孟斐

（沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧 沈陽 110024）

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，據(jù)估計(jì)，2018 年全球約有57 萬新發(fā)病例和31.1萬死亡病例，占女性癌癥發(fā)病率的 6.6%，死亡病例的 7.5%，發(fā)病率及死亡率均居第四位，位于乳腺癌、肺癌及結(jié)腸癌后［1］。近年來隨著篩查手段以及人們篩查意識(shí)的提高，宮頸癌的發(fā)生率和死亡率呈現(xiàn)下降趨勢，但是宮頸癌易復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移、預(yù)后差、放化療不敏感等特點(diǎn)仍然嚴(yán)重威脅女性的生存質(zhì)量［2］。人乳頭瘤病毒（HPV）被認(rèn)為是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的原因之一。HPV 屬于乳頭多瘤空泡病毒科，乳頭瘤病毒屬，可分為早期區(qū)、晚期區(qū)和上游區(qū)，其中早期區(qū)編碼的E1-E7 蛋白與病毒的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄功能關(guān)系密切。HPV 對上皮細(xì)胞和黏膜有高親噬性，可以通過微小創(chuàng)口感染鱗狀上皮的基底層細(xì)胞，并隨著基底層上皮細(xì)胞向表層細(xì)胞分化而完成DNA 的復(fù)制。在分化的表層上皮中，HPV 開始合成高拷貝數(shù)量的DNA，并合成衣殼，組裝并釋放病毒，造成感染。持續(xù)性HPV 感染會(huì)引起病毒DNA 整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中，大多數(shù)早期及晚期基因會(huì)被破壞而失活，但編碼E6、E7 的基因會(huì)被保留，同時(shí)其中E2 基因作為一種具有調(diào)控功能的基因，它的失活也會(huì)導(dǎo)致E6／E7 基因在宿主細(xì)胞內(nèi)過量表達(dá)，參與宮頸癌的發(fā)生。但HPV 的致癌機(jī)制仍未被完全闡明，本研究欲對HPV E6／E7、E5 及E2 蛋白與宮頸癌關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 HPV E6／E7 與宮頸癌

1.1 HPV E6／E7 HPV E6 基因定位于細(xì)胞核內(nèi)，編碼約150 個(gè)氨基酸，位于E7 開放讀碼框的上游，E6 蛋白發(fā)揮功能作用主要依靠鋅指結(jié)構(gòu)，通過結(jié)合鋅離子使細(xì)胞永生化，同時(shí)影響轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞蛋白結(jié)合。HPV E7 癌蛋白含有98 個(gè)氨基酸，沒有已知的酶活性或DNA 結(jié)合域，C 末端鋅指狀結(jié)構(gòu)域也與其他病毒癌蛋白相似，被命名為CR3。這些結(jié)構(gòu)上的相似性反映在病毒癌蛋白之間的轉(zhuǎn)化和反式激活的功能上的相似性。HPV E7 癌蛋白對病毒的正常生命周期和從良性前體病變到浸潤性癌的整個(gè)癌癥發(fā)展過程都是必不可少的。

1.2 HPV E6／E7 致癌機(jī)制 高危HPV 編碼的E6和E7 被認(rèn)為是影響宮頸細(xì)胞多步轉(zhuǎn)化過程的主要因素，能夠分別抑制p53 和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRb），并與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、基因組穩(wěn)定性和表觀遺傳修飾的大量細(xì)胞信號因子相互作用［3-4］。也有研究指出E6／E7 病毒蛋白通過抑制細(xì)胞周期依賴性激酶（CDK）抑制劑（p21、p27、p16）和降解p53 和 pRb 破壞細(xì)胞周期檢查點(diǎn)控制［5］。

