞發(fā)生凋亡。而與阿霉素組相比，木犀草素能夠提高細胞生存率，抑制阿霉素誘導的心肌細胞凋亡。

作為基因組學研究的重要組成部分，轉錄組學是一門在整體水平上研究細胞和組織中所有基因的表達和調(diào)控的學科[20-21]。何升華等[22]基于轉錄組學測序（RNA-Seq）技術探討臨床經(jīng)驗方腰突顆粒防治腰椎間盤退變的可能分子機制，結果顯示，差異表達基因共有464個，其中上調(diào)基因有143個，下調(diào)基因有321個。差異基因的GO功能顯著性富集分析顯示，差異基因主要集中在生物過程部分的細胞調(diào)控與代謝過程中。差異基因的信號通路顯著性富集分析結果發(fā)現(xiàn)，主要集中在代謝相關通路。李冰濤[23]基于轉錄組學對葛根琴連湯治療型糖尿病的作用機制進行研究發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯14 組20 多個肝基因表達出現(xiàn)顯著差異，多與糖脂代謝相關。13個與糖脂代謝及炎癥反應基因己被單基因檢測證實。重要肝基因PPA、CEBP 和SREBP-1C表達上升，IRS2介導的PI3K信號轉導途徑被修復。

本實驗采用二代基因測序的方法，對木犀草素保護阿霉素誘導的人AC16 心肌細胞損傷差異基因的表達進行了轉錄組測序。實驗結果表明，藥物作用后，各組細胞的轉錄組水平發(fā)生了顯著改變，共篩選出了3 637 個差異基因。通過GO 及KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因涉及多條通路，如細胞骨架、囊泡微管運輸及鈣離子內(nèi)流等。細胞骨架對維護細胞正常結構、保持胞膜的完整性和執(zhí)行心肌收縮舒張功能有重要作用[24]。研究表明，心肌細胞骨架信號通路異常在心肌缺血再灌注，心肌肥大等疾病中發(fā)揮重要作用[25]。細胞囊泡是由質(zhì)膜脫落的直徑在100-1000 nm 的微小囊泡，是細胞結構改變的重要組成部分，當細胞生理發(fā)生改變或受到外來刺激時，細胞內(nèi)鈣離子超載，質(zhì)膜失去平衡，細胞膜褶皺形成囊泡釋放到細胞外，導致心臟相關疾病的發(fā)生[26]，本實驗研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素作用細胞后，差異基因主要富集于細胞骨架、囊泡及結構相關通路中，因此調(diào)控心肌細胞骨架及細胞結構損傷可能是抑制細胞凋亡的關鍵機制。

綜上所述，木犀草素抑制阿霉素誘導的人AC16細胞凋亡機制，可能是通過改善阿霉素對心肌細胞骨架損傷、細胞結構等發(fā)面發(fā)揮作用，但具體靶點基因復雜，后期有將針性的對上述信號通路中的差異靶點基因進行篩選及驗證，為進一步研究提供基礎。