錢智 陶紅慧 尤曉燕 濮梁 趙慧

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院黃埔分院,上海 200011)

逐痰通絡(luò)合劑是由上海市食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的上海市黃埔中心醫(yī)院的醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑。該制劑由牛蒡子、僵蠶、天南星、澤瀉、丹參、甘草、川牛膝、地龍、威靈仙等十一味藥材組成，具有逐痰利水，活血通絡(luò)的功效[1]。其中牛蒡子具有豁痰消腫，通十二經(jīng)絡(luò)之功效，《本草綱目》中謂之能散結(jié)除風(fēng)，和要腰膝凝滯之氣，為君藥；丹參、當(dāng)歸有養(yǎng)血活血化淤的功效，為臣藥；甘草能調(diào)和諸藥是屬佐使之用。該制劑為醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未見含量測定項。根據(jù)復(fù)方中成藥的特點，為了更有效的控制藥物的質(zhì)量[2]，本文采用雙波長HPLC法建立了逐痰通絡(luò)合劑中牛蒡苷、丹酚酸B和甘草酸這3種有效成分的含量測定方法[3-6]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀，DAD檢測器(美國安捷倫公司)；Sartorius?A200S電子分析天平(德國賽多利斯公司)；80-2醫(yī)用離心機(jī)(江蘇信康醫(yī)療器械有限公司)。

1.2試藥 丹酚酸B對照品(批號：111562-201716，純度94.1%，中國食品藥品檢定研究院)；牛蒡苷對照品(批號：5740，純度97.5%，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司)；甘草酸銨對照品(批號：5733，純度94.2%，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司)。逐痰通絡(luò)合劑(批號：170620、170807、170906、170920、171024、171128、180109、180206、180418、180530)。相應(yīng)的陰性空白樣品處方1(不含丹參)、處方2(不含甘草)和處方3(不含牛蒡子)(由黃浦區(qū)中心醫(yī)院按處方配制)。乙腈(斯百泉化學(xué)有限公司)，水為娃哈哈純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱 ：Waters Atlantis dC18，μm,4.6 mm×150 mm；流動相：A 水(0.1%乙酸)-B 乙腈(0.1%乙酸)； 梯度洗脫(0～20 min，20%B～25%B；20～40 min，25%B～45%B；40～40.1 min，45%B～95%B；40.1～45.0 min，95%B；45.0～45.1 min，95%B～20%B；45.1～50 min，20%B)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為 252 nm(測定甘草酸)和280 nm(測定丹酚酸B和牛蒡苷)；柱溫室溫；進(jìn)樣5 μL。

2.2對照品溶液的制備 稱取丹酚酸B對照品5.0 mg、牛蒡苷對照品8.0 mg及甘草酸銨對照品4.0 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，搖勻，即得每1 mL含丹酚酸B 0.50 mg，牛蒡苷0.80 mg，甘草酸銨(甘草酸質(zhì)量=甘草酸銨質(zhì)量/1.0207)。

2.3供試品溶液的制備 取供試品適量，離心(4000 r/min)約10 min，取上清液用0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.4陰性樣品的制備 取處方1、2、3，按照2.3項下處理，分別得到缺丹參、缺牛蒡子和缺甘草的陰性樣品。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1專屬性考察 將空白、相應(yīng)對照品、陰性樣品及供試品溶液注入高效液相色譜儀，結(jié)果在與對照品色譜峰對應(yīng)的位置上無相應(yīng)的峰出現(xiàn)，丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨相應(yīng)的分離度均>2.0，表明該方法專屬性良好。見圖1。

注：A.空白；B-丹酚酸B對照品；C.牛蒡苷對照品；D.甘草酸銨對照品；E.處方1(缺丹參)；F.處方3(缺牛蒡子)；G.處方2-(缺甘草)；H.樣品180418；I.混合對照品圖1 高效液相色譜圖

2.5.2線性考察 精密稱取丹酚酸B對照品5.0 mg、牛蒡苷對照品8.0 mg及甘草酸銨對照品4.0 mg于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，搖勻，將其作為母液。用甲醇稀釋母液，得到系列混和對照品溶液，分別進(jìn)樣，測定峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，回歸方程見表1。

