李 艷，許舒欣，劉海培，張遠(yuǎn)清，胡 瑋，李小強，程文播*

(1.天津國科醫(yī)工科技發(fā)展有限公司，天津 300399； 2.中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇蘇州 215163；3.天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院，天津 300072)

嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤(Pheochromocytoma and Paraganglioma，PPGL)是一種源于腎上腺髓質(zhì)或腎上腺外交感神經(jīng)鏈的腫瘤，主要合成并分泌兒茶酚胺，進(jìn)而引起高血壓等癥狀，并造成心、腦、腎等嚴(yán)重并發(fā)癥[1]?；颊咭话阍缙跊]有明顯癥狀，直到腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移到身體的其他部位才被診斷出來，所以早期診斷對于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的治療和預(yù)后具有十分重要的意義。

兒茶酚胺類物質(zhì)作為神經(jīng)遞質(zhì)和激素，可調(diào)節(jié)人體的基本生理功能，傳遞生理信號，其代謝物甲氧基腎上腺素(Metanephrine，MN)和甲氧基去甲腎上腺素(Nometanephrine，NMN)是腎上腺素和去甲腎上腺素的中間代謝產(chǎn)物，它們僅在腎上腺髓質(zhì)和PPGL內(nèi)代謝生成并且以高濃度水平持續(xù)存在，是PPGL的特異性標(biāo)記物，可以提高PPGL的檢出率，降低假陰性結(jié)果[2 - 6]。因此，測定血漿或尿液中的MN和NMN成為了診斷PPGL的首選生化檢測。尿液樣本檢測需要收集24 h的樣本，而血漿中的MN和NMN檢測更加適用于臨床。MN和NMN的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 MN(a)和NMN(b)的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of MN (a) and NMN (b)

檢測血漿中MN和NMN的方法中，最常用的是高效液相色譜法及高效液相色譜和電化學(xué)聯(lián)用檢測法，但存在靈敏度低，樣本需求量大，前處理時間長，組分干擾強等弊端，無法滿足臨床檢測需求[7 - 10]?；诿庖叩臋z測方法由于交叉反應(yīng)和非特異性的結(jié)合會導(dǎo)致檢測準(zhǔn)確度低，且不同的免疫測試，其結(jié)果不能相互比較，故不具備普適性[11]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS)技術(shù)成為了定量檢測生物樣本中微量目標(biāo)分析物的強有力手段[12 - 14]。本文基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對血漿中的甲氧基腎上腺素和甲氧基去甲腎上腺素進(jìn)行定量測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AXR液相色譜儀(日本，島津公司)；API4000三重四極桿質(zhì)譜儀(美國，AB Sciex公司)；5427R離心機(德國，Eppendorf有限公司)；VORTEX-5旋渦混合器(其林貝爾儀器公司)；Multi SPE-M96固相萃取裝置(天津博納艾杰爾科技有限公司)；固相萃取微孔板(PWCX 96微孔板)規(guī)格為5 mg/1mL/well(天津博納艾杰爾科技有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：甲氧基腎上腺素、甲氧基去甲腎上腺素(加拿大，Toronto Research Chemicals公司)；內(nèi)標(biāo)：甲氧基腎上腺素-d3鹽酸鹽、甲氧基去甲腎上腺素-d3鹽酸鹽(美國，Cambridge Isotope Laboratories公司)。甲醇、乙腈、甲酸銨、NH4Ac(美國，F(xiàn)isher Chemical公司)。高純水是符合國家際準(zhǔn)(GB/T 6682-2008)的一級水。

配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的生物基質(zhì)為空白人血清(美國，Golden West Diagnostics公司)，待測血漿樣本采集自健康志愿者。

1.2 溶液的配制

稱取標(biāo)準(zhǔn)品甲氧基腎上腺素(MN)、甲氧基去甲腎上腺素(NMN)各5 mg，用含甲酸的乙腈溶液進(jìn)行稀釋，得到20、50、200、500、800、2 000、4 000、5 000、10 000 pg/mL系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液。甲氧基腎上腺素-d3鹽酸鹽(MN-d3)、甲氧基去甲腎上腺素-d3鹽酸鹽(NMN-d3)通過稀釋得到的濃度分別為400 ng/mL和800 ng/mL。

1.3 樣品處理

取500 μL待測樣品，加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，再加入500 μL的NH4Ac溶液，混勻后，采用固相萃取分離富集，主要步驟如下：(1)活化：先用200 μL甲醇活化，再用200 μL NH4Ac溶液活化。(2)上樣：把預(yù)處理的樣品分兩次上樣，每次500 μL，施加正壓全部壓下。(3)淋洗1：向每孔加入500 μL乙腈，正壓壓下。(4)淋洗2：向每孔加入500 μL水溶液，正壓壓下。(5)洗脫：向每孔中加入100 μL 2%甲酸乙腈溶液，正壓壓下收集。收集液供LC-MS/MS測定。

