殷世亮，張弘，尹樹(shù)鑄，，昌盛，代澤成，周雅玲，張逍遙，王奕霖，康子安

（1. 沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110034；2. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院；3. 吉林化工學(xué)院）

高三尖杉酯堿（homoharringtonine，HHT）、三尖杉酯堿（harringtonine，HT）、異三尖杉酯堿（isoharringtonine，IHT）是從我國(guó)特有植物粗榧、海南粗榧中提取的生物堿，其中HHT 抗腫瘤活性最強(qiáng)［1-2］。20 世紀(jì) 70 年代我國(guó)率先將 HHT 應(yīng)用于急性白血病的臨床治療?，F(xiàn)有的研究表明HHT 及其衍生物能夠抑制白血病細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸的合成［3-4］。慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myelogenous leukemia，CML）是起源于骨髓內(nèi)以粒系細(xì)胞增生為主要表現(xiàn)的血液系統(tǒng)惡性克隆性疾病。超過(guò)90%的CML 患者存在Philadelphia 染色體，并特異表達(dá)具有酪氨酸激酶（TPK）活性的BCR／ABL 融合蛋白，以甲磺酸伊馬替尼（Imatinib）為代表的靶向作用于BCR／ABL 融合蛋白的酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）的臨床應(yīng)用，使得CML 的治療發(fā)生了根本性轉(zhuǎn)變，并成為治療 CML 的首選藥物［5-6］。本研究將 BCR／ABL 蛋白激酶抑制劑 Imatinib 與HHT 聯(lián)合給藥，考察二者合用在CML 細(xì)胞中的抗白血病作用，希望為臨床治療CML 患者提供更為合理有效的治療方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 HHT（北京協(xié)和藥廠）；Imatinib（美國(guó)Sigma 公司）；胎牛血清（澳大利亞Clark 公司）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國(guó) Hyclone 公司）；人類CML 細(xì)胞系KCL22 細(xì)胞（美國(guó)ATCC 公司）；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，100 ng／ml）、碘化丙啶（PI）（日本 Wako 公司）；兔抗 PARP（poly-（ADP-ribose）-polymerase）單克隆抗體（美國(guó) Abcam 公司）；鼠抗 anti-β-actin 單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz 公司）；兔抗Mcl-1 單克隆抗體（美國(guó)BD 公司）；增強(qiáng)型ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（德國(guó)Merck 公司）；蛋白定量試劑盒（碧云天公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將人類CML 細(xì)胞系KCL22 細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中。所用RPMI-1640 培養(yǎng)基中加入 10%（v／v）經(jīng)加熱滅活的胎牛血清，100 U／ml 青霉素和 100 U／ml 鏈霉素混合雙抗，以及1 mmol／L 谷氨酰胺。

1.3 DAPI 熒光染色法進(jìn)行細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察 復(fù)篩的細(xì)胞連續(xù)生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將細(xì)胞接種于 6 孔板中，以每孔 2×105／ml 的細(xì)胞密度接種KCL22 細(xì)胞，每孔加入4 ml 培養(yǎng)基。采用相應(yīng)濃度藥物處理相應(yīng)時(shí)間后，取2 ml 細(xì)胞懸液，2 000 r／min，離心 3 min，棄去細(xì)胞上清液，重懸于 200 μl 冰預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）中。將細(xì)胞懸液加入帶有濾紙片的載玻片套管中離心制片，1 000 r／min，離心 3 min，室溫放置 20 min 固定，然后加入 DAPI 染料 50 μl，用蓋玻片封片，染色10 min。在熒光顯微鏡360 nm 激發(fā)波長(zhǎng)下記錄并觀察KCL22 細(xì)胞的染色情況和細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。細(xì)胞呈現(xiàn)DAPI 著色藍(lán)色熒光并出現(xiàn)核皺縮、斷裂、邊緣化、發(fā)泡、發(fā)芽及凋亡小體等典型凋亡形態(tài)的細(xì)胞被認(rèn)為是早期凋亡細(xì)胞。細(xì)胞若呈現(xiàn)較弱DAPI 著色藍(lán)色熒光，細(xì)胞膨大破損，說(shuō)明細(xì)胞已經(jīng)死亡，為壞死細(xì)胞或晚期凋亡細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞PI 單染的流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)KCL22 細(xì)胞分別經(jīng) 0.2 μmol／L HHT 和 0.2 μmol／L Imatinib 處理 24 h 后離心收集細(xì)胞（3×106個(gè)），經(jīng)冰預(yù)冷的 PBS 洗滌，用 500 μl PBS 重懸細(xì)胞，加入50 ml 冰預(yù)冷的75%乙醇固定，過(guò)夜。離心收集細(xì)胞，PBS 洗滌后于 500 μg／ml 的 RNase 溶液中37 ℃孵育 30 min，加入 PI 染色液染色 10 min。制備樣品中DNA 含量采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，測(cè)定吸收波長(zhǎng)為625 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm。橫坐標(biāo)代表細(xì)胞染色熒光發(fā)射強(qiáng)度即DNA 的含量，縱坐標(biāo)代表所采集細(xì)胞的總數(shù)。檢測(cè)所得數(shù)據(jù)采用FCM分析系統(tǒng)軟件（Becton Dickinson）進(jìn)行分析處理。