表1 各成分回歸方程與線性范圍

2.5.3檢出限與定量限考察 檢出限：取丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨對照品適量，加甲醇稀釋成濃度分別為1.01 μg/mL、1.0 μg/mL和0.50μg/mL的對照品溶液，分別注入高效液相色譜儀，得到的圖譜中顯示信噪比S/N約為3，即該方法中丹酚酸B檢出限為1.01 μg/mL，牛蒡苷檢出限為1.0 μg/mL，甘草酸銨檢出限為0.50 μg/mL。定量限：以檢測限濃度/3×10來計算，即該方法中丹酚酸B定量限為3.37 μg/mL，牛蒡苷檢出限為3.33 μg/mL，甘草酸銨檢出限為1.67 μg/mL。

2.5.4精密度考察 重復(fù)性考察：取選定樣品180418按本測試方法中樣品配制方法重復(fù)配制六個樣品溶液進(jìn)行測試，將6次檢測結(jié)果計算相對偏差%RSD以驗證方法精密度。結(jié)果丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.9%、0.8%和1.1%。中間精密度考察：在不同時間，使用同一品牌的其他色譜柱進(jìn)行樣品180418含量測定，結(jié)果丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨含量的百分誤差分別為3.6%、2.5%和0.3%。

2.5.5穩(wěn)定性考察 精密吸取同一對照品溶液分別在0、3、6、9、13、14小時內(nèi)進(jìn)樣，結(jié)果丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別為1.2%、0.5%和1.1%。

2.5.6準(zhǔn)確度考察 取陰性樣品按2.4法進(jìn)行處理，分別1:1加入相對應(yīng)的丹酚酸B對照品(1.01 mg/mL)、牛蒡苷對照品(1.0 mg/mL)和甘草酸銨對照品(1.0 mg/mL)，用0.45 μm濾膜濾過，進(jìn)樣測定回收率。結(jié)果顯示丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨峰的回收率分別為94.1%、98.2%和102.1%，RSD分別為2.4%、4.3%和2.0%。

2.5.7耐用性考察 將樣品180418分別在0，48 h進(jìn)行含量測定，結(jié)果丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨峰面積的百分誤差分別為0.7%、0.4%和0.5%。將樣品180418分別在柱溫30℃和20℃(室溫)進(jìn)行含量測定，結(jié)果丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨峰面積的百分誤差分別為1.0%、0.1%和2.3%。將樣品180418分別在流速0.9 mL/min和1.0 mL/min進(jìn)行含量測定，結(jié)果丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨峰面積的百分誤差分別為0.6%、0.4%和1.0%。將樣品180418分別用同一品牌的不同色譜柱進(jìn)行含量測定，結(jié)果丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨峰面積的百分誤差分別為0.3%、1.5%和0.0%。

2.6十批樣品含量測定 取逐痰通絡(luò)合劑(批號：170620、170807、170906、170920、171024、171128、180109、180206、180418、180530)，分別進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表2。

表2 10批逐痰通絡(luò)合劑含量測定結(jié)果(mg/mL)

3 討 論

實驗考察了采用水、甲醇、乙腈、無水乙醇進(jìn)行稀釋過濾處理，以及不同離心轉(zhuǎn)速、不同離心時間等方法。結(jié)果表明，在指定的色譜分析條件下，供試品溶液的制備方法是比較好且方便快捷的。采用DAD檢測器對丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨進(jìn)行了全波長掃描，根據(jù)其其最大吸收波長及吸收曲線，選擇252 nm檢測波長測定甘草酸銨含量，選擇280 nm檢測波長同時測定丹酚酸B和牛蒡苷含量。實驗比較了乙腈-水、乙腈-水(0.1%甲酸)、乙腈-水(0.1%乙酸)、乙腈(0.2%乙酸)-水(0.2%乙酸)和乙腈(0.1%乙酸)-水(0.1%乙酸)流動相體系下的梯度分離情況以及不同品牌的反相C18色譜柱的分離情況，結(jié)果顯示，指定的色譜分析條件分離效果較好。

本文所建立的雙波長HPLC法同時測定逐痰通絡(luò)合劑中的丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨的方法，該方法具有操作簡便快捷，準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，能夠作為逐痰通絡(luò)合劑以及類方的質(zhì)量評價與控制。