樊竹青，楊文麗，謝 勇，李 麗

普洱學(xué)院 生物與化學(xué)學(xué)院，云南 普洱 665000

蕨類植物現(xiàn)存約12 000 種，我國(guó)有61 科，223屬，約2 600 種，其中可供藥用的約300 余種，主要分布在華南及西南地區(qū)。云南是中國(guó)蕨類植物資源最豐富的地區(qū)之一，約有1 500 種，特有種類達(dá)200余種[1]，其西南部的熱帶雨林中，廣泛分布著多種具有藥用價(jià)值的蕨類植物，尚待研究和開(kāi)發(fā)。

長(zhǎng)葉實(shí)蕨為實(shí)蕨科（Bolbitidaceae）植物，根莖扁平長(zhǎng)條狀，葉片形狀多樣。有清熱解毒、斂肺止咳、止血的功效，可治療咳嗽、吐血、痢疾、燒燙傷、跌打損傷、蛇咬傷、出血癥。

蕨類植物所表現(xiàn)出的功效與其所含的生物活性物質(zhì)是密不可分的，在蕨類植物的研究中，有關(guān)云南西南部蕨類活性成分的報(bào)導(dǎo)不多，對(duì)綠原酸的研究還是空白。選擇西雙版納熱帶雨林中長(zhǎng)葉實(shí)蕨、卷柏、劍葉鳳尾蕨、半邊旗為實(shí)驗(yàn)材料，測(cè)定其多糖、總黃酮及綠原酸含量，為藥用蕨類植物的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

采自云南省西雙版納州勐臘縣勐倫熱帶雨林中。將采集好的長(zhǎng)葉實(shí)蕨、半邊旗、鳳尾蕨、卷柏迅速洗凈、烘干、研碎后用袋子密封備用。

1.2 主要設(shè)備

島津UV-2550 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、JW-100S 型超聲波清洗機(jī)、G80F23N1P-M8（S0）型微波爐。

1.3 多糖含量的測(cè)定

分別稱取4 種蕨類植物干粉各兩份（1.0000g/份），按1∶30 加蒸餾水，充分浸泡，放入到微波爐中，中火處理，計(jì)時(shí)15min；然后將樣品放于80℃水浴中提取1h，定時(shí)攪拌；完成后離心，獲取上清液；放在60℃水浴中進(jìn)行濃縮，體積減至20～25mL 時(shí)即可。向濃縮液中加入無(wú)水乙醇，二者體積比為3：1，得到的混合液后進(jìn)行離心，棄上清液，留取沉淀物；沉淀物中加入3%三氯乙酸脫蛋白，放入冷凍干燥箱進(jìn)行冷凍干燥，所獲得產(chǎn)物即為多糖粗品。加入蒸餾水，使其充分溶解，再次定容至50mL，備用。

采用苯酚-硫酸法來(lái)測(cè)多糖含量。以無(wú)水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品（蒸餾水為溶劑），試劑空白作為參比，在最大吸收波長(zhǎng)490nm 處測(cè)定吸光度值。以吸光度值作為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按上述方法測(cè)樣品的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出多糖含量。

1.4 總黃酮含量測(cè)定

分別稱取4 種蕨類植物干粉各兩份（1.0000g/份）放入錐形瓶中，加入30 倍體積60%乙醇溶液，用超聲提取法，超聲設(shè)置功率為75W，溫度60℃、30min 進(jìn)行提取，對(duì)提取液進(jìn)行抽濾，獲得濾液，備用。

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（60%乙醇為溶劑），試劑空白作為參比，在最大吸收波長(zhǎng)520nm 處測(cè)定吸光度值。以吸光度值作為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按上述方法測(cè)樣品的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總黃酮含量。

1.5 綠原酸含量測(cè)定

分別稱取4 種蕨類植物干粉各兩份（1.0000g/份）放入錐形瓶中，加入15 倍體積95%乙醇，利用超聲提取法，超聲設(shè)置功率為60W，溫度50 ℃、40min 進(jìn)行提取，提取液進(jìn)行抽濾，濾液備用。

以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)溶液（95%乙醇為溶劑）試劑空白作為參比，在最大吸收波長(zhǎng)330nm 處測(cè)定吸光度值，以吸光度值作為縱坐標(biāo)，綠原酸濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 研究結(jié)果

2.1 多糖含量測(cè)定結(jié)果

用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于490nm 處測(cè)定各葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值（A），然后以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，回歸方程y=0.0064x+0.0048，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，表明葡萄糖在0-100 μg/mL 濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1 多糖含量測(cè)定結(jié)果

4 種蕨類植物多糖含量由高到低順序依次為半邊旗＞劍葉鳳尾蕨＞卷柏＞長(zhǎng)葉實(shí)蕨，含量最高的半邊旗或比含量最低的長(zhǎng)葉實(shí)蕨高出了1.5072%，這個(gè)差值甚至高于卷柏的含量。較高的兩個(gè)種均屬于鳳尾蕨屬。

2.2 黃酮含量測(cè)定結(jié)果

用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于520nm 處測(cè)定各蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值（A），然后以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，回歸曲線方程y=0.0124x-0.0104，相關(guān)系數(shù)=0.9991，表明蘆丁在0～48μg/mL 濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表2 總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

黃酮類化合物是藥用植物研究中關(guān)注度很高的活性成分。4 種蕨黃酮含量的差異不如多糖明顯，含量由高到低依次為長(zhǎng)葉實(shí)蕨＞卷柏＞半邊旗＞劍葉鳳尾蕨，與多糖含量的排序幾乎相反，長(zhǎng)葉實(shí)蕨的多糖含量最低但黃酮含量卻最高，多糖含量占優(yōu)勢(shì)的半邊旗和葉鳳尾蕨的黃酮含量卻較低。