高危型HPV E6 蛋白C 末端是一段高度保守的PDZ 結(jié)合域，由4 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，介導(dǎo)其與宿主細(xì)胞的 PDZ 蛋白間的相互作用［6-7］，同時(shí)也有研究表明E6 蛋白也可以激活原癌基因C-myc，抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的轉(zhuǎn)錄抑制物，激活端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生［8］。也有研究指出HPV E6 蛋白可以通過上調(diào)氯離子通道蛋白5（CLCN5）的表達(dá)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移［9］。干擾素是重要的抗病毒藥物，可以調(diào)節(jié)病毒感染的初始和持續(xù)階段。同時(shí)，HPV 可以從多方面調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞對干擾素的應(yīng)答。首先，HPV E6 蛋白可以通過下調(diào)多種干擾素應(yīng)答基因表達(dá)水平，抑制干擾素的應(yīng)答；其次，高危型HPV E6 可以通過抑制干擾素應(yīng)答因子3（IRF3）對干擾素應(yīng)答基因的激活能力抑制干擾素的應(yīng)答［10］；此外，HPV E6可以通過與p53 和p300／CBP 相互作用，影響干擾素應(yīng)答能力，促使人角質(zhì)細(xì)胞生長停滯，使HPV感染的細(xì)胞癌變［11］。

E7 主要起轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。E7 基因調(diào)控的最佳機(jī)制是通過 pRb／E2F 系統(tǒng)。pRb 家族蛋白，也被稱為“袖珍蛋白”，其部分功能是通過與E2F 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并向啟動(dòng)子招募轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物［12］。E7與pRb 家族成員結(jié)合并靶向降解，從而破壞抑制性復(fù)合物，促進(jìn)DNA 合成機(jī)制在其他有絲分裂后分化的角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)。E7 降解pRb 將導(dǎo)致細(xì)胞周期的非計(jì)劃進(jìn)入S 期，最終促進(jìn)細(xì)胞增殖［13］。HPV 病毒復(fù)制要求細(xì)胞進(jìn)入 S 期細(xì)胞周期。這是通過滅活pRb 并釋放E2F 家族轉(zhuǎn)錄因子來實(shí)現(xiàn)的，這些轉(zhuǎn)錄因子允許細(xì)胞周期從G1 檢查點(diǎn)進(jìn)行，一旦越過G1 檢查點(diǎn)，細(xì)胞可以不受影響，進(jìn)入 S 期，完成細(xì)胞增殖。E2F 家族可介導(dǎo)細(xì)胞增殖和p53 依賴或獨(dú)立凋亡。E2F 的過度表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白D1、依賴性激酶活性的抑制和細(xì)胞周期相關(guān)基因CDKN2A、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑 2A（p16）基因產(chǎn)物的過度表達(dá)［13］ 。

一般來說，感染后宿主細(xì)胞激活先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，這些系統(tǒng)由主要的組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ和Ⅱ類控制。MHC Ⅰ類分子向CD8＋受體的細(xì)胞毒性T 細(xì)胞提供抗原，MHCⅡ類分子向CD4＋受體的輔助T 細(xì)胞提供抗原。在HPV感染過程中，病毒進(jìn)入上皮細(xì)胞，這是抵抗感染的最外層物理屏障，并激活宿主的固有免疫系統(tǒng)。巨噬細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞試圖通過表達(dá) Toll 樣受體（TLRs）來抑制 HPV。TLRs 識(shí)別病毒成分并激活轉(zhuǎn)錄因子，如核因子κB（NF-κB）和 IRF3，產(chǎn)生細(xì)胞因子［14］。同時(shí)也有研究證明E7 可以通過誘導(dǎo)TLR9 啟動(dòng)子形成抑制復(fù)合物來抑制 TLR9 的表達(dá)［15］。這個(gè)復(fù)合物含有 NF-κB，但不是被激活，而是含有組蛋白脫乙酰酶（HDAC）和組蛋白去甲基化酶來抑制TLR9 的表達(dá)［15］。但是選擇性激活是如何實(shí)現(xiàn)的還不清楚。角質(zhì)細(xì)胞感染高風(fēng)險(xiǎn)的HPV 基因型與癌癥的發(fā)生有關(guān)。來自 HPV16、18、62 和 84，特別是高風(fēng)險(xiǎn)HPV16 和HPV18 E6 上調(diào)了角質(zhì)細(xì)胞中IL-6 的表達(dá)，這可能有助于促進(jìn)炎癥和高度增殖的微環(huán)境，并且可以長期保留，最終導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生［16］。

