趙藝蔓 徐香梅 徐 旭 侯恩存

廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院肝病科 (廣西 南寧，530000)

茵陳蒿湯首見(jiàn)于漢代張仲景所著的《傷寒論》,陽(yáng)明病篇第236條載“陽(yáng)明病,發(fā)熱,汗出,此為熱越,不能發(fā)黃也。但頭汗出,身無(wú)汗,劑頸而還,小便不利,渴飲水漿者,此為瘀熱在里,身必發(fā)黃,茵陳蒿湯主之”[1]。原發(fā)性肝癌是由肝細(xì)胞或肝內(nèi)單管上皮細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤，是目前我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的生命和健康[2]，有研究表明西藥聯(lián)合茵陳篙湯在治療原發(fā)性肝癌黃疸方面臨床效果顯著[3]。但是由于中藥成分的復(fù)雜性和人類(lèi)基因的多樣性，茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌的藥理學(xué)機(jī)制尚未明確。當(dāng)前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已經(jīng)應(yīng)用于中藥藥性理論研究的各個(gè)方面,為從生物分子網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)與功能來(lái)認(rèn)知中藥藥性提供了方法學(xué)契機(jī)和有力工具[4]。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 茵陳蒿湯成分的收集與篩選 茵陳蒿湯由茵陳、大黃、梔子3味中藥組成。利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)收集以上3味中藥的成分，將收集到的中藥化學(xué)成分以口服生物利用度(OB)≥30%和類(lèi)藥性(DL)≥0.18為限定條件進(jìn)行篩選[5]，以增加結(jié)果可信度。

1.2 茵陳蒿湯潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 將尋找到的候選化合物通過(guò)TCMSP平臺(tái)及DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)完成化學(xué)成分靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)，從而得到有效成分作用的相關(guān)蛋白靶點(diǎn)，進(jìn)行潛在治療靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)。

1.3 原發(fā)性肝癌相關(guān)靶點(diǎn)獲取 以原發(fā)性肝癌作為關(guān)鍵詞，檢查GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、CTD數(shù)據(jù)庫(kù)獲取原發(fā)性肝癌相關(guān)靶點(diǎn)蛋白，根據(jù)Relevance score篩選相關(guān)度前200的靶點(diǎn)，獲取與原發(fā)性肝癌相關(guān)的靶點(diǎn)。

1.4 茵陳蒿湯作用于原發(fā)性肝癌的靶點(diǎn) 先使用STRING平臺(tái)對(duì)藥物成分的主要潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行靶點(diǎn)-基因名轉(zhuǎn)換，然后通過(guò)DrawVennDiagram2.1.0平臺(tái)制作韋恩圖，獲得茵陳蒿湯的作用靶點(diǎn)和原發(fā)性肝癌相關(guān)靶點(diǎn)，相互交集的靶點(diǎn)蛋白，即茵陳蒿湯作用于原發(fā)性肝癌的靶點(diǎn)。

1.5 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 利用Cytoscape3.6.0軟件對(duì)茵陳蒿湯的成分-靶點(diǎn)的相互作用繪制網(wǎng)絡(luò)圖。在網(wǎng)絡(luò)中，分別用節(jié)點(diǎn)(node)和邊(edge)表示成分、靶點(diǎn)以及成分與靶點(diǎn)之間的相互作用。網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度和介數(shù)中心度越高，說(shuō)明所對(duì)應(yīng)化合物或靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

1.6 茵陳蒿湯與原發(fā)性肝癌相關(guān)靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了了解中藥方成分及其相應(yīng)目標(biāo)在系統(tǒng)層面上的復(fù)雜相互作用，探討茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌的作用機(jī)制，通過(guò)韋恩圖，獲得茵陳蒿湯與原發(fā)性肝癌相互交集的靶點(diǎn)蛋白，通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)制作茵陳蒿湯與原發(fā)性肝癌相關(guān)靶點(diǎn)蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，并利用Cytoscape3.6.0軟件將網(wǎng)絡(luò)圖可視化，構(gòu)建出茵陳蒿湯與原發(fā)性肝癌相關(guān)耙點(diǎn)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌預(yù)測(cè)靶標(biāo)富集分析 本研究對(duì)以上1.4獲取的相關(guān)交集靶點(diǎn)蛋白，通過(guò)DAVID在線分析工具進(jìn)行基因富集分析(GO分析)，選擇生物過(guò)程(BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞組分(CC)3個(gè)模塊繪制條形圖。通過(guò)DAVID在線分析工具查找富集出來(lái)的生物通路圖，并利用Omicshare云平臺(tái)將得到的KEGG生物途徑結(jié)果進(jìn)行可視化制成氣泡圖。

1.8 活性成分-靶蛋白分子對(duì)接 上述茵陳蒿湯所含化學(xué)成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果，在蛋白綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)得到相應(yīng)的蛋白綜合數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)(PDB-ID)。再把PDB-ID導(dǎo)入Systems Dock WebSite軟件對(duì)活性成分和靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接。輸入拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)后篩選茵陳蒿湯化合物的結(jié)構(gòu)，成功后開(kāi)始對(duì)接，整理對(duì)接結(jié)果中分子對(duì)接評(píng)分并分析。

