劉國才 劉智強(qiáng) 張江 袁紅 姜鵬

新疆軍區(qū)總醫(yī)院1呼吸內(nèi)科，2血液內(nèi)科，3北京路臨床部呼吸內(nèi)科（烏魯木齊830000）；泰康同濟(jì)（武漢）醫(yī)院4感染三科，5感染四科（武漢430000）

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）是人畜共患的單正鏈RNA 病毒，屬于β屬的冠狀病毒［1］。2019年12月份首次在湖北武漢發(fā)現(xiàn)［2］。其引起的疾病，在2月11日被WHO 正式命名為 新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）［3］?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案》試行第1 ～6 版中均強(qiáng)調(diào)COVID-19 的確診需要RT-PCR 檢測病毒核酸或進(jìn)行基因測序獲得病原學(xué)證據(jù)。應(yīng)用RT-PCR進(jìn)行病毒核酸檢測曾一度被作為COVID-19 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是此方法對實(shí)驗(yàn)條件、設(shè)施、人員要求高，并且影響因素多、操作步驟多、檢測時(shí)間長。更重要的是核酸檢測雖然特異性高，但是限于各種原因?qū)е缕浼訇幮月瘦^高［4-5］。在3月3日發(fā)布的最新版《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》［6］已明確指出SARS-CoV-2 特異性抗體可以作為COVID-19確診的依據(jù)，但是由于疫情需要、臨床應(yīng)用緊急，對于SARS-CoV-2 感染人體后產(chǎn)生血清學(xué)特異性抗體的規(guī)律尚未明確，其作為確診標(biāo)準(zhǔn)的意義還有待于更多的臨床數(shù)據(jù)予以證實(shí)。因此本研究回顧性分析了768例COVID-19患者，以期探索特異性抗體產(chǎn)生規(guī)律，為臨床實(shí)踐提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象回顧性分析泰康同濟(jì)（武漢）醫(yī)院2020年2月10日至3月27日收治的COVID-19確診或疑似患者，病例診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》［7］。確診病例均具有SARS-CoV-2 病原學(xué)證據(jù)，疑似病例為具有COVID-19 流行病學(xué)、臨床和影像特征但是未能得到病原學(xué)證據(jù)的患者。

1.2 研究方法所有納入病例均在入院后進(jìn)行了SARS-CoV-2 特異性抗體和核酸檢測。SARS-CoV-2特異性抗體檢測采用磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，試劑由Bioscience 公司提供。標(biāo)本的采集、檢測程序、結(jié)果判定等按照說明書進(jìn)行。核酸檢測由經(jīng)培訓(xùn)合格的醫(yī)務(wù)人員采集患者鼻咽拭子，采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 方法檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的采用（）表示；不符合正態(tài)分布的采用M（P25，P75）表示。所有統(tǒng)計(jì)過程均采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般資料研究共納入768名患者，其中男334 例（43.5%），年齡（61.01 ± 14.78）歲，病程（41.59 ± 15.07）d。泰康同濟(jì)（武漢）醫(yī)院作為一家COVID-19 定點(diǎn)收治醫(yī)院，2月中旬開始收治患者，3月14日才開始引入特異性抗體定量檢測，因此進(jìn)行抗體檢測的患者平均病程較長，多處于疾病的恢復(fù)期。研究共納入確診患者483 例，疑似患者285 例，各組間一般資料見表1。

表1 納入對象一般資料分析Tab.1 The basic characteristics of included cases M（P25，P75）

2.2 確診和疑似病例特異性抗體陽性率確診和疑似患者特異性IgM 的陽性率分別為27.1%（131/483）和31.9%（91/285），兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.156）。確診組病例的特異性IgG 陽性率為88.8%（429/483），顯著高于疑似組的71.6%（204/285）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。確診患者中有25.7%（124/483）為雙陽性，疑似患者中有30.5%（87/285）為雙陽性，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.145）。根據(jù)第七版診療方案，SARS-CoV-2 特異性IgM 和IgG 抗體同時(shí)陽性，可以確診COVID-19，出院時(shí)將這些病例納入確診病例，重新分組后確診病例有570 例，疑似病例有198 例。見表2。

2.3 病程與特異性抗體陽性率將病例根據(jù)抗體檢測時(shí)的病程按照每兩周分組，統(tǒng)計(jì)不同組的抗體陽性率。發(fā)病1 ～2周IgM陽性率為18.4%（9/49），隨著病程延長，抗體陽性率逐漸增高，第7 ～8 周達(dá)到峰值為33.9%（105/310），第8周以后開始回落，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IgG陽性率、以及IgM和IgG雙陽性率結(jié)果類似，隨著病程延長抗體陽性率逐漸增加，在第7 ～8周達(dá)到峰值，之后開始回落（表3）。將IgM 和IgG 抗體水平的中位數(shù)與病程的關(guān)系作折線圖，可見在第8 周以后抗體水平有明顯的下降。見圖1。

