吳 桐，黃 彧，侯萬超，夏建麗，劉春明，李賽男

(長春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室,吉林長春 130032)

葛花(PuerariaeFlos)為豆科植物野葛的干花蕾，又名葛條花，具有降低血壓[1]、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管、增加冠狀動(dòng)脈血流量[2]、解酒保肝[3]、抗炎解熱、抗氧化等作用，是中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中具有代表性的解酒藥物[4]。異黃酮類化合物，如鳶尾苷元和鳶尾苷，是葛花的主要有效成分之一[5]?，F(xiàn)代藥理研究表明，異黃酮類化合物可以通過激活肝臟內(nèi)的ADH和ALDH活性來解酒，從而保護(hù)胃黏膜，因此葛花作為異黃酮含量豐富的植物，開發(fā)利用價(jià)值較高[6]。由于傳統(tǒng)中藥成分復(fù)雜，分離難度較大，因此，建立一個(gè)快速篩選分離中藥活性成分的方法是必要的。

傳統(tǒng)的分離葛花異黃酮方法有硅膠柱色譜法、中低壓柱色譜法、高效液相色譜法[7,8]，這些常規(guī)方法存在耗時(shí)長、死吸附大的缺點(diǎn)造成樣品的缺失。高速逆流色譜(HSCCC)具有進(jìn)樣量大、分離能力強(qiáng)、樣品損失小、樣品回收率高等優(yōu)點(diǎn)，克服了固相載體對樣品的吸附損失、變性等缺點(diǎn)[9]，已被廣泛應(yīng)用于天然藥物成分的分析鑒定及分離制備[10]。超濾活性篩選法是一種以生物靶分子為目標(biāo)，快速篩選天然藥物活性成分的一種方法[11]。使用超濾技術(shù)可以更快速的發(fā)現(xiàn)天然藥物中的活性成分。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)可提供準(zhǔn)確、可靠的相對分子質(zhì)量及一些結(jié)構(gòu)信息，在各領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用[12,13]。

本研究采用高速逆流色譜及超濾質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，從葛花粗提物中分離鑒定得到染料木苷、鳶尾苷、葛根素(圖1)三個(gè)高純度異黃酮單體化合物，旨在為葛花異黃酮類活性化合物的分離與純化提供科學(xué)有效的技術(shù)支持。

圖1 化合物染料木苷(A)、鳶尾苷(B)和葛根素(C)的結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of genistin(A),tectorigenin(B) and puerarin(C)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器、試劑與材料

Waters 2695高效液相色譜儀(美國，Waters公司)；TBE300A高速逆流色譜儀(上海同田生物有限公司)；UPLC-Q-Extractive超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，Thermo Scientific公司)；離心機(jī)(美國，Sigma公司)；超濾離心管(德國，Merck Millipore公司)。

α-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.20)，乳酸脫氫酶(美國Sigma公司)；乙腈為色譜純(美國Thermo Fisher公司)；其它試劑均為分析純(北京化工廠)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水(美國Millipore公司)。

葛花購自與北京同仁堂藥店(長春店)，經(jīng)長春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室劉春明教授鑒定，確認(rèn)為豆科植物野葛的干花蕾。

1.2 樣品制備

精確稱取葛花200 g，用15倍量的70%乙醇回流提取三次，每次2.0 h，過濾，合并濾液并濃縮，所得浸膏用石油醚多次萃取，合并多次萃取后的水相提取物，將其減壓濃縮至干后，放置干燥箱中，備用。

