楚善明，蘇立強(qiáng)，于亭亭，靳巖爽，韓 爽，王 穎

(1.齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.佳木斯市第一中學(xué)，黑龍江佳木斯 154003)

黃酮類化合物是多種常用中藥材和天然產(chǎn)物(銀杏、槐米、金銀花、三七)的有效成分，主要包括槲皮素、橙皮素、木犀草素、蘆丁、山奈酚等。因該類化合物具有抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等功能，在醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。黃酮類化合物的天然提取物[1 - 3]已用于臨床。

通過分子印跡技術(shù)[4 - 6]制備的分子印跡聚合物(MIPs)對(duì)靶向目標(biāo)具有良好的選擇性，已應(yīng)用于天然活性成分分離、食品工業(yè)、色譜分離、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域?，F(xiàn)有MIPs的制備主要為沉淀聚合、本體聚合、原位聚合、懸浮聚合、表面聚合等方法?；亓鞒恋砭酆戏╗7 - 9]是在傳統(tǒng)沉淀聚合法的基礎(chǔ)上發(fā)展的一種新型聚合技術(shù)，與傳統(tǒng)的沉淀聚合法相比，該方法反應(yīng)時(shí)間短、效率更高。以黃酮類化合物分子作為模板制備印跡聚合物，并將其用于天然產(chǎn)物中黃酮類物質(zhì)的分離提取已見諸報(bào)道。孫爽等[10]以凹凸棒為載體，蘆丁為模板制備其印跡聚合物，利用其從冬青葉中提取蘆丁。丁佳等[11]以羧基化多壁碳納米管為基質(zhì)材料，芹菜素為模板制備分子印跡聚合物，使芹菜提取物中芹菜素的濃度得到有效提升。

印跡聚合物的選擇吸附性能，使其能從復(fù)雜基質(zhì)中高效提取某一成分，但同時(shí)因聚合物的單一吸附性，在對(duì)某一成分提取的同時(shí)，對(duì)天然產(chǎn)物中其它的物質(zhì)造成了浪費(fèi)。近年來，復(fù)合模板[12 - 14]逐漸出現(xiàn)在人們的視野當(dāng)中，因其不僅擴(kuò)大了MIPs結(jié)合位點(diǎn)的識(shí)別范圍，同時(shí)又能夠?qū)ν惢衔锉憩F(xiàn)出良好的親和力，解決了MIPs在同類物質(zhì)吸附中的受限問題。本文以槲皮素與橙皮素為復(fù)合模板分子，采用回流沉淀法制備復(fù)合模板MIPs，對(duì)多種黃酮類化合物均表現(xiàn)出較大的吸附容量，為同時(shí)分離提取天然產(chǎn)物中黃酮類化合物提供了新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LPG3400高效液相色譜儀(美國，戴安公司)；GT10-2高速冷凍離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)；TU-1901紫外/可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)。

槲皮素、橙皮素、山柰酚、槲皮苷、芹菜素、蘆丁、木犀草素、姜黃素、阿魏酸(分析純，西安小草植物科技有限責(zé)任公司)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)(分析純，日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社)；二乙烯基吡啶(2-VP)、甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酰胺(AM)(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)；偶氮二異丁腈(AIBN)(分析純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)；乙腈、甲醇、甲酸(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑中心)。

1.2 分子印跡聚合物的制備

在100 mL圓底燒瓶中，加入模板分子槲皮素0.0755 g(0.25 mmol)，橙皮素0.0756 g(0.25 mmol)，功能單體2-VP 0.2103 g(2 mmol)，超聲溶解于80 mL甲醇中，超聲預(yù)聚合3 h。加入3.94 g(20 mmol)交聯(lián)劑EGDMA和0.0200 g 引發(fā)劑AIBN，超聲10 min，沖N2氣脫氧30 min，加入攪拌子，升溫至70 ℃，于200 r/min恒溫回流熱聚合3 h。配制乙酸體積比為10%的乙酸-甲醇溶液，將合成的聚合物索氏提取24 h，以除去聚合物上的模板分子與未反應(yīng)的功能單體及交聯(lián)劑。50 ℃真空干燥24 h，即得MIPs。利用上述方法制備非印跡聚合物NIPs，但不加入模板分子。

