張瑤 陳麗展 吳朔 張艷 歐陽(yáng)海峰△

(1.西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 西安 710000；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 西安 710000)

致癌表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和間變性淋巴瘤激酶(ALK)在肺癌的靶向治療方面已顯示出有較好的前景[1-2]，但肺癌仍然是全球癌癥死亡的主要原因，每年約有160萬(wàn)人死于肺癌[3]。免疫檢查點(diǎn)已成為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)及許多惡性腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)[4]。此外，靶向程序性死亡受體1(PD-1)/程序性死亡配體1(PD-L1)的單克隆抗體，如納武單抗、派姆單抗等，已在臨床試驗(yàn)中發(fā)揮了重要的抗腫瘤作用[5-6]。關(guān)于PD-L1表達(dá)與NSCLC患者存活之間的關(guān)系已有報(bào)告[7-8]，但對(duì)于NSCLC患者在接受抗癌治療后的PD-L1表達(dá)變化研究卻較為少見(jiàn)。本研究旨在調(diào)查PD-L1在接受抗癌治療的NSCLC患者組織中的表達(dá)變化，以期為NSCLC患者的免疫治療提供更多的理論基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1樣本收集 收集2015年1月至2018年12月于空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科行病理學(xué)確診為NSCLC的76例患者的腫瘤組織，其中男46例，女30例，年齡39～89歲，中位年齡為67歲。本研究獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意。患者接受的抗癌治療有全身治療和非全身治療，其中，全身治療包括細(xì)胞毒性化療、放化療、EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)和間變淋巴瘤激酶基因(ALK)抑制劑，非全身治療包括手術(shù)切除(無(wú)輔助化療)，放射治療和切除。通過(guò)ARMS技術(shù)聯(lián)合Taqman探針檢測(cè)EGFR突變[9-10]。利用免疫組化分析PD-L1表達(dá)的變化，僅接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑或姑息性放療的患者被排除在外。

1.2PD-L1表達(dá)的免疫組化分析 所有腫瘤組織標(biāo)本均經(jīng)福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚度切片。切片經(jīng)過(guò)常規(guī)脫蠟和水化后，用0.3%H2O2的甲醇溶液處理30 min以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，在Tris-EDTA緩沖液(pH9.0)中在95 ℃下高壓滅菌40 min抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，在4 ℃下與兔抗人PD-L1單克隆抗體(1∶1 000稀釋，美國(guó)Spring Bioscience公司)一起溫育過(guò)夜，PBS沖洗3次。在室溫下加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔聚合物抗體(EnVision，K4002，美國(guó)Dako公司)孵育30 min，然后在室溫下用3,3’二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(K3468，美國(guó)Dako公司)孵育4 min，再用PBS沖洗，DAB顯色，Mayer蘇木精溶液輕度復(fù)染。由兩位病理學(xué)家獨(dú)立評(píng)估PD-L1的表達(dá)，為了獲得合格的標(biāo)本，評(píng)估了標(biāo)本中的巨噬細(xì)胞作為PD-L1免疫染色的內(nèi)部對(duì)照實(shí)驗(yàn)。根據(jù)之前報(bào)道，如果標(biāo)本中有超過(guò)1%的腫瘤細(xì)胞被染色，則被考慮為PD-L1陽(yáng)性表達(dá)，如果標(biāo)本中有超過(guò)50%的腫瘤細(xì)胞被染色，則被考慮為PD-L1強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)[11]。因此，我們根據(jù)PD-L1染色的腫瘤細(xì)胞百分比確定了兩個(gè)組：A組(陰性)：0%；B組(陽(yáng)性)：≥1%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Kaplan-Meier法對(duì)可能影響患者預(yù)后的指標(biāo)進(jìn)行單因素分析并繪制生存曲線。通過(guò)Log-rank時(shí)序檢驗(yàn)比較兩組生存曲線的差異。運(yùn)用Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析，使用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)比較了患者治療前和治療后PD-L1表達(dá)的分布。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1患者的一般資料比較 A組EGFR野生突變的人數(shù)顯著低于B組(P=0.039)，但兩組在年齡、性別、吸煙狀況、組織學(xué)及診斷階段等方面沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者的臨床特征比較

2.2PD-L1在治療前后表達(dá)的差異 76例患者在進(jìn)行抗癌治療前，有38例患者的腫瘤細(xì)胞具有陽(yáng)性PD-L1染色(B組，圖1)，占50%。