2.1 HPV E5 HPV E5 蛋白是一種細(xì)胞膜結(jié)合蛋白，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基復(fù)合體及細(xì)胞膜上，分子量較小，主要通過上調(diào)細(xì)胞生長因子受體發(fā)揮生物學(xué)功能，在病毒感染上皮組織之后，E5 常與E6、E7 蛋白共同作用，影響病毒的增殖和宿主細(xì)胞的永生化，參與宿主細(xì)胞的癌變。

2.2 HPV E5 的致癌機(jī)制 既往認(rèn)為，在病毒與宿主細(xì)胞整合時(shí)，E5 常常因缺失不參與促進(jìn)癌癥發(fā)生發(fā)展。但最新研究認(rèn)為，腫瘤病例中HPV16病毒基因組并不只是單純完全整合到宿主細(xì)胞基因組中（E2／E7 ＝0），還同時(shí)存在游離型（E2／E7＝1）以及介于之間的混合型，且病毒整合多發(fā)生在腫瘤早期［20-21］，因此我們可以認(rèn)為E5 在晚期腫瘤細(xì)胞中仍然有表達(dá)的可能。病毒可以阻礙宿主細(xì)胞自噬及利用這一過程進(jìn)行增殖，在HPV16 感染早期，E5 蛋白強(qiáng)烈抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的自噬，而角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子受體（KGFR）的高表達(dá)則促進(jìn)這一過程，故E5 蛋白和KGFR 之間的相互影響可能是HPV 擾亂上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制［22］。HPV16 E5 抑制 ATPase 質(zhì)子泵的作用，使細(xì)胞內(nèi)堿化，突觸小泡融合受到抑制，改變了表皮生長因子（EGF）的內(nèi)吞途徑，阻礙EGF 受體（EGFR）的降解，使 EGFR 增多［23］。Met 是一種對腫瘤細(xì)胞侵襲、運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要的生長因子受體。HPV E5 蛋白還具有促進(jìn)c-MET 表達(dá)的能力，這在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要作用［24-25］。

1.3 觀察指標(biāo)及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 觀察兩組患者傷口從清創(chuàng)縫合術(shù)后到拆線期間痂皮損傷及傷口愈合情況。①痂皮損傷判斷:以傷口因肉芽組織或痂皮撕脫而出血或滲血為標(biāo)準(zhǔn)。②傷口愈合評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［1］:Ⅰ期愈合:傷口邊緣對合良好或傷口缺損不大，局部無感染、血腫或壞死組織，再生和修復(fù)過程迅速，傷口修復(fù)以纖維組織為主，傷口愈合快，功能良好;Ⅱ期愈合:傷口有較多的缺損或空隙，邊緣不整，傷口有紅腫及炎癥反應(yīng)，修復(fù)以纖維組織為主，大量肉芽組織填充創(chuàng)腔，最后上皮組織覆蓋，愈合時(shí)間長，瘢痕明顯，功能欠佳;Ⅲ期愈合:感染傷口敞開和引流后，待感染控制和肉芽組織健康時(shí)再進(jìn)行縫合。

2.3 HPV E5 與 miRNAs 研究發(fā)現(xiàn)，在 HPV16 E5 陽性的宮頸癌細(xì)胞系，miR-196a 表達(dá)量明顯減少，提示HPV16 E5 蛋白能特異性下調(diào)miR-196a的表達(dá)［28］。同時(shí)，HPV16 E5 蛋白還能特異性上調(diào)HoxB8 的表達(dá)，而該基因是miR-196a 的作用靶點(diǎn)之一，兩者表達(dá)量的變化對正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為宮頸癌有協(xié)同促進(jìn)作用［28］。E5 蛋白可以通過影響miRNAs-mRNA 靶向軸，影響宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。但具體調(diào)節(jié)方式仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)支持。