2 結(jié)果

2.1 茵陳蒿湯化學(xué)成分的搜集 本研究從茵陳蒿湯的各味中藥成分中篩選了44種OB≥30%、DL≥0.18的潛在成分，另外還有少量藥物相似指數(shù)不詳?shù)某煞志哂袕V泛的藥理活性，也被納入其中用于進(jìn)一步靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。茵陳、梔子、大黃分別篩選到14、15、15種成分，并且篩選出這些藥物之間非重復(fù)的41種成分。見(jiàn)表1。

表1 茵陳蒿湯化合物具體信息

2.2 茵陳蒿湯化學(xué)成分相應(yīng)靶點(diǎn)蛋白預(yù)測(cè) 通過(guò)TCMSP平臺(tái)、DrugBank剔除重復(fù)及非人源靶點(diǎn)后共得出茵陳蒿湯潛在影響的靶點(diǎn)蛋白共計(jì)186個(gè)，將選取的41個(gè)成分以及所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白為節(jié)點(diǎn)，建立相互關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape3.6.0軟件制作出茵陳蒿湯“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。在網(wǎng)絡(luò)圖中有268個(gè)節(jié)點(diǎn)和534條相互關(guān)系(彩插頁(yè)圖1)。

2.3 茵陳蒿湯與原發(fā)性肝癌相關(guān)靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖 通過(guò)制作韋恩圖獲得186個(gè)茵陳蒿湯化學(xué)成分相關(guān)靶點(diǎn)和200個(gè)原發(fā)性肝癌相關(guān)靶點(diǎn)蛋白相互交集的44個(gè)靶點(diǎn)蛋白，以此為節(jié)點(diǎn)建立茵陳蒿湯成分靶點(diǎn)與原發(fā)性肝癌相關(guān)靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(彩插頁(yè)圖2)，網(wǎng)絡(luò)圖中有44個(gè)節(jié)點(diǎn)和455條相互關(guān)系，相互作用的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)有腫瘤蛋白(TP53)、負(fù)性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子(JUN)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、轉(zhuǎn)錄激活因子(MYC)、雌激素受體(ESR1)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK1)等，其中度值最高的是TP53。

2.4 茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌靶點(diǎn)的GO富集分析 為了進(jìn)一步探討茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌的186個(gè)候選靶點(diǎn)的可能機(jī)制，使用DAVID對(duì)茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌的候選靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG生物途徑分析，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后分別將BP、MF和CC中排名靠前的條目繪制成條形圖(彩插頁(yè)圖3)。

2.5 茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌靶點(diǎn)的KEGG生物途徑分析 通過(guò)KEGG分析茵陳蒿湯顯著發(fā)揮影響的20個(gè)生物途徑(彩插頁(yè)圖4)，結(jié)果顯示，茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌的機(jī)制主要涉及PI3K-Akt、MAPK信號(hào)通路、Hepatitis B信號(hào)通路、HTLV-I信號(hào)通路、Tuberculosis信號(hào)通路等。

2.6 茵陳蒿湯化合物和疾病靶點(diǎn)對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果 將茵陳蒿湯化合物和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行簡(jiǎn)單的對(duì)接驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Mol358(β-谷甾醇)、MOL98(槲皮黃酮)、MOL354(異鼠李素)、MOL422(山柰酚)、MOL471(蘆薈大黃素)為結(jié)合力最強(qiáng)的分子。分子對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表2。茵陳蒿湯多個(gè)靶點(diǎn)分子對(duì)接評(píng)分>8.0，有強(qiáng)烈的結(jié)合活性(彩插頁(yè)圖5)。

表2 茵陳蒿湯化合物和疾病靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

茵陳蒿湯由茵陳、梔子、大黃等藥材組成，方中茵陳清熱利濕;梔子通利三焦,導(dǎo)熱下行,引濕熱自小便出;大黃瀉熱逐瘀退黃,通利大便。共奏利尿通便、祛濕退熱之功效。有研究表明茵陳的槲皮素、β-谷甾醇、異鼠李素等有效成分使茵陳具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛抗炎、調(diào)節(jié)免疫的功效，并具有保肝利膽、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)等藥用價(jià)值[6]。大黃的蒽醌類(lèi)主要的有效成分大黃酸和大黃素在許多研究中已發(fā)現(xiàn)此二者重多條信號(hào)通路，如MAPK信號(hào)通路和(磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B)PI3 K/Akt信號(hào)通路，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移均具有一定的藥物作用[6]。梔子具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、保肝、利膽、降血脂、抗血栓、神經(jīng)保護(hù)等作用[7]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段,對(duì)茵陳蒿湯進(jìn)行成分、靶點(diǎn)與疾病的生物信息學(xué)綜合網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，探究了該方治療原發(fā)性肝癌的整體機(jī)制，呈現(xiàn)出中醫(yī)中藥治療的多成分、多靶點(diǎn)、整合調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，并進(jìn)一步通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析揭示出核心作用通路。