1.3 MIPs吸附性能研究

1.3.1 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)配制溶液濃度(c0)范圍在0.00～100.00 μg/mL的槲皮素與橙皮素溶液，分別向各濃度溶液中加入10 mg MIPs，靜止12 h。0.45 μm膜過濾，取1 mL的溶液，無水甲醇稀釋至3 mL，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)出各溶液的濃度ce，根據(jù)吸附前后的模板分子濃度變化，計(jì)算出洗脫后MIPs的吸附量，依公式計(jì)算MIPs的吸附容量(Q)：Q=(c0-ce)×V/m，計(jì)算得出MIPs對(duì)不同濃度槲皮素與橙皮素的吸附容量。NIPs的吸附容量計(jì)算步驟同上。

1.3.2 動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)取兩只100 mL錐形瓶，各放入0.0300 g的MIPs，分別加入配制好的35 mL 100 μg/mL 的槲皮素、橙皮素溶液，再加入15 mL無水甲醇，低頻超聲10 min。每間隔20 min吸取1 mL上層清液，離心5 min(800 r/min)，用0.45 μm濾膜過濾，再利用紫外分光光度計(jì)測(cè)得對(duì)應(yīng)的濃度ce，計(jì)算MIPs的Q。NIPs的Q計(jì)算步驟同上。

1.4 樣品處理與固相萃取

取銀杏葉粉5 g，溶解于300 mL甲醇中，高頻超聲1 h后，回流提取3次，將3次回流提取的甲醇溶液混合后進(jìn)行過濾，蒸發(fā)濃縮濾液，將濃縮后的濾液以8 000 r/min離心10 min，然后取上清液用甲醇定容至250 mL。取100 mg MIPs制備分子印跡固相萃取(MISPE)柱，依次用3 mL水和5 mL甲醇對(duì)MISPE柱進(jìn)行活化后，將處理后的溶液上樣，用5 mL乙腈進(jìn)行淋洗，再用10 mL體積比為9∶1的甲醇-乙酸溶液對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，將洗脫液濃縮至1 mL，用高效液相色譜法檢測(cè)。色譜條件：Hypersil ODS2色譜柱；流動(dòng)相為甲醇，流速為0.5 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 模板分子的選擇

MIPs對(duì)目標(biāo)分析物的靶向識(shí)別能力主要取決于微球內(nèi)部印跡孔穴的結(jié)構(gòu)及結(jié)合位點(diǎn)，而模板分子決定了印跡孔穴的空間結(jié)構(gòu)，因此選擇合適的兩個(gè)分子作為復(fù)合模板分子，可優(yōu)化空間結(jié)構(gòu)與作用位點(diǎn)。黃酮類模板與功能單體的結(jié)合過程中，主要依靠的是其分子中存在的活性基團(tuán)羥基與醚鍵的作用等，槲皮素與橙皮素為中草藥中常見的兩種黃酮類組分，同時(shí)分子中含有多個(gè)酚羥基、醚鍵等，適合印跡。所以，本實(shí)驗(yàn)選用槲皮素與橙皮素作為MIPs的復(fù)合模板分子。槲皮素和橙皮素的結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 槲皮素與橙皮素結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of quercetin and hesperetin

2.2 MIPs制備時(shí)間選擇

在回流沉淀聚合反應(yīng)中，反應(yīng)速度快，反應(yīng)時(shí)間對(duì)結(jié)果影響大，為考察制備時(shí)間對(duì)MIPs形貌的影響，對(duì)MIPs制備中不同時(shí)刻的微球形貌及粒徑范圍進(jìn)行掃描電鏡分析，見圖2。由圖2可見，制備時(shí)間對(duì)印跡微球粒徑和形貌的影響非常明顯。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行至1 h時(shí)，所生成的MIPs微球表面粗糙，粒徑較小，且粒度范圍較大；當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行至2 h時(shí)，印跡微球表面開始變光滑，粒徑范圍仍較大；當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行至3 h時(shí)，微球表面更加光滑，粒徑變均勻，顆粒明顯增大，粒徑約為1 μm；反應(yīng)進(jìn)行至4 h時(shí)，無明顯變化，所以選擇反應(yīng)時(shí)間3 h。而傳統(tǒng)沉淀聚合過程一般需要24 h左右，回流沉淀聚合法在保證了微球形貌和粒徑的同時(shí)，大大縮短了聚合時(shí)間，提升了效率。