1.5 Western blot 法檢測(cè) 通過(guò)Western blot 法考察了HHT 和Imatinib 單獨(dú)和聯(lián)合給藥后KCL22 細(xì)胞凋亡指示蛋白PARP 蛋白的活化裂解情況，以及Mcl-1 的蛋白表達(dá)水平。樣品細(xì)胞總蛋白（200 μg）通過(guò)RAPA 細(xì)胞裂解緩存液裂解得到，采用蛋白定量試劑盒定量蛋白，通過(guò)Bio-Rad 垂直凝膠電泳分離蛋白，并將總蛋白通過(guò)轉(zhuǎn)印半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，采用含有5%脫脂奶粉的TBST 緩沖液孵育1 h，將硝酸纖維素膜與相應(yīng)特異性單克隆抗體于4 ℃孵育過(guò)夜。采用TBST洗滌3 次后，與相應(yīng)抗體對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育1 h后TBST 洗滌1 次，經(jīng)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL Kit）孵育10 min 后于蛋白凝膠顯色系統(tǒng)（Bio-Rad）顯色并進(jìn)行圖形采集。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用One-way ANOVA，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Imatinib 和HHT 聯(lián)合給藥誘導(dǎo)KCL22 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察 通過(guò)細(xì)胞核熒光染料DAPI 染色后采用熒光顯微鏡觀察Imatinib 和HHT 單獨(dú)給藥及聯(lián)合給藥誘導(dǎo)KCL22 細(xì)胞凋亡作用。給予0.2 μmol／L Imatinib 或 0.2 μmol／L HHT 單 獨(dú) 處 理KCL22 細(xì)胞24 h，均未能誘導(dǎo) KCL22 細(xì)胞凋亡；當(dāng)采用 0.2 μmol／L Imatinib 和 0.2 μmol／L HHT 聯(lián)合處理KCL22 細(xì)胞24 h，可觀察到KCL22 細(xì)胞明顯的凋亡形態(tài)，Imatinib 和 HHT 誘導(dǎo)KCL22 細(xì)胞凋亡具有協(xié)同作用，見(jiàn)圖1。

圖1 熒光顯微鏡下觀察Imatinib 合用HHT 協(xié)同誘導(dǎo)KCL22 細(xì)胞凋亡的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（×400）

2.2 在不同劑量下，Imatinib 和HHT 聯(lián)合給藥誘導(dǎo)KCL22 細(xì)胞凋亡 分別將Imatinib 和HHT 以不同的濃度單獨(dú)或聯(lián)合給藥KCL22 細(xì)胞24 h，采用DAPI 熒光染色的細(xì)胞計(jì)數(shù)法對(duì)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果表明，單獨(dú)給予 KCL22 細(xì)胞 0.1、0.2 μmol／L Imatinib 或 0.2、0.4 μmol／L HHT 不能誘導(dǎo) KCL22細(xì)胞凋亡，當(dāng)采用 0.2、0.4 μmol／L HHT 與 0.1 μmol／L Imatinib 聯(lián)合給藥細(xì)胞 24 h，則分別誘導(dǎo)（49±4.2）%和（77±3）%的 KCL22 細(xì)胞凋亡；采用 0.2、0.4 μmol／L HHT 與 0.2 μmol／L Imatinib聯(lián)合給藥細(xì)胞24 h，則分別誘導(dǎo)（66±3.2）%和（92±2）%的 KCL22 細(xì)胞凋亡，Imatinib 與不同濃度HHT 合用均協(xié)同誘導(dǎo)KCL22 細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖2。

圖2 Imatinib 合用不同濃度HHT 協(xié)同誘導(dǎo)KCL22 細(xì)胞凋亡

2.3 在不同作用時(shí)間點(diǎn)下，Imatinib 和HHT 聯(lián)合給藥誘導(dǎo)KCL22 細(xì)胞凋亡 以培養(yǎng)12、24、48 h的KCL22 細(xì)胞作為對(duì)照，分別將 Imatinib 和 HHT各以 0.2 μmol／L 單獨(dú)或聯(lián)合給藥 KCL22 細(xì)胞 12、24、48 h，采用DAPI 熒光染色的細(xì)胞計(jì)數(shù)法對(duì)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果表明，單獨(dú)給予 KCL22 細(xì)胞0.2 μmol／L Imatinib 或 0.2 μmol／L HHT 處理 12、24、48 h，不能有效誘導(dǎo) KCL22 細(xì)胞凋亡；當(dāng)采用 0.2 μmol／L HHT 與 0.2 μmol／L Imatinib 聯(lián)合給藥 12、24、48 h，則分別誘導(dǎo)（25±2.7）%、（64±4.3）%、（93±1.9）%的 KCL22 細(xì)胞凋亡，可見(jiàn)在多個(gè)作用時(shí)間點(diǎn)下，Imatinib 與HHT 合用均可協(xié)同誘導(dǎo)KCL22 細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖3。