在化合物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中部分關(guān)鍵化合物分子具有高度的中心性的兒茶素，體外實(shí)驗(yàn)中兒茶素本身也可以引起多種腫瘤細(xì)胞株凋亡，具有保肝利膽、抗腫瘤等作用[3]。兒茶素由3個(gè)烴環(huán)組成，從結(jié)構(gòu)上可分為非酯型兒茶素和酯型兒茶素兩大類(lèi)。有研究表明其中2種酯型兒茶素——表沒(méi)食子兒茶素、沒(méi)食子酸酯可能是抗肝癌效果較好的兒茶素單體[8]，并有研究證實(shí)了沒(méi)食子酸酯對(duì)肝癌細(xì)胞具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡及周期阻滯的作用效果[9]。

本文利用Cytoscape3.6.0軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)相互作用的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)有TP53、JUN、EGFR、MYC、ESR1、MAPK1等，其中度值最高的是TP53。一般認(rèn)為T(mén)P53基因是人類(lèi)腫瘤中最常發(fā)生變化的基因,它位于染色體17 p13.1，編碼53 kDa的核磷酸蛋白,此蛋白通過(guò)p21蛋白參與細(xì)胞周期的調(diào)控,阻止細(xì)胞G1期進(jìn)入S期,對(duì)細(xì)胞分裂和增殖起負(fù)調(diào)節(jié)作用。若TP53基因突變,則最終使細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的調(diào)節(jié)失控,導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)分裂和癌變[10]。TP53突變與人體原發(fā)性肝癌密切相關(guān)。一些實(shí)驗(yàn)證明[11],在不同的生理?xiàng)l件下,TP53在啟動(dòng)細(xì)胞凋亡時(shí)起作用。特殊信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的生理信號(hào)或活動(dòng)能阻止TP53介導(dǎo)的凋亡。當(dāng)TP53過(guò)度表達(dá)或被激活時(shí),細(xì)胞將走向凋亡。據(jù)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,TP53 INP2既可發(fā)揮抑制腫瘤也可發(fā)揮促進(jìn)腫瘤的功能。TP53 INP2在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程的差異性表達(dá)及其不同的亞細(xì)胞定位,可能與其在對(duì)應(yīng)腫瘤細(xì)胞系中發(fā)揮不同的功能有關(guān)[12]。

在KEGG生物途徑富集分析中，PI3 K-Akt、MAPK信號(hào)通路、HTLV-I信號(hào)通路、Hepatitis B信號(hào)通路、Tuberculosis信號(hào)通路等被顯著性富集。PI3 K-AKT信號(hào)通路在肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、遷移和存活中扮演重要角色，與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13，14]。PI3 K是一種脂類(lèi)激酶，活化的PI3 K可將磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)。PI3 K信號(hào)通路的持續(xù)激活與細(xì)胞的增殖、凋亡等過(guò)程密切相關(guān),會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化[15，16]。PIP3可使其主要下游底物AKT準(zhǔn)確定位到近膜區(qū)并發(fā)生構(gòu)象變化，同時(shí)活化的AKT轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，作用于下游底物，調(diào)控細(xì)胞代謝、蛋白合成、細(xì)胞增殖與凋亡等重要生理過(guò)程，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及分化調(diào)節(jié)。PI3 K-AKT信號(hào)通路是一條廣泛存在于細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞增殖調(diào)控中起重要作用，其表達(dá)異常存在于多種癌細(xì)胞中，尤其與肝癌發(fā)病關(guān)系密切[17]。MAPKs是一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,它們?cè)诩?xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[18]。P38 MAPK也稱為RK或CSBP,它是酵母HOG激酶的哺乳動(dòng)物同源基因,作為MAPKs家族中重要的組成部分,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān),它主要通過(guò)調(diào)控下游多種酶及轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)活性發(fā)揮生物細(xì)胞學(xué)效應(yīng)[19]。在茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌黃疸方面這兩條信號(hào)通路，相互影響，相互促進(jìn)。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究茵陳蒿湯治療原發(fā)性肝癌，其作用機(jī)制可能與PI3 K-Akt、MAPK信號(hào)通路等信號(hào)通路有關(guān)。盡管有一些新的發(fā)現(xiàn)，但這項(xiàng)研究還有一些局限性，比如由于數(shù)據(jù)庫(kù)中信息不完全，茵陳蒿湯中的一些化合物可能會(huì)被忽略，一些活性成分在篩選過(guò)程中可能會(huì)被遺漏；僅選取前200個(gè)原發(fā)性肝癌靶點(diǎn)不夠全面，可能遺漏其他與藥物聯(lián)系緊密的重要靶點(diǎn)；片面考慮了直接作用而非間接作用等，在今后的研究中，需要進(jìn)一步研究，并加以實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。