表2 確診和疑似患者特異性抗體陽性率分析Tab.2 The positive rates of specific antibody in confirmed and suspected cases 例（%）

表3 病程與特異性抗體陽性率分析Tab.3 The relation between positive rates of specific antibody and course of disease 例（%）

圖1 特異性抗體水平與病程折線圖Fig.1 The plot of specific antibody level and course of disease

2.4 核酸結(jié)果與特異性抗體陽性率將病例根據(jù)抗體檢驗(yàn)日期附近的核酸結(jié)果分組，統(tǒng)計(jì)核酸陽性、陰性病例組的特異性抗體陽性率。因部分病例核酸與抗體檢測日期相差過大而未納入分析，因此此結(jié)果中病例數(shù)少于本研究納入的總病例數(shù)。核酸陽性的病例有104 例，其中IgM、IgG、IgM 聯(lián)合IgG 的陽性率分別為26.9%（28），88.5%（92），26.0%（27）；核酸陰性的病例有615 例，IgM、IgG、IgM 聯(lián)合IgG 的陽性率分別為29.1%（179）、81.3%（500）、27.6%（170）。將核酸結(jié)果分別與IgM、IgG、IgM 聯(lián)合IgG 的陽性率進(jìn)行卡方分析，核酸陽性、陰性病例組的特異性抗體陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

3 討論

病毒核酸檢測作為確診COVID-19 的金標(biāo)準(zhǔn)，具有特異性好、可早期診斷等優(yōu)點(diǎn)，但是由于采樣不規(guī)范等因素容易造成漏檢，造成假陰性較高［5，8］。特異性抗體檢測作為病毒感染性疾病的間接證據(jù)有重要意義，像乙肝、丙肝、艾滋病等病毒性疾病的診斷都離不開抗體檢測。一般認(rèn)為機(jī)體在接觸病毒時(shí)，IgM 抗體最早產(chǎn)生，維持時(shí)間也短，可以作為急性期感染的診斷指標(biāo)；IgG 產(chǎn)生稍晚，但維持時(shí)間長，血清IgG 陽性提示感染中后期或既往感染［9-10］。但以上只是一個(gè)普遍規(guī)律，SARS-CoV-2作為一種新出現(xiàn)的病毒，人們對于其引起的抗體應(yīng)答規(guī)律仍知之甚少。

表4 核酸結(jié)果與特異性抗體陽性率的關(guān)系分析Tab.4 The relation between positive rates of nucleic acid and specific antibody 例（%）

不同研究報(bào)道的COVID-19 患者特異性抗體陽性率有所不同。李萍等［11］進(jìn)行的一項(xiàng)研究顯示在COVID-19確診患者中IgM和IgG陽性率為75.9%（88/116）和90.5%（105/116），徐萬州等［12］進(jìn)行的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)確診患者中IgM 和IgG 的陽性率分別為70.24%（144/205）和96.10%（197/205）。本研究共納入確診患者483 例，疑似患者285 例，發(fā)現(xiàn)確診患者特異性IgM 和IgG 陽性率分別為27.1%（131/483）和88.8%（429/483）。本研究得出IgM 的陽性率要低于IgG，這與其他研究報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，得出的IgG 陽性率與其他研究結(jié)果相差也不大，但是IgM 陽性率要明顯低于以上兩個(gè)研究。分析原因一方面可能與檢驗(yàn)方法和采用不同公司的試劑有關(guān)［13-14］，疫情發(fā)生后，國家藥監(jiān)局開始啟動(dòng)醫(yī)療器械應(yīng)急審批程序，截止3月12日已有10 個(gè)核酸檢測試劑、6 個(gè)抗體檢測試劑得到審批投入臨床，但是尚缺乏對不同試劑診斷效能的評估和比較。另一方面可能與選擇的病例特點(diǎn)有關(guān)，處于疾病不同分期的患者抗體陽性率會有所不同［15］。

梁穎等［16］展開的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)確診和疑似組的IgM 陽性率分別為73.31%（173/236）、12.66%（10/79），確診組的陽性率是疑似組的6 倍左右，差異十分顯著。本研究并未發(fā)現(xiàn)這種差異，本研究發(fā)現(xiàn)確診和疑似患者IgM 的陽性率為分別為27.1%（131/483）和31.9%（91/285），疑似患者的陽性率略高于確診組，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.156）。本研究納入的疑似病例，從流行病學(xué)、臨床特征、CT 影像方面都高度支持COVID-19 的診斷，只是由于缺乏病原學(xué)證據(jù)而不能確診。根據(jù)第七版診療方案關(guān)于IgM 和IgG 同時(shí)陽性可以確診的推薦，本研究中有87 例（30.5%）近1/3 的疑似患者可以納入確診病例，如果可以獲得患者初期和恢復(fù)期血清化驗(yàn)IgG 滴度的話，可以得到確診的疑似患者比例將進(jìn)一步增加。因此，確診和疑似患者的抗體陽性率差異不應(yīng)該如此巨大。出現(xiàn)與別的研究不一致的原因，主要是疑似患者的選擇上。如果疑似患者經(jīng)過反復(fù)檢驗(yàn)最終得到確診的比例高，那么兩組的抗體陽性率應(yīng)該差別不大，而如果疑似患者最終被排除COVID-19 比例較高，那么兩組抗體陽性率就會呈現(xiàn)巨大差異。