2.3 綠原酸含量的測(cè)定結(jié)果

用紫外分光光度計(jì)于330nm 處測(cè)定各綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值（A），然后以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，回歸曲線方程y=0.0520x-0.0026，相關(guān)系數(shù)=0.9993，表明綠原酸在0～16μg/mL 濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表3 綠原酸含量測(cè)定結(jié)果

綠原酸有多種生物活性，通常認(rèn)為是植物體內(nèi)最重要的抗菌、抗病毒成分。4 種蕨的綠原酸含量依次為半邊旗＞卷柏＞長(zhǎng)葉實(shí)蕨＞劍葉鳳尾蕨，其中半邊旗和卷柏的綠原酸含量略占優(yōu)勢(shì)，但總體差異不大。

把4 種蕨類植物的多糖、總黃酮及綠原酸含量進(jìn)行比較（見(jiàn)圖1），看它們?cè)诓煌参锓N內(nèi)的變化趨勢(shì)。

從圖中可以看出，多糖含量相對(duì)較高且不同種間的差異明顯，半邊旗的多糖顯著高于其它3 個(gè)種；總黃酮和綠原酸的含量在4 種蕨類植物中則比較接近，種間差異很小。

3 討論

許柑葉對(duì)福州市高蓋山公園的8 種蕨包括芒萁、烏蕨、蕨、蜈蚣蕨、井欄邊蕨、金粉蕨、扇葉鐵線蕨、華南毛蕨的多糖做過(guò)測(cè)定，含量依次為5.49%、0.64%、1.73%、3.83%、1.22%、3.46%、4.76%、1.21%[4]；林勤等對(duì)福建漳州芝山公園半邊旗多糖的測(cè)定結(jié)果為2.18%[5]，實(shí)驗(yàn)中4 種蕨的多糖含量在1.2039%～2.7111%之間。在以上共涉及12個(gè)種的結(jié)果中，不同種蕨類植物的多糖含量差異較明顯，含量最高的芒萁可以達(dá)到5.49%，最低的烏蕨僅為0.64%，半邊旗和劍葉鳳尾蕨的含量處于中間位置。

在總黃酮的含量上，蘇云山對(duì)采自紅河、昭通、文山等地的15 個(gè)屬共32 個(gè)種的蕨類植物做過(guò)測(cè)定，結(jié)果狗脊蕨屬的狗脊蕨和單芽狗脊的分別達(dá)到了8.70%和8.38%，是32 個(gè)種中含量最高的[1]，其余多數(shù)種在1%～5%之間，但云南鳳尾蕨僅為0.50%；梁曉華對(duì)采自哀牢山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)的13 種蕨類植物總黃酮含量也做過(guò)測(cè)定，大多數(shù)蕨的總黃酮含量在1%～4%之間，但大葉假冷蕨葉片的總黃酮含量達(dá)到了令人驚訝的10.375%[6]，而筆管草卻僅為0.1%；傅玉萍對(duì)廣東湛江寸金產(chǎn)的半邊旗的總黃酮含量為0.78%[7]。實(shí)驗(yàn)中所測(cè)的4 種蕨總黃酮含量在0.2342%～0.3837%之間，處于中下水平?？傮w來(lái)看，總黃酮的含量也與多糖類似，也有較明顯的種屬差異性。

分析不同文獻(xiàn)對(duì)多糖和黃酮的測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)明顯差異的原因，除了種的因素外，采集地點(diǎn)、采集時(shí)間、植物的發(fā)育狀態(tài)、提取部位、提取及測(cè)定的方法和步驟等均可能對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響，需要重視這些影響因素帶來(lái)的數(shù)據(jù)變化。

綠原酸是藥用植物中另一種重要的生物活性物質(zhì)，但它的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，在提取過(guò)程中易發(fā)生異構(gòu)化，受熱、見(jiàn)光易氧化，這給綠原酸的測(cè)定增大了難度。有關(guān)蕨類植物的綠原酸含量的報(bào)導(dǎo)很少，從測(cè)定的結(jié)果來(lái)看，4 種蕨的含量在0.1113%～0.1519%之間，與其它藥用植物金銀花、山銀花相比，并沒(méi)有優(yōu)勢(shì)，但鑒于蕨類植物綠原酸含量方面的資料太少，還有必要展開(kāi)進(jìn)一步研究。

實(shí)驗(yàn)室在前期用4 種蕨的水提取液進(jìn)行了抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉作為指示菌時(shí)，4 種蕨類植物的水提取物可抑制除黑曲霉以外其余4 種微生物的生長(zhǎng)，并以半邊旗對(duì)大腸桿菌的抑制作用最為明顯，并表現(xiàn)出提取液濃度與抑菌性的正相關(guān)關(guān)系，但這種抑菌活性是否與上述3 種活性成分呈正相關(guān)關(guān)系，是后期將要繼續(xù)的工作。

4 結(jié)語(yǔ)

多種蕨類植物被載入《本草綱目》《神農(nóng)本草經(jīng)》等藥典，蕨類植物在民藥中也應(yīng)用廣泛，但相關(guān)研究成果卻不多。應(yīng)用現(xiàn)代科研手段，對(duì)有藥用價(jià)值的蕨類進(jìn)行系統(tǒng)研究，不僅是對(duì)中藥材開(kāi)發(fā)利用的發(fā)揚(yáng)光大，更重要的是把大自然饋贈(zèng)給人類的資源寶庫(kù)進(jìn)行濃度挖掘，更好造福于人類。