HPV16 E5 蛋白與 E6、E7 相互作用也可以促進(jìn)癌癥的發(fā)展。Maufort 等［26］用雌激素處理 E5 轉(zhuǎn)基因小鼠和非E5 轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果前者出現(xiàn)的異常宮頸上皮細(xì)胞更多，此外，與僅表達(dá)一種病毒癌基因的小鼠相比，E5 與E6 或E7 聯(lián)合可以誘發(fā)更嚴(yán)重的腫瘤疾病。Hu 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，HPV16 E5 與E6、E7 共作用能增加雙核細(xì)胞的形成率，而雙核細(xì)胞形成將導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性增加；同時(shí)還能使形成的雙核細(xì)胞大量繁殖。由此我們可以認(rèn)為，E5 在腫瘤發(fā)生的早期及晚期均有作用，且與HPV E6、E7 共同促進(jìn)癌癥發(fā)生發(fā)展的作用。

2 HPV E5 與宮頸癌

(3)不同油藏的原油組分含量不同，其CO2驅(qū)最小混相壓力也存在差別，實(shí)際油藏的MMP與C2～C6組分具有負(fù)相關(guān)關(guān)系。

1.3 HPV E6／E7 與 miRNAs miRNAs 參與多種基本的細(xì)胞過程，包括癌變。異常表達(dá)的miRNAs 作為新型生物標(biāo)志物在宮頸癌診斷中的應(yīng)用潛力越來越大。張蔚等［17］實(shí)驗(yàn)證明與陰性對照組比較，在轉(zhuǎn)染HPV16 E6 siRNA 的 SiHa 細(xì)胞中 miR-21、miR-9、miR-31 相對表達(dá)量明顯下調(diào)，miR-497、miR-218 相對表達(dá)量明顯上調(diào)，證明了異常miRNAs 表達(dá)與 HPV E6 基因相關(guān)；同時(shí)轉(zhuǎn)染 HPV16 E7 siRNA 的 SiHa 細(xì)胞中 miR-21、miR-9、miR-31

杜威則特別重視教師指導(dǎo)下的兒童學(xué)習(xí)活動(dòng)，這種學(xué)習(xí)活動(dòng)促使兒童從經(jīng)驗(yàn)中學(xué)習(xí)。他還把學(xué)生獲得知識(shí)的源泉?dú)w結(jié)為學(xué)生個(gè)人的親身生活和實(shí)踐；把教學(xué)過程看作學(xué)生做、思、學(xué)三者的統(tǒng)一過程；他強(qiáng)調(diào)根據(jù)學(xué)生的既有經(jīng)驗(yàn)和學(xué)生的思維特點(diǎn)確定問題的適當(dāng)難度；他認(rèn)為要真正體現(xiàn)學(xué)生的愿望與要求，教師就必須隨時(shí)了解兒童每天所具有的特殊活動(dòng)，了解他們的各種不同的需要與要求。

相對表達(dá)量明顯下調(diào)，miR-497、miR-218 相對表達(dá)量明顯上調(diào)，宮頸癌組織中異常表達(dá)的miRNAs與HPV16 E6／E7 基因有關(guān)。另一項(xiàng)研究顯示miR-409-3p 直接參與了E6 癌基因水平的調(diào)控，從而證實(shí)了該miRNA 在宮頸惡性腫瘤中的潛在抑癌功能［18］。另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)也證明 5azadC 治療上調(diào) miR-375 水平，抑制 HPV16 E6 表達(dá)，其 miR-375 抑制劑的使用明確了 miR-375 參與 E6 抑制［19］。但HPV E6 與miRNAs 相互作用機(jī)制尚不明確，尚需要進(jìn)一步研究以明確E6 與轉(zhuǎn)錄因子和信號蛋白的相互作用。