圖3 Imatinib 合用HHT 在不同時(shí)間點(diǎn)下協(xié)同誘導(dǎo)KCL22 細(xì)胞凋亡

2.4 Imatinib 和HHT 聯(lián)合給藥誘導(dǎo)KCL22 細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 給予0.2 μmol／L Imatinib或 0.2 μmol／L HHT 單獨(dú)處理 KCL22 細(xì)胞 24 h 后采用流式細(xì)胞術(shù)PI 染色檢測(cè)，KCL22 細(xì)胞分別有5.3%和7.9%細(xì)胞發(fā)生凋亡，與對(duì)照細(xì)胞2.7%凋亡率相比未出現(xiàn)顯著的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。當(dāng)采用 0.2 μmol／L Imatinib 和 0.2 μmol／L HHT 聯(lián)合處理KCL22 細(xì)胞24 h，采用流式細(xì)胞術(shù)PI 染色可以檢測(cè)出顯著的SubG1 期凋亡峰的存在，約63.5%的KCL22 細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖4。

2.5 Imatinb 和HHT 聯(lián)合處理KCL22 細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白的作用 將KCL22 細(xì)胞分別給予 0.2 μmol／L Imatinib 和 0.2 μmol／L HHT 處理 24 h，其抗凋亡蛋白Mcl-1 的蛋白表達(dá)水平下調(diào)并不顯著，當(dāng)對(duì) KCL22 細(xì)胞聯(lián)合給予 0.2 μmol／L Imatinib 和 0.2 μmol／L HHT 處理 24 h 后，其抗凋亡蛋白Mcl-1 的蛋白水平顯著下調(diào)，同時(shí)細(xì)胞凋亡指示蛋白PARP 被協(xié)同活化，見(jiàn)圖5。

圖5 Imatinib 合用HHT 對(duì)KCL22 細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白的影響

3 討論

現(xiàn)有的研究表明，Imatinib 并不能完全治愈CML，并隨著B(niǎo)CR-ABL 酪氨酸激酶抑制劑的廣泛應(yīng)用，臨床上對(duì)Imatinib 出現(xiàn)了廣泛的耐藥性。近年來(lái)的報(bào)道表明，HHT 對(duì)Imatinib 耐藥的CML 仍然敏感，對(duì)BCR-ABL 酪氨酸激酶突變的CML 患者仍然有效，美國(guó)FDA 已在2012 年批準(zhǔn)HHT 用于治療初治及酪氨酸激酶抑制劑耐藥的難治CML［7］。因此將 Imatinib 與 HHT 聯(lián)合用于 CML 及耐藥CML 的臨床治療可能會(huì)取得更好的治療效果。

在本研究中，Imatinib 與 HHT 聯(lián)合給藥具有協(xié)同誘導(dǎo)CML 細(xì)胞系KCL22 細(xì)胞凋亡的作用，并在不同劑量和作用時(shí)間點(diǎn)下其抗白血病作用具有良好的協(xié)同作用。采用 0.2 和 0.4 μmol／L HHT 處理KCL22 細(xì)胞12 和24 h，未能顯著引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生，同時(shí)采用 0.1 和 0.2 μmol／L Imatinib 處理KCL22 細(xì)胞12 和24 h 也不能夠引起顯著的細(xì)胞凋亡，但在此濃度下將Imatinib 和HHT 聯(lián)合給藥可顯著地誘導(dǎo)KCL22 細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究結(jié)果表明，Imatinib 與HHT 聯(lián)合給藥能夠誘導(dǎo)CML 細(xì)胞系KCL22 細(xì)胞發(fā)生凋亡，將兩者聯(lián)合給藥CML 細(xì)胞具有協(xié)同的抗白血病作用。

研究表明，HHT 可以誘導(dǎo)CML 細(xì)胞凋亡并下調(diào)Bcl-2 家族中抗凋亡蛋白Mcl-1 的表達(dá)水平并發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用［3］，因此應(yīng)用Western blot法考察了Imatinib 和HHT 單獨(dú)及聯(lián)合處理KCL22細(xì)胞后Mcl-1 的蛋白表達(dá)水平，以及細(xì)胞凋亡指示蛋白PARP 的裂解活化情況。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Imatinib 與HHT 聯(lián)合給藥可以顯著地下調(diào)KCL22細(xì)胞Mcl-1 的表達(dá)水平，并能引起細(xì)胞凋亡指示性蛋白PARP 的活化和裂解。Mcl-1 為線粒體抗凋亡蛋白Bcl-2 家族中重要成員，Mcl-1 蛋白的抑制或下調(diào)均可以引起白血病細(xì)胞的凋亡［8-9］。本研究提示HHT 可能通過(guò)下調(diào)Bcl-2 家族中抗凋亡蛋白Mcl-1 發(fā)揮協(xié)同Imatinib 誘導(dǎo)CML 細(xì)胞凋亡的抗白血病作用。

綜上所述，HHT 與 Imatinib 在不同劑量和不同時(shí)間點(diǎn)作用下，可以協(xié)同抑制KCL22 細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡，發(fā)揮了協(xié)同的抗白血病作用，希望我們的研究為CML 的臨床治療提供更為合理和有效的治療方案。