劉慧麗，闕文忠，林燕燕*，林澤燕，徐文鑫，蔡陽(yáng)艷

（1. 漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)檢測(cè)應(yīng)用技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 漳州 363000；2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科；3. 漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一類髓系造血干／祖細(xì)胞惡性疾病，以骨髓與外周血中原始和幼稚髓性細(xì)胞異常增生為主要特征。盡管治療方法和新技術(shù)不斷優(yōu)化和發(fā)展，絕大多數(shù)患者預(yù)后仍不理想［1-2］。因此，迫切需要新的藥物來(lái)輔助治療、提高療效。從植物中開(kāi)發(fā)出低毒、高效甚至高度特異性的靶向藥物一直是臨床熱點(diǎn)之一。植物總黃酮（TFG）具有抗氧化、抗腫瘤等多種活性，尤其在抗腫瘤的開(kāi)發(fā)中具有潛在的價(jià)值。有文獻(xiàn)報(bào)道其在乳腺癌、肺癌、食管癌等實(shí)體瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)均有誘導(dǎo)凋亡的作用［3-6］，但對(duì)血液系統(tǒng)的腫瘤研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本課題組從白鳳菜（Gynura formosanaKitam.）中提取了TFG，旨在體外觀察 TFG 對(duì) AML Kasumi-1 細(xì)胞的增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Kasumi-1 細(xì)胞由福建醫(yī)科大學(xué)天然藥物藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；RPMI 1640培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；噻唑藍(lán)（MTT）細(xì)胞凋亡試劑盒、Annexin V-FITC／PI 凋亡試劑盒、線粒體膜電位試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；熒光顯微鏡、多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司。

1.2 方法

1.2.1 TFG 的制備 白鳳菜由臺(tái)灣引種，TFG 的制備參見(jiàn)文獻(xiàn)［7］。根據(jù)亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法使樣液顯色，測(cè)定吸光度［8］，計(jì)算樣液中的 TFG 含量為 2.76 mg／ml。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將Kasumi-1 細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2、濕度飽和的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 1 ～2 d 傳代1 次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2.3 細(xì)胞抑制率檢測(cè) 使用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞體外增殖。以5×103個(gè)／孔的密度將細(xì)胞接種于96 孔板 100 μl 的培養(yǎng)基中，設(shè) 4 個(gè)重復(fù)孔，利用高壓滅菌的蒸餾水稀釋TFG，使各組TFG 至終質(zhì)量濃度分別為 0、6.25、12.5、25、50、100 μg／ml 并分別培養(yǎng)24、48 h。空白對(duì)照為無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基，有Kasumi-1 細(xì)胞而未添加TFG 的孔為陰性對(duì)照組（100 μl）。隨后，在每個(gè)孔中加入 10 μl MTT 溶液（5 mg／μl 溶解于 PBS），將其放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育 4 h。每孔加入 100 μl Formazan 溶解液，適當(dāng)混勻，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育 3 h，直至Formazan 全部溶解。隨后酶標(biāo)儀在570 nm 測(cè)定吸光度，重復(fù)3 次，計(jì)算細(xì)胞存活率和抑制率。細(xì)胞存活率 ＝（A實(shí)驗(yàn)- A空白）／（A對(duì)照- A空白）×100%；抑制率＝1-細(xì)胞存活率。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×105個(gè)／孔接種于6 孔板，設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組TFG終質(zhì)量濃度為 0、6.25、12.5 和 25 μg／ml，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，隨后在倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察并拍照。

1.2.5 線粒體膜電位檢測(cè) 將Kasumi-1 細(xì)胞用TFG 終質(zhì)量濃度為 0、6.25、12.5 和 25 μg／ml 作用 24 h 后，1 000 r／mim 離心 5 min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS 輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取1×105重懸的細(xì)胞，1 000 r／mim 離心 5 min，棄上清，加入188 μl Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入 2 μl Mito-Tracker Red CMXRos 染色液、5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。室溫避光孵育20～30 min，孵育過(guò)程中重懸細(xì)胞2～3 次，隨后置于冰浴20 min，1 000 r／mim 離心 5 min，收集細(xì)胞，用100 μl Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇視野拍照。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Kasumi-1細(xì)胞，以 5×104個(gè)／ml 接種 3 ml／孔于 6孔板，培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。各組分別用0、6.25、12.5 和 25 μg／ml 的 TFG 作用于細(xì)胞 24 h 后各自收集培養(yǎng)體系內(nèi)全部細(xì)胞，1 200 r／min 離心 5 min，棄上清，加入 195 μl Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，依次加入 5 μl Annexin V-FITC、10 μl 碘化丙啶（PI）染色液，輕輕混勻。室溫（20～25 ℃）避光孵育 10 ～20 min，隨后置于冰浴中，隨后充分混勻入流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.7 細(xì)胞周期檢測(cè) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Kasumi-1細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液 5×104個(gè)／ml，接種3 ml／孔于 6 孔板，各組分別用 0、6.25、12.5 和25 μg／ml 的 TFG 作用于細(xì)胞，培養(yǎng)箱中孵育 24 h。隨后收集各培養(yǎng)體系中全部細(xì)胞，1 000 r／min 離心5 min，棄上清，加入1 ml 預(yù)冷 PBS 重懸細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，加入1 ml 冰浴預(yù)冷70%乙醇，吹打混勻，4 ℃ 固定 2 h，隨后 1 000 r／min 離心 3 min，棄上清，預(yù)冷 PBS 洗滌 2 次，每管細(xì)胞樣品中加入0.5 ml PI 染色液，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，37 ℃避光溫浴 30 min。充分混勻后，進(jìn)樣于流式細(xì)胞儀檢測(cè)計(jì)算 G0／G1、S、G2／M 期所占百分比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析、t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TFG 對(duì)Kasumi-1 細(xì)胞體外增殖抑制的影響與對(duì)照組比較，TFG 作用 24 h 后 12.5 μg／ml 及以上濃度實(shí)驗(yàn)組，TFG 作用 48 h 后 6.25 μg／ml 及以上濃度實(shí)驗(yàn)組，Kasumi-1 細(xì)胞抑制率呈現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05），呈濃度依賴效應(yīng)。分別以24和48 h 的抑制率對(duì)TFG 濃度繪制生長(zhǎng)抑制曲線，可得 TFG 對(duì) Kasumi-1 作用 24 h 和 48 h 的 IC50分別為 18.80 μg／ml 和 7.9 μg／ml。見(jiàn)圖 1。