新型冠狀病毒特異性IgM 抗體多在發(fā)病3 ～5 d 后開始出現(xiàn)陽性［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)最早的一例患者在發(fā)病2 d 即可檢測到IgM 和IgG 抗體同時(shí)陽性。在發(fā)病早期1 ～2 周內(nèi)特異性抗體陽性率最低，IgM 和IgG 分別為18.4%、38.8%。隨著病程延長，抗體陽性率逐漸增高，第7 ～8 周達(dá)到峰值，分別為33.9%、93.2%，第8 周以后抗體陽性率又開始下降。徐云云［19］的研究顯示特異性IgM 抗體在病程的15 ～30 d 內(nèi)陽性率最高。羅效梅等［20］分析了101 例確診患者后發(fā)現(xiàn)在發(fā)病后8 d 后抗體陽性率升到最高，28 d 后IgM 開始消失，而IgG 陽性率隨著病程延長逐漸升高，并未見到回落趨勢。一項(xiàng)追蹤SARS 患者的研究發(fā)現(xiàn)，特異性SARS-CoV IgM和IgG 在SARS 發(fā)病10 d 后逐漸升高，30 ～40 d 抗體滴度達(dá)峰，IgM 陽性率在發(fā)病51 ～60 d 后逐步下降，而IgG 陽性率在發(fā)病81 ～90 d 后逐步下降［21］。本研究得出的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 特異性抗體的達(dá)峰時(shí)間更晚，期待未來有更多的研究數(shù)據(jù)來證實(shí)這一點(diǎn)。

目前多地均有報(bào)道COVID-19 治愈出院后核酸復(fù)陽的病例［22］，可能的原因之一在于核酸檢測的假陰性率較高，根據(jù)連續(xù)2 次核酸檢測陰性做為判斷出院標(biāo)準(zhǔn)之一時(shí)，可能會將體內(nèi)仍存在病毒復(fù)制的患者解除隔離出院。而抗體檢測的穩(wěn)定性相對較好，希望能夠通過IgM 抗體陽性來預(yù)測核酸結(jié)果，從而作為輔助出院標(biāo)準(zhǔn)。將病例根據(jù)抗體檢驗(yàn)日期相近的核酸結(jié)果分組，統(tǒng)計(jì)核酸陽性、陰性病例組的特異性抗體陽性率。將核酸結(jié)果分別與IgM、IgG、IgM 聯(lián)合IgG 的陽性率進(jìn)行比較，核酸陽性組、陰性病例組的特異性抗體陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。即特異性抗體的陽性率不適合作為判斷出院的標(biāo)準(zhǔn)。李萍等［11］分析了17例確診患者轉(zhuǎn)陰前后的IgM抗體，發(fā)現(xiàn)核酸轉(zhuǎn)陰后血清IgM 抗體陽性率（52.9%，9/17）顯著低于轉(zhuǎn)陰前IgM 抗體陽性率（88.2%，15/17）。李萍等［11］研究分析的是同一批患者核酸轉(zhuǎn)換前后的血清，理論上實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上更合理，但一方面樣本量較小，另一方面抗體陽性率與病程有關(guān)，不能除外轉(zhuǎn)陰后的IgM 陽性率降低是由于病程的影響。本研究納入了719名患者進(jìn)行分析，樣本量較大，有較強(qiáng)可信度。建議進(jìn)一步開展大樣本、嚴(yán)格設(shè)計(jì)的臨床試驗(yàn)研究證實(shí)這一點(diǎn)。

本研究存在一些不足。首先這是一個(gè)回顧性分析，納入的均為確診和疑似患者，沒有設(shè)置對照組，無法計(jì)算特異性抗體診斷COVID-19 的特異度進(jìn)一步評估特異性抗體的診斷效能。其次納入的病例平均病程長、以疾病中晚期居多，對于早期病程的患者納入比例相對較少，從而對于早期抗體趨勢的判斷可能欠精確。另外缺乏對同一病例的連續(xù)觀察，尚不能完全反映SARS-CoV-2 感染后患者體內(nèi)的特異性抗體產(chǎn)生及變化規(guī)律。

綜上所述，SARS-CoV-2 特異性抗體可以作為COVID-19 輔助診斷的一個(gè)工具。隨著病程增長，抗體陽性率逐漸增高，第7 ～8 周達(dá)到峰值，第8 周以后抗體陽性率又開始下降。但是尚需要更多的研究數(shù)據(jù)進(jìn)一步探索SARS-CoV-2 特異性抗體的產(chǎn)生、變化規(guī)律和在COVID-19 疾病中的應(yīng)用價(jià)值。