圖2 不同制備時(shí)間的MIPs微球掃描電鏡(SEM)圖Fig.2 SEM images of MIPs microspheres obtained by different preparation time

2.3 紅外光譜研究

為考察分子印跡聚合物是否制備成功，對(duì)未洗脫模板分子的印跡聚合物、MIPs和NIPs采用紅外光譜法分析，見圖3?？梢钥闯觯谖聪疵撃０宸肿拥募t外譜圖中，3 280 cm-1處為-OH伸縮振動(dòng)峰，在1 612、1 513 cm-1處出現(xiàn)模板分子上的苯環(huán)骨架的特征吸收峰，在1 726 cm-1處出現(xiàn)了EGDMA的C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，表明聚合物成功制備。而在MIPs紅外譜圖中，3 430 cm-1的-OH吸收峰與未洗脫模板分子的聚合物相比，發(fā)生了明顯位移，可能是由于模板分子與功能單體之間存在的氫鍵作用力所導(dǎo)致的。在MIPs和NIPs的紅外譜圖中，在1 730、1 453、1 157 cm-1處均出現(xiàn)吸收峰，是由單體2-VP和交聯(lián)劑EGDMA引起的，且峰形基本一致，說明模板分子已洗脫完全。

2.4 靜態(tài)吸附容量

采用靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)對(duì)聚合物的吸附性能進(jìn)行考察，繪制MIPs與NIPs對(duì)雙模板分子槲皮素與橙皮素的靜態(tài)等溫吸附曲線，見圖4。由圖4可知，MIPs對(duì)兩種模板分子槲皮素與橙皮素的吸附容量均明顯高于NIPs，原因是MIPs微球含有與槲皮素和橙皮素結(jié)構(gòu)相匹配的印跡孔穴，且孔穴內(nèi)規(guī)則排列著與其結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)；MIPs對(duì)槲皮素吸附容量達(dá)到了49.82 mg/g，對(duì)橙皮素也達(dá)到44.34 mg/g。這是由于雙模板與功能單體間的多位點(diǎn)協(xié)同作用，使微球內(nèi)部孔穴的結(jié)構(gòu)得到優(yōu)化，提高了印跡微球的分子識(shí)別能力。而NIPs微球內(nèi)部不存在與其結(jié)構(gòu)相匹配的印跡孔穴，主要依靠物理吸附，對(duì)兩種模板的吸附容量均較小，且無明顯差別。

圖3聚合物的紅外(IR)光譜圖Fig.3 IR spectra of polymer

圖4 靜態(tài)吸附等溫線Fig.4 Static adsorption isotherm

由圖5可知:Scatchard曲線分為兩段直線,說明聚合物主要形成兩種不同的結(jié)合位點(diǎn)，即高親和位點(diǎn)和低親和位點(diǎn)。

圖5 槲皮素(a)橙皮素(b)的Scatchard分析曲線Fig.5 Scatchard analysis curves of quercetin(a) and hesperetin(b)

2.5 動(dòng)態(tài)吸附性能

利用動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)對(duì)聚合物的動(dòng)態(tài)吸附性能進(jìn)行考察，繪制MIPs與NIPs對(duì)雙模板分子槲皮素與橙皮素的動(dòng)態(tài)吸附曲線(圖略)，在1～100 min之間，MIPs的吸附速率迅速增長(zhǎng)，在100～150 min之間，吸附速率變緩，在150 min處達(dá)到平衡。這是由于MIPs微球中存在深層與淺層兩種印跡孔穴，MIPs初始吸附主要依賴于微球表面淺穴上的識(shí)別位點(diǎn)來吸附模板分子，因此吸附速率較快。隨著淺穴的吸附量逐漸達(dá)到飽和，模板分子開始逐漸以傳質(zhì)擴(kuò)散的形式進(jìn)入深穴，受到了聚合物內(nèi)部的傳質(zhì)阻力，吸附速率減緩。NIPs沒有與模板分子匹配的印跡孔穴，吸附速率相對(duì)平緩，吸附容量低。由表1可知，MIPs的吸附過程更符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，吸附過程主要為化學(xué)吸附，NIPs對(duì)的吸附過程更符合準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，屬于物理吸附。并對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)一級(jí)與準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合，結(jié)果見表1。

表1 MIPs及NIPs的準(zhǔn)一級(jí)和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)