圖1 TFG 對(duì)Kasumi-1 細(xì)胞體外的生長(zhǎng)抑制率

2.2 TFG 對(duì)Kasumi-1 細(xì)胞形態(tài)的影響 Kasumi-1細(xì)胞易成團(tuán)生長(zhǎng)；隨著 TFG 質(zhì)量濃度的升高，Kasumi-1細(xì)胞團(tuán)數(shù)量減少，形態(tài)皺縮，邊緣粗糙，胞體縮小，胞體折光度減小，內(nèi)含物減少。見(jiàn)圖2。

2.3 細(xì)胞熒光凋亡檢測(cè) 對(duì)照組中細(xì)胞核排列相對(duì)緊密，核染色質(zhì)分布均勻，發(fā)出紅色熒光，未見(jiàn)綠色凋亡熒光細(xì)胞；6.5 μg／ml TFG 實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞數(shù)量、排列及熒光與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，可見(jiàn)散在綠色凋亡熒光細(xì)胞；與對(duì)照組比較，12.5 μg／ml TFG 實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞數(shù)量減少，較多細(xì)胞出現(xiàn)明亮綠色熒光細(xì)胞，表明部分細(xì)胞的細(xì)胞膜受損；25 μg／ml TFG 實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞數(shù)量下降明顯，細(xì)胞胞體不均一，部分發(fā)生染色質(zhì)凝集和細(xì)胞膜破損，出現(xiàn)較多明亮綠色熒光細(xì)胞。見(jiàn)圖3。

圖2 倒置顯微鏡下觀察Kasumi-1 細(xì)胞經(jīng)TFG 處理24 h 后細(xì)胞形態(tài)的變化（×100）

2.4 TFG 對(duì)Kasumi-1 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) Kasumi-1細(xì)胞經(jīng) TFG 處理 24 h 后，0、6.25、12.5 和 25 μg／ml TFG 組細(xì)胞凋亡率分別為（2.2±0.2）%、（38.7±1.9）%、（50.6±3.7）%和（93.0±8.2）%；與對(duì)照組比較，隨著TFG 質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞凋亡比例逐漸增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

2.5 TFG 對(duì)Kasumi-1 細(xì)胞周期分布的影響 TFG處理 24 h 后，6.25、12.5 μg／ml TFG 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組S 期、G2／M 期細(xì)胞比例比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但 25 μg／ml TFG 實(shí)驗(yàn)組的 S 期細(xì)胞比例高于對(duì)照組，G2／M 期細(xì)胞比例低于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)圖 5。

圖3 熒光顯微鏡下觀察Kasumi-1 細(xì)胞經(jīng)TFG 處理24 h 后細(xì)胞形態(tài)的變化（×100）

圖4 Kasumi-1 細(xì)胞經(jīng)TFG 處理24 h 后細(xì)胞凋亡情況

3 討論

自然來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)素能有效消除癌癥細(xì)胞，探索天然、高效和低毒的藥物進(jìn)行長(zhǎng)期的輔助抗癌具有重要意義。在本課題組前期研究中已經(jīng)證實(shí)TFG 對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞亦有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用［7］，TFG 作用 24 h 及 48 h 的 IC50分別為 190.80 μg／ml 和 125.96 μg／ml。而本研究結(jié)果顯示 TFG作用 Kasumi-1 細(xì)胞 24 h 及 48 h 的 IC50分別為18.80 μg／ml 和 7.9 μg／ml。在線粒體膜電位熒光凋亡檢測(cè)中顯示，隨著TFG 的濃度升高，磷酯酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）從質(zhì)膜的內(nèi)部外翻到細(xì)胞表面即細(xì)胞膜外側(cè)，從而使PS 暴露于細(xì)胞外部，與帶有綠色熒光的FITC 標(biāo)記的Annexin V 染色，結(jié)果顯示綠色熒光細(xì)胞隨藥物作用的濃度增加細(xì)胞凋亡明顯。流式凋亡檢測(cè)結(jié)果與線粒體膜電位檢測(cè)結(jié)果一致。細(xì)胞周期檢測(cè)表明TFG可影響Kasumi-1 細(xì)胞周期分布，使細(xì)胞周期阻滯于 S 期。

圖5 Kasumi-1 細(xì)胞經(jīng)TFG 處理24 h 后細(xì)胞周期的變化

綜上所述，一定質(zhì)量濃度的TFG 可抑制Kasumi-1 細(xì)胞活性并誘導(dǎo)其凋亡，待進(jìn)一步研究作用機(jī)制及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)后，為研究和開(kāi)發(fā) TFG 作為抗AML 的天然藥物提供理論基礎(chǔ)。