楊愈剛 姚開源 薛嚇娟 鄭枝忠 郭銀樅

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院肛腸外科,漳州 福建 363000)

結(jié)腸癌是中國最常見的惡性腫瘤之一,占2013年所有腫瘤死亡人數(shù)的6%～8%[1-2]。結(jié)直腸癌的早期診斷可顯著提高患者的生存率，降低該惡性腫瘤患者的死亡率，但仍有不足40%的患者存在局限性[3-5]。microRNA(miRNA)是一類小的非編碼RNA，通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達[6-7]。 隨著miRNA和癌癥之間的聯(lián)系在2002年首次被報道[8],此后越來越多的證據(jù)表明異常表達的miRNA可以影響癌癥的發(fā)展，并發(fā)揮抑癌或致癌基因的作用。2008年P(guān).S.Mitchell等報道[9]，血清或血清中miRNA可作為生物標志物預(yù)測患者預(yù)后。miR-34a在多種腫瘤中發(fā)揮抑瘤基因的功能，如食管鱗狀癌、肝細胞癌、結(jié)腸癌和神經(jīng)母細胞瘤[10-13]。但miR-34a在結(jié)腸癌中的臨床意義尚不清楚。本研究旨在探討miR-34a在結(jié)腸癌血清中的表達情況和診斷價值。

1 材料與方法

1.1患者及采血情況 本研究共納入2010年1月至2013年5月在我院就診行手術(shù)治療的結(jié)腸癌患者126例，患者信息見表1。并招募了同期在我院健康體檢的66名志愿者作為健康對照組。結(jié)腸癌組中，男76例，女50例，年齡25～74(54.7±13.3)歲,術(shù)前均未接受化療或放療；健康對照組中，男39例，女27例，年齡21～73(51.2±12.9)歲。兩組年齡和性別等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究得到了福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院倫理委員會的批準。每位受試者簽署了書面知情同意書，按照相應(yīng)倫理和法律標準對所有標本進行匿名處理。樣本均在清晨從所有參與者靜脈血中抽取5 mL全血。所有血液樣本在12 000 rpm離心20 min在12000 rpm離心10 min,在4°C收集上層清液，隨后儲存在-80°C待進一步分析。

表1 結(jié)腸癌患者血清miR-34a表達與臨床指標之間的相關(guān)性

1.2RNA 抽提和實時定量聚合酶鏈反應(yīng) RNA 抽提和實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)依照參考文獻[16]，用2-ΔΔCt計算miR-34a在血清中的相對表達水平，cer-miR-39作為內(nèi)參基因。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以(Mean±s)表示，行t檢驗，計數(shù)資料行χ2檢驗，采用Kaplan-Meier曲線法進行患者生存率的單因素分析，組間的總體生存率和無瘤生存率的比較采用Logrank檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1miR-34a在血清中的表達水平 miR-34a在結(jié)腸癌患者術(shù)前血清水平(0.428±0.027)明顯比健康對照組(0.774±0.039)表達低(P<0.001,圖1A)。此外,無遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者術(shù)前血清miR-34a表達水平(0.494±0.042)明顯高于有遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者術(shù)前血清(0.375±0.035)(P=0.031,圖1B)。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者術(shù)前血清miR-34a表達水平(0.521 ± 0.041)明顯高于有遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者術(shù)前血清(0.354±0.034) (P=0.002,圖1C)。

注：A.在結(jié)腸癌患者中，miR-34a表達顯著低于對照組；B.miR-34a在遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者中的表達明顯低于未轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者；C.miR-34a在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者中的表達明顯低于無轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者。圖1 miR-34a在血清中的表達水平

2.2miR-34a在結(jié)腸癌患者術(shù)前和術(shù)后血清中表達水平 術(shù)后血清樣本miR-34a的相對表達水平(0.676 ± 0.028)顯著高于術(shù)前血清樣本(0.428 ±0.027)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3術(shù)前血清miR-34a表達與結(jié)腸癌臨床病理指標的關(guān)系 將126例結(jié)腸癌患者術(shù)前血清miR-34a表達的中位數(shù)分為高/低組。術(shù)前血清miR-34a的低表達與結(jié)腸癌的遠處轉(zhuǎn)移(P=0.032)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)、TNM分期(P=0.004)密切相關(guān)。而術(shù)前血清miR-34a的表達與年齡、性別、術(shù)前癌胚抗原(CEA)水平、組織學(xué)分級、腫瘤大小等指標無顯著差異(P>0.05)。

2.4術(shù)前血清miR-34a表達與結(jié)腸癌患者預(yù)后關(guān)系Kaplan-Meier生存分析顯示，術(shù)前血清miR-34a低表達組的患者總體生存時間和無瘤生存時間顯著較術(shù)前miR-34a高表達組的患者總體生存時間和無瘤生存時間短(總體生存：P=0.033，圖2A；無瘤生存：P= 0.004，圖2B)。

注：A.126例結(jié)腸癌患者總生存率Kaplan-Meier曲線；B.126例結(jié)腸癌患者無瘤生存率Kaplan-Meier曲線。圖2 術(shù)前血清miR-34a表達與結(jié)腸癌患者預(yù)后關(guān)系

3 討 論

本研究首先探討了血清miR-34a作為結(jié)腸癌患者無創(chuàng)生物標志物的潛在臨床應(yīng)用價值。首先，結(jié)腸癌患者術(shù)前血清miR-34a水平明顯低于健康對照組。其次，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者術(shù)前miR-34a水平低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或無遠處轉(zhuǎn)移患者。第三， 結(jié)腸癌患者術(shù)前血清miR-34a低表達與臨床惡性指標密切相關(guān)。最后，術(shù)前低miR-34a表達的結(jié)腸癌患者OS和DFS較差。以上研究數(shù)據(jù)表明，結(jié)腸癌患者術(shù)前血清中低表達的miR-34a預(yù)后不良。

研究[10-12]表明，miR-34a廣泛表達于各種組織和器官，在多種惡性腫瘤中下調(diào)表達。miR-34a已被證實是一種可以抑制許多關(guān)鍵癌基因的腫瘤抑制因子[13]。以往研究證實miR-34a可通過下調(diào)HMGB1基因表達抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲[14-15]。在本研究中，我們的結(jié)果顯示miR-34a在結(jié)腸癌患者中高度下調(diào)并與預(yù)后不良相關(guān)，這些結(jié)果與上述的報道一致。本研究首次報道了結(jié)腸癌患者血清中低表達的miR-34a可作為預(yù)測結(jié)腸癌預(yù)后的血清標志物和新的潛在治療靶點。然而，本研究仍然存在一些局限性，例如：樣本量相對較小和單中心回顧性設(shè)計。因此，需要更大規(guī)模、隨訪時間更長的前瞻性研究來驗證本研究結(jié)果的準確性。此外，miR-34a在結(jié)腸直腸癌中的潛在分子機制仍然尚未完全明確。還需要進一步的實驗來闡明miR-34a在結(jié)直腸癌中進展的分子學(xué)機制。

本研究首次證實了結(jié)腸癌患者中術(shù)前血清miR-34a的表達水平低于正常對照組,且血清中低表達的miR-34a與結(jié)腸癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān),暗示miR-34a可能在結(jié)腸癌進展中扮演關(guān)鍵的角色。