2.6 選擇性吸附性能

為探究MIPs的特異性識(shí)別能力，選擇了包括模板分子在內(nèi)的7種常見黃酮類化合物，以及另外兩種天然產(chǎn)物中的非黃酮類藥物姜黃素、阿魏酸作為吸附底物。通過平衡吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定MIPs對(duì)9種化合物的平衡吸附容量，計(jì)算印跡因子：α(α=QMIPs/QNIPs)，結(jié)果見表2。

如表2所示，MIPs對(duì)模板分子槲皮素與橙皮素的吸附容量最大，分別達(dá)到49.82 mg/g、44.34 mg/g，印跡因子α也達(dá)到了最高的2.871與2.896。原因是聚合物內(nèi)部存在與模板分子相匹配的孔穴結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出了對(duì)模板分子的特異選擇性能；同時(shí)，MIPs對(duì)其他5種黃酮類物質(zhì)的吸附容量也較高，在46.65～37.54 mg/g之間，α達(dá)到2.665～2.081范圍。這是由于復(fù)合模板的引入優(yōu)化了MIPs內(nèi)部孔穴的空間結(jié)構(gòu)，可使MIPs識(shí)別出與模板分子結(jié)構(gòu)類似的其他黃酮類化合物，表現(xiàn)出良好的組選擇性；MIPs對(duì)姜黃素與阿魏酸兩種非黃酮類物質(zhì)的吸附容量較小，只有15.37 mg/g和18.92 mg/g。這是由于姜黃素、阿魏酸在分子結(jié)構(gòu)上與模板分子具有明顯差別，導(dǎo)致其與MIPs內(nèi)部孔穴不匹配，因此其吸附容量較?。籒IPs對(duì)9種化合物的吸附容量均較低，沒有顯著差異。原因是NIPs在制備中沒有加入模板分子，微球的內(nèi)部不存在與其相匹配的印跡孔穴，因此沒有選擇性。

2.7 黃酮類化合物的提取

2.7.1 MISPE-HPLC方法的建立分別以7種黃酮類化合物(蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、木犀草素、芹菜素、橙皮素)的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.1 ～ 20 mg/L的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2范圍在0.9993～1之間，以3倍的信噪比計(jì)算檢測(cè)限范圍在0.06～0.44 μg/L之間。

2.7.2 實(shí)際樣品分析以MIPs為固相萃取填料制備MISPE柱，對(duì)銀杏葉中黃酮類化合物進(jìn)行分離富集后，經(jīng)HPLC分析，結(jié)果見圖6。由圖可知，樣品經(jīng)MISPE柱分離富集后，有效去除了基質(zhì)的干擾。并且，使用過的MIPSPE柱經(jīng)處理后，重復(fù)使用10次，黃酮類化合物回收率仍在90%以上，說明MIPs材料比較穩(wěn)定，再生性能良好。

圖6 銀杏葉樣品色譜圖Fig.6 Chromatograms of Ginkgo biloba sample1:Rutin;2:Quercitrin;3:Quercetin;4:Luteolin;5:Apigenin;6:Kaempferol;7:Hesperitin.

2.7.3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)對(duì)銀杏葉樣品中的7種黃酮類化合物進(jìn)行3水平加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3，回收率在94.85%～98.30%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤1.8%。

表3 銀杏葉樣品中黃酮類化合物加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

3 結(jié)論

采用回流沉淀聚合法，以槲皮素和橙皮素作為復(fù)合模板，制備了對(duì)黃酮類化合物具有組選擇性能的MIPs。掃描電鏡分析確定了反應(yīng)的最佳時(shí)間為3 h。吸附實(shí)驗(yàn)表明，MIPs對(duì)黃酮類化合物均具有較高的吸附容量，其范圍介于46.65～37.54 mg/g之間。以復(fù)合模板MIPs作為固相萃取吸附劑對(duì)銀杏葉中7種黃酮類物質(zhì)進(jìn)行分離富集，能有效去除基質(zhì)雜質(zhì)，達(dá)到分離提純的目的，且MIPs重現(xiàn)性較好。同時(shí)證明此MIPs有望在天然產(chǎn)物中黃酮類化合物的分離純化，以及工業(yè)上制備對(duì)黃酮類化合物具有特異吸附性能材料方面得到進(jìn)一步的應(yīng)用。