2.3患者治療情況 在本研究中，46例患者接受了全身治療，其中細(xì)胞毒性化療(包括輔助化療)者25例、放化療者8例、細(xì)胞毒性化療和EGFR-TKI者10例、EGFR-TKI者3例、ALK抑制劑者0例；30例患者接受了非全身性抗癌治療，其中手術(shù)切除(無(wú)輔助化療)者27例、放射治療者2例、切除者1例。進(jìn)行抗癌治療后，有36例患者的腫瘤細(xì)胞具有陽(yáng)性PD-L1染色，占47%，這與治療前相似(P=0.706)。與此同時(shí)，我們?cè)?5例(20%)患者的腫瘤組織標(biāo)本中觀察到PD-L1的表達(dá)顯著增加，在18例(24%)患者的腫瘤組織標(biāo)本中觀察到PD-L1的表達(dá)顯著減少(圖2)。在43例接受細(xì)胞毒性化療的患者中，有8例(19%)患者顯示PD-L1表達(dá)顯著增加，8例(19%)患者顯示PD-L1表達(dá)顯著減少。在使用EGFR-TKI治療的13例患者中，有5例(38%)患者顯示PD-L1表達(dá)顯著增加，1例(8%)患者顯示出PD-L1表達(dá)顯著減少。在30例接受了非全身性抗癌治療的患者中，只有2例(7%)患者顯示出PD-L1表達(dá)顯著增加，9例(30%)患者顯示出PD-L1表達(dá)顯著減少。與接受非全身性抗癌治療患者相比，接受EGFR-TKI治療患者的PD-L1表達(dá)顯著增加(P=0.031)。

2.4兩組預(yù)后比較 在患有Ⅰ期或Ⅱ期癌癥的患者中，診斷的隨訪時(shí)間中位數(shù)為45.6個(gè)月。B組患者的生存率低于A組(B組和A組的中位數(shù)分別為75.6個(gè)月，103.1個(gè)月，P=0.065)。見(jiàn)圖3。

注：A.陰性表達(dá)；B.陽(yáng)性表達(dá)。圖3 兩組Kaplan-Meier曲線分析結(jié)果

3 討 論

PD-L1，也稱B7-H1或CD274，是B7超家族中重要的成員，是Ⅰ型跨膜糖蛋白，廣泛表達(dá)于多種免疫細(xì)胞表面，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，除此之外，PD-L1還在多種癌組織中過(guò)表達(dá)；在病理狀態(tài)下，PD-L1與其受體 PD-1 結(jié)合，可顯著抑制T細(xì)胞的增殖和活化，使腫瘤發(fā)生免疫逃逸。

本研究中通過(guò)免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，43%的NSCLC患者在接受抗癌治療后，腫瘤組織標(biāo)本中的PD-L1的表達(dá)發(fā)生變化，且與非全身治療的患者相比，用EGFR-TKI治療的患者的PD-L1表達(dá)顯著增加，同時(shí)，預(yù)后分析顯示，PD-L1陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)對(duì)患者的預(yù)后沒(méi)有顯著性影響。程小珍等報(bào)道，肝癌患者在經(jīng)過(guò)治療之后，PD-L1表達(dá)顯著下降。J·F·Gainor等[13]回顧性地分析了EGFR突變的NSCLC患者在接受EGFR-TKI治療前和治療后活組織檢查樣本的PD-L1表達(dá)狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)15%的患者在EGFR-TKI治療前顯示腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)，而25%的患者在EGFR-TKI治療后顯示腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)(P=0.181)。潘貝晶等[14]通過(guò)研究142例女性三音性乳腺癌患者的資料，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的PD-L1表達(dá)與OS、PFS沒(méi)有明顯的相關(guān)性。以上結(jié)果均與本研究結(jié)果一致，并支持EGFR-TKI治療可能增加EGFR突變的NSCLC患者中PD-L1表達(dá)的假設(shè)。筆者推測(cè)，EGFR-T790M突變，HGF分泌、MET擴(kuò)增、IGF-1R活化、HER2擴(kuò)增、EMT、PTEN缺失等機(jī)制促使患者對(duì)EGFR-TKI治療產(chǎn)生耐藥，而EGFR-TKI耐藥細(xì)胞通則進(jìn)一步促進(jìn)PD-L1的表達(dá)，然而，目前對(duì)于耐藥細(xì)胞促進(jìn)PD-L1表達(dá)的機(jī)制尚不明確。

綜上所述，在接受抗癌治療后，部分NSCLC患者的腫瘤組織標(biāo)本的PD-L1的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，且EGFR-TKI治療似乎促進(jìn)了NSCLC患者的PD-L1表達(dá)。