1.4 LC-MS/MS條件

色譜柱：艾杰爾的Venusil XBP Silica柱(100 mm×2.1 mm，3 μm)；流動相：甲酸-甲酸銨溶液(A相)和甲酸-水-甲酸銨乙腈溶液(B相)。梯度洗脫程序：0～0.01 min，100%B；0.01～1.5 min，60%B；1.5～2.4 min，60%B；2.4～2.5 min，100%B；2.5～4 min，100%B。流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40 ℃。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；氣簾氣(CUR)68.9 kPa，噴霧器(GS1)482.3 kPa，輔助加熱氣(GS2)344.5 kPa，溫度(TEM)550 ℃，離子化電壓(IS)5 500 V，碰撞氣(CAD)27.5 kPa。每種化合物的母離子、子離子、駐留時間、錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜采集參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 基質(zhì)效應(yīng)評價

通過柱后灌注法對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價[15]。測試的樣本包括用于配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白血清樣本以及生物樣本。目標(biāo)分析物MN、NMN為內(nèi)源性小分子，在考察生物樣本的基質(zhì)效應(yīng)情況時以同位素內(nèi)標(biāo)(IS)的出峰行為推測目標(biāo)分析物的基質(zhì)影響情況。由圖2(a)可知，MN、MN-d3保留時間為2.10 min，NMN、NMN-d3保留時間為2.09 min；圖2(b)為空白人血清樣本，通過柱后灌注，可以看出在分析物的出峰位置2.09～2.10 min處，沒有出現(xiàn)如0.5～0.6 min明顯的信號下降趨勢，也沒有出現(xiàn)明顯的信號上升趨勢。由此可判斷在分析物的出峰位置，沒有發(fā)生明顯的離子抑制或增強現(xiàn)象，故表明不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)；圖2(c)為人血漿樣本，由于分析物為內(nèi)源性物質(zhì)，故只需要考察同位素內(nèi)標(biāo)在出峰位置處的響應(yīng)程度，由圖可知在分析物的出峰位置2.09～2.10 min處，沒有出現(xiàn)如0.5～0.6 min、0.7～0.8 min明顯的信號下降和上升趨勢。由此可判斷在分析物的出峰位置，沒有發(fā)生明顯的離子抑制或增強現(xiàn)象，故表明不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品(a)空白人血清柱后灌注標(biāo)準(zhǔn)品(b)和血漿柱后灌注內(nèi)標(biāo)(c)的色譜圖Fig.2 Chromatograms of standard substance(a),post-column infusion of MN/NMN-free human serum(b) and post-column infusion of IS in plasma sample(c)

2.2 線性范圍及定量限

根據(jù)MN和NMN的臨床檢測需求確定檢測范圍[1]，以及優(yōu)化條件下濃度x為橫坐標(biāo)，峰面積比值y為縱坐標(biāo)擬合工作曲線，結(jié)果呈良好的線性關(guān)系，如圖3。MN的線性范圍為50～10 000 pg/mL，線性方程式為：y=0.00151x+0.00766(R=0.9998)；NMN的線性范圍為50～10 000 pg/mL，線性方程式為：y=0.00432x-0.00633(R=0.9991)。此外，該檢測方法與其他方法相比，具有更寬的線性范圍，檢出時間更短(表2)，可以更好地滿足臨床的應(yīng)用需求。

圖3 MN(a)和NMN(b)的線性關(guān)系圖Fig.3 The linear equations of MN(a) and NMN (b)

表2 MN和NMN含量測定的不同方法比較

根據(jù)MN和NMN的臨床檢測需求[16]以及儀器的靈敏度，將方法的定量限(LOQ，S/N≥10)定為MN 20 pg/mL，NMN 20 pg/mL,每個濃度檢測10次，考察檢測值和理論值的偏差以及測試結(jié)果的變異系數(shù)(CV)(表3)。由結(jié)果可知準(zhǔn)確度偏差均在15%以內(nèi)，測試的平行樣本CV值在15%以內(nèi)，表明該方法的定量限MN為20 pg/mL、NMN為20 pg/mL符合臨床檢測方法學(xué)要求。

2.3 精密度和準(zhǔn)確度

選取低、中、高三個濃度評價方法的精密度，每個批次每個濃度樣本分5次進(jìn)行處理，連續(xù)測定3個批次，總樣本數(shù)為45份，分別評估每個濃度樣本的批內(nèi)精密度和批間精密度以及總精密度。結(jié)果表明批內(nèi)精密度、批間精密度以及總精密度偏差均在15%以內(nèi)，表明該方法符合臨床檢測方法學(xué)要求。

采用真實混合人血漿的加標(biāo)回收率來評價方法的準(zhǔn)確度。每個濃度做三個平行樣，考察加標(biāo)回收率和檢測結(jié)果的變異系數(shù)CV，見表3。由結(jié)果可知，加標(biāo)回收率均在±15%以內(nèi)，回收率的變異系數(shù)CV值在15%以內(nèi)。表明該方法的準(zhǔn)確度符合臨床檢測方法學(xué)要求。

表3 血漿中MN和NMN的加標(biāo)回收率

3 結(jié)論

建立了可以定量測定人血漿中甲氧基腎上腺素和甲氧基去甲腎上腺素的分析檢測方法。結(jié)果表明該方法靈敏度高、特異性強、準(zhǔn)確度高、檢測時間短，可以滿足臨床的檢測需求。