1.3 葛花提取物α -葡萄糖苷酶、乳酸脫氫酶抑制劑的超濾技術(shù)研究

1.3.1 樣品溶液的配制準(zhǔn)確稱取葛花粗提物50 mg，溶于50%的甲醇水溶液中，配成50 mg/mL的溶液待用。

1.3.2 超濾條件20 μL 50 mg/mL樣品溶液分別與90 μL 0.2 U/mLα-葡萄糖苷酶、0.5 U/mLα-葡萄糖苷酶、1.0 U/mLα-葡萄糖苷酶,在100 μL NH4Ac緩沖溶液水浴鍋中，于37 ℃孵化30 min，將未結(jié)合的小分子與結(jié)合的復(fù)合物通過超濾膜分離。20 μL 50 mg/mL樣品溶液分別與90 μL 0.2 U/mL乳酸脫氫酶、0.5 U/mL乳酸脫氫酶、1.0 U/mL乳酸脫氫酶,在100 μL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)水浴鍋中；于37 ℃時(shí)孵化30 min，將未結(jié)合的小分子與結(jié)合的復(fù)合物通過超濾膜分離。在室溫下，用30 kD超濾膜過濾，濾后溶液以3 000 r/min離心10 min。加入100 μL 50%甲醇水溶液沖洗結(jié)合的化合物，離心10 min，若膜上還殘留有結(jié)合的復(fù)合物則重復(fù)上一步驟?？瞻捉M實(shí)驗(yàn)用相同體積的NH4Ac緩沖溶液及PBS替代酶，其他條件與實(shí)驗(yàn)組相同，最后得到的溶液用高效液相色譜法檢測。

1.4 高速逆流色譜(HSCCC)分離

配制體積比乙酸乙酯∶乙醇∶水=4.0∶0.5∶3.0(V/V/V)的三相溶劑系統(tǒng)，充分振搖后靜止過夜。分出上、下相，使用前分別用超聲脫氣30 min。取200 mg葛花粗提物，溶于8.0 mL的上/下相(1∶1，V/V)混合溶劑系統(tǒng)中，振蕩使之完全溶解。將上相(固定相)以20 mL/min的流速泵入高速逆流色譜儀的螺旋管中。待上相充滿螺旋管，使轉(zhuǎn)速穩(wěn)定在800 r/min后，以1.2 mL/min的流速泵入下相(流動(dòng)相)，當(dāng)有下相從出口流出即螺旋管的上下相已達(dá)到平衡時(shí)，將樣品溶液從進(jìn)樣圈注入高速逆流色譜儀。開啟檢測器和記錄儀，檢測波長為265 nm，根據(jù)色譜峰收集餾分。

1.5 高效液相色譜(HPLC)條件

色譜柱:SunFireTMC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈(A)和0.05%H3PO4水溶液(B)作為液相色譜流動(dòng)相，進(jìn)行二元線性梯度洗脫，流動(dòng)相梯度程序：0～5 min,90～80%B；5～20 min,80～77%B；20～35 min,77～50%B；35～40 min，50～50%B；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；檢測波長：265 nm；柱溫：30 ℃。

1.6 超高速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)條件

流動(dòng)相A為0.1%甲酸水，流動(dòng)相B為乙腈。梯度程序：0～5 min，95%～90%A；5～8 min，90%～87%A；8～16 min，87%～86%A；16～24 min，86%～76%A；24～32 min,76%～68%A；32～36 min，68%～60%A；36～50 min，60%～50%A；50～60 min，50%～39%A；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：1.0 μL；柱溫：25 ℃。質(zhì)譜為電噴霧離子源、負(fù)離子模式(ESI-)；掃描范圍:m/z150～2 000；離子阱條件：離子源噴霧電壓4.5 kV，鞘氣輔助氣為氮?dú)?，流速?0 L/min，離子阱壓力331.7 Pa;金屬毛細(xì)管溫度350 ℃，金屬毛細(xì)管電壓3.5 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 葛花提取物的超濾質(zhì)譜活性篩選

我們利用超濾色譜技術(shù)對葛花粗提物的α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行了研究，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，葛花粗提物中的化合物與0.5 U/mLα-葡萄糖苷酶的結(jié)合效果最好，葛花粗提物對酶的抑制率可以通過下式計(jì)算：抑制率(%)=(A對照-A實(shí)驗(yàn))/A對照×100%。式中，A對照為不加α-葡萄糖苷酶反應(yīng)后的峰面積，A實(shí)驗(yàn)為加入α-葡萄糖苷酶反應(yīng)后的峰面積。

圖2 葛花提取物與0.2 U/mL(A)、0.5 U/mL(B)和1.0 U/mL(C) α -葡萄糖苷酶結(jié)合的色譜圖Fig.2 Chromatograms of the extract of P.Flos with 0.2 U/mL(A),0.5 U/mL(B) and 1.0 U/mL(C) α -glucosidase inhibitors