與國內(nèi)項(xiàng)目相比，受到政治、經(jīng)濟(jì)、社會(huì)等因素影響明顯增多，風(fēng)險(xiǎn)相對增大。由于在進(jìn)行報(bào)價(jià)的時(shí)候需要考慮這些風(fēng)險(xiǎn)，因此一旦能夠采取合理措施，將風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行合理管理和控制，減少風(fēng)險(xiǎn)帶來的損失，獲利的可能性和空間也相應(yīng)增大。

3 HPV E2 與宮頸癌

3.1 HPV E2 HPV E2 蛋白是病毒生命周期中的關(guān)鍵蛋白，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA 復(fù)制啟動(dòng)和病毒基因組分割等方面具有重要的功能［29］。它具有由富含絲氨酸、精氨酸的鉸鏈區(qū)連接的DNA 結(jié)合域和反式激活域。E2 通常是病毒長控制區(qū)（LCR）中與同源序列（E2 結(jié)合位點(diǎn)［E2BSs］）結(jié)合的同型二聚體，有證據(jù)表明E2 參與控制病毒早期啟動(dòng)子，另一方面，E2 最重要的作用可能是作為輔助復(fù)制因子［29］。在 DNA 復(fù)制的起點(diǎn)，E2 與 HPV E1復(fù)制解旋酶相互作用，促進(jìn)細(xì)胞 DNA 復(fù)制［29］。E2 在被感染細(xì)胞分裂過程中，通過與染色質(zhì)適配器蛋白的相互作用，將病毒游離基因組與宿主有絲分裂染色體系在一起，在病毒游離基因組的分割過程中發(fā)揮重要作用。

3.2 HPV E2 的致癌機(jī)制 在癌變過程中，HPV16 DNA 整合到宿主細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致調(diào)節(jié)基因E2 的表達(dá)缺失，而E2 在乳頭瘤病毒中相對保守［30］。E2 蛋白除了作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子外，還對良性病變中的 HPV E6 和 E7 負(fù)性調(diào)節(jié)［31］。高危型HPV 中的E2 蛋白已被證實(shí)能影響細(xì)胞的增殖、凋亡、病毒生命周期的調(diào)節(jié)和基因表達(dá)等過程［32-33］。以往的研究表明HPV E2 上調(diào)人C1q（gC1qR）基因表達(dá)，導(dǎo)致線粒體功能障礙而誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡［34-35］，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) E2 介導(dǎo)的 E6／E7 抑制可能支持腫瘤細(xì)胞的局部擴(kuò)散和侵襲性［36］。同時(shí)E2還參與細(xì)胞凋亡調(diào)控、細(xì)胞周期、角質(zhì)形成細(xì)胞遷移和分化以及細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)相互作用。有證據(jù)表明 E2 可以與其他病毒蛋白結(jié)合，如E4［37］、E6［38］、E7［39］、L1［40］和 L2［41］。特別是 E2結(jié)合L1 和L2 可能影響病毒衣殼的形成和病毒的釋放。

4 展望

盡管宮頸癌的發(fā)病率及死亡率在減少，但它折磨女性的生理及心理。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展經(jīng)歷數(shù)年至數(shù)十年，即便有些女性感染HPV 并不致癌，但是頻繁的用藥和往返醫(yī)院檢查以及病毒感染這一事實(shí)都使女性心理承受巨大壓力。雖然宮頸癌的發(fā)病原因紛繁復(fù)雜，但是其與HPV 的感染有明確的相關(guān)性，對于HPV 各組分的確切研究是攻克宮頸癌的前提條件。目前對于HPV 各個(gè)成分研究已經(jīng)初見成效，比如，HPV 的 L1 及 L2 蛋白只表達(dá)抗原而不含有可復(fù)制的病毒，所以通過重組DNA 技術(shù)表達(dá) L1 或 L1 和 L2 蛋白，形成病毒樣顆粒，不含有病毒核酸，其空間構(gòu)象及抗原性與天然HPV 相似，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，從而達(dá)到預(yù)防HPV 感染的目的。目前，治療性疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床前試驗(yàn)及臨床試驗(yàn)階段，相信終有一天子宮頸癌將不再威脅女性的生命及生存質(zhì)量。