通過進(jìn)行體外活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葛花中6個(gè)化合物具有α-葡萄糖苷酶的抑制活性。化合物的抑制活性順序?yàn)椋夯衔?>化合物6>化合物3>化合物5>化合物1>化合物2。表1數(shù)據(jù)表明，加α-葡萄糖苷酶的樣品中化合物的色譜峰面積均明顯高于空白對照組。抑制率分別為48.41%、42.16%、38.47%、31.27%、30.69%和28.75%。證明葛花中的化學(xué)成分與α-葡萄糖苷酶具有生物親和能力，可以抑制α-葡萄糖苷酶生物活性，具有潛在的抗糖尿病活性。

表1 受體結(jié)合能力通過液相色譜信號增強(qiáng)因子的表達(dá)

利用超濾色譜技術(shù)對葛花粗提物的乳酸脫氫酶(LDH)抑制活性的研究結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，葛花粗提物中的化合物與1.0 U/mL LDH的結(jié)合效果最好。通過進(jìn)行體外活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葛花中6個(gè)化合物具有LDH的抑制活性?；衔锏囊种苹钚皂樞?yàn)椋夯衔?>化合物6>化合物3>化合物5>化合物2>化合物1。表2的數(shù)據(jù)表明，加LDH的樣品中化合物的液相色譜峰面積均明顯高于空白對照組。抑制率分別為28.26%、25.73%、24.54%、18.61%、16.34%和15.67%。證明葛花中的化學(xué)成分與LDH具有生物親和能力，可以抑制LDH生物活性，具有潛在的抗腦卒中活性。

圖3 葛花提取物與0.2 U/mL(A)、0.5 U/mL(B)和1.0 U/mL(C)乳酸脫氫酶結(jié)合的色譜圖Fig.3 Chromatograms of the extract of P.Flos with 0.2 U/mL(A),0.5 U/mL(B) and 1.0 U/mL(C) LDH inhibitors

表2 受體結(jié)合能力通過液相色譜信號增強(qiáng)因子的表達(dá)

2.2 高速逆流色譜(HSCCC)對葛花中活性成分的分離

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，HSCCC最適合的K值范圍是0.5～2.0[16]。本研究中根據(jù)所分離化合物的特性，考察了乙酸乙酯-正丁醇-水、正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-水、乙酸乙酯-乙醇-水、石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水等溶劑系統(tǒng)的分配系數(shù)如表3。從表3中可以看出，當(dāng)溶劑系統(tǒng)為乙酸乙酯-乙醇-水(4.0∶0.5∶3.0,V/V/V)時(shí)，三個(gè)異黃酮類化合物能夠在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效分離純化，一次就可以得到三個(gè)高純度單體化合物。實(shí)驗(yàn)中還對流動(dòng)相的流速進(jìn)行了優(yōu)化，最終選擇流速為1.2 mL/min。在上述優(yōu)化的條件下，HSCCC分離得到3個(gè)較明顯的峰。分別收集這3個(gè)峰，采用“1.5”節(jié)條件，運(yùn)用HPLC技術(shù)對收集到的三個(gè)峰的純度進(jìn)行了檢測，得到三個(gè)單體化合物，根據(jù)面積歸一化法，其純度依次為90.60%、99.00%和91.73%，如圖4所示。此結(jié)果表明，利用HSCCC對葛花中異黃酮類的化學(xué)成分進(jìn)行大量制備分離的方法切實(shí)可行。

表3 葛花中異黃酮類成分在不同溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)(K)

圖4 葛花中粗提物(A)、分離得到的葛根素(B)、染料木苷(C)和鳶尾苷(D)的色譜圖Fig.4 Chromatograms of crude extract(A),extracted from P.Flos and puerarin(B),genistin(C) and tectorigenin(D) isolated from P.Flos

2.3 液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定葛花中異黃酮類活性物質(zhì)

為了進(jìn)一步確定HSCCC得到的3個(gè)化合物結(jié)構(gòu)，通過UPLC-Q-Extractive在負(fù)離子模式下對HSCCC所得的3個(gè)餾分進(jìn)行初步鑒定，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道對比保留時(shí)間和紫外最大吸收波長，最終鑒定了3個(gè)異黃酮化合物。單體化合物1的保留時(shí)間為6.19 min，準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z415，與文獻(xiàn)報(bào)道的葛根素分子量一致[14]。單體化合物2的保留時(shí)間為27.80 min，準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z299，與文獻(xiàn)報(bào)道的鳶尾苷分子量一致[15]。單體化合物3的保留時(shí)間為19.95 min，準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z431，與文獻(xiàn)報(bào)道的染料木苷的分子量一致[16]，結(jié)果見圖5。

圖5 化合物1(A)、2(B)和3(C)的電噴霧質(zhì)譜圖Fig.5 Electrospray mass spectra of compounds 1(A),2(B) and 3(C) in anionic mode

2.4 核磁共振波譜鑒定葛花中異黃酮類活性成分

化合物1核磁共振數(shù)據(jù)分析結(jié)果如下：ESI-MS:415[M-H]-;1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.06(1H,d,J=9Hz;C5-H),6.97(1H,d,J=9Hz;C6-H),7.33(2H,d,J=9Hz;C2,6-H),6.97(2H,d,J=9Hz;C3,5-H),8.12(1H,s,C2-H),5.07(1H,d,J=10Hz;C1-H).13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:153.1(C-2),122.8(C-3),176.9(C-4),126.7(C-5),115.5(C-6),162.0(C-7),111.6(C-8),157.1(C-9),116.9(C-10),124.0(C-1'),130.0(C-2',6'),114.9(C-3',5'),156.6(C-4'),74.3(C-1''),71.6(C-2''),78.6(C-3''),70.3(C-4''),81.3(C-5''),61.4(C-6'')。以上測定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[17]的葛根素的數(shù)據(jù)相符,故確定化合物1為葛根素。

化合物2核磁共振數(shù)據(jù)分析結(jié)果如下：ESI-MS:299[M-H]-;1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:12.7(1H,s,OH-5),9.57(1H,s,OH-4'),8.41(1H,s,H-2),6.86(1H,s,H-8),7.38(2H,d,J=8 Hz,H-2',6'),6.81(2H,d,J=8 Hz,H-3',5'),3.77(1H,s,OCH3-6),5.08(1H,d,J=8 Hz,Glc-1),3.32-3.68(6H,m,Glc-2～6).13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ:154.7(C-2),122.1(C-3),180.8(C-4),152.9(C-5),132.5(C-6),156.6(C-7),94.0(C-8),152.5(C-9),106.5(C-10),121.0(C-1'),130.2(C-2'，6'),115.1(C-3'，5'),157.5(C-4'),100.2(Glc-1),73.2(Glc-2),76.7(Glc-3),69.8(Glc-4),77.3(Glc-5),60.7(Glc-6)。以上測定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[18]的鳶尾苷的光譜數(shù)據(jù)相符,故確定化合物2為鳶尾苷。

化合物3核磁共振數(shù)據(jù)分析結(jié)果如下；ESI-MS:431[M-H]-;1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.40(1H,S,2-H)6.45(1H,d,J=2.16Hz,6-H),6.70(1H,d,J=2.16Hz,8-H),7.39(2H,dd,J=6.68,1.96Hz,2',6'-H),6.80(2H,dd,J=6.68,1.96Hz,3',5'-H).13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:153.5(C-2),122.4(C-3),180.2(C-4),162.2(C-5),99.2(C-6),162.7(C-7),94.6(C-8),157.6(C-9),104.5(C-10);121.7(C-1'),130.2(C-2'),115.4(C-3'),157.9(C-4'),115.4(C-5'),130.2(C-6');101.6(C-1''),73.3(C-2''),77.6(C-3''),68.7(C-4''),78.7(C-5''),61.2(C-6'')。以上測定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[19]的染料木苷的光譜數(shù)據(jù)相符,故確定化合物3為染料木苷。

3 結(jié)論

本文運(yùn)用高速逆流色譜和超濾質(zhì)譜聯(lián)用的方法對葛花粗提物進(jìn)行了活性成分的篩選和分離，共分離出3種α-葡萄糖苷酶抑制劑以及3種乳酸脫氫酶抑制劑，純度均達(dá)到90.0%以上。對分離得到的三種化合物運(yùn)用液-質(zhì)聯(lián)用及核磁共振波譜技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，成功鑒定出3種化合物分別為染料木苷、鳶尾苷、葛根素。該聯(lián)用方法可廣泛應(yīng)用于對異黃酮類生物靶分子相互作用的藥物篩選分離及鑒定工作。