劉云芬 ，廖玲燕 ，段振華 ，普紅梅 ，宋慕波 ，帥 良 ,*

（1.賀州學院食品與生物工程學院/食品科學與工程技術(shù)研究院，廣西 賀州 542899；2.云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650200）

萵苣是一種菊科蔬菜，富含豐富的蛋白質(zhì)、纖維素以及鈣、磷等礦物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗癌等保健功能，且萵苣肉質(zhì)爽脆甜口，莖可生食、涼拌，也可炒食、腌制，作為鮮切蔬菜廣受消費者的喜愛。但是由于其含水量高、組織脆嫩，切割后造成細胞破裂，進而黃化褐變，影響外觀品質(zhì)，嚴重者導致腐爛變質(zhì)，大大縮短了貨架期[1]。

褐變是影響果蔬品質(zhì)的主要因素，它直接影響消費者的購買欲。因此，控制褐變反應是食品工業(yè)的重要挑戰(zhàn)[2]。有研究者提出酶促褐變是導致變色的主要原因[3]。酶促褐變是指酚類物質(zhì)在酶的催化作用下被氧化成醌及其他聚合物的過程[4]。目前認為酶促褐變的相關(guān)酶為多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL）[5]，其中導致果蔬發(fā)生酶促褐變的主要酶為PPO[6]。

抑制果蔬的酶促褐變可以從減少酚類物質(zhì)含量、抑制PPO、POD 活性以及減少氧量這三個方面入手。熱激處理通過抑制鮮切萵苣的PAL 活性和酚類物質(zhì)的積累來抑制酶促褐變，從而延長貨架期[7]。外源水楊酸（Salicylic acid，SA）處理鮮切馬蹄，能延緩 PPO、PAL 和POD 的增加，維持較好的食用品質(zhì)[8]。赤霉素（Gibberellin，GA3）處理萵苣能減少葉綠素的損失[9]，從而減少褐變的發(fā)生，保證了鮮切萵苣的貯藏品質(zhì)。采后荔枝用水楊酸處理，能有效降低PPO 活性，提高花色素苷含量，從而減少褐變的發(fā)生[10]。乙醇作為一種自然存在于植物體內(nèi)的低毒產(chǎn)物，已經(jīng)被用來延緩組織衰老[11]，同時研究者發(fā)現(xiàn)，乙醇不僅能控制鮮切萵苣的褐變，也能控制萵苣切分后微生物的生長[12]。抗壞血酸是一種比較強的抗氧化劑，它作為PPO 的競爭性抑制劑，可以鈍化PPO 活性，有效減緩果蔬褐變[13-14]。檸檬酸是果蔬中常見的羧酸，檸檬酸在抑制PPO 活性上具有雙重作用，一是檸檬酸具有較低的pH 影響PPO 活性，二是檸檬酸能鰲合金屬銅離子，改變PPO 活性[15]。通過調(diào)節(jié)氣體成分也能實現(xiàn)抑制褐變[16-17]，其原因可能是氣調(diào)貯藏降低了O2與CO2的比值，抑制了果蔬的呼吸，從而抑制了褐變的發(fā)生。

由于前人的研究主要針對葉用萵苣，而莖用萵苣的鮮切保鮮研究報道較少，因此本研究采用不同抗褐變劑處理鮮切萵苣，通過測定與褐變相關(guān)的生理生化指標，探究不同抗褐變劑對鮮切萵苣褐變的影響，為后期鮮切萵苣護色保鮮產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

新鮮萵苣品種為紫皮萵筍，購于賀州市八步區(qū)農(nóng)貿(mào)市場，選取葉片新鮮，莖無其他機械損傷，顏色成熟度基本一致，無病蟲害的萵苣作為試驗材料，購買后立即運回實驗室進行處理。

L-抗壞血酸（VC）、檸檬酸、阿魏酸、水楊酸、鄰苯二酚、十二水合磷酸氫二鈉、甲醇、無水乙醇、濃鹽酸、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinyl pyrrolidone，PVP）、愈創(chuàng)木酚、30%H2O2、巰基乙醇、乙二胺四乙酸（EDTA）、L-苯丙氨酸、硼酸，均為分析純，廣東光華科技股份有限公司。

塑料生鮮托盤，規(guī)格為17 cm×10 cm×1.3 cm。

1.1.2 儀器與設備

722N 型可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)品；Centrifuge 5804R 型高速冷凍離心機：長沙湘銳離心機有限公司產(chǎn)品；FA2004B 型電子天平：上海精科天美科學儀器有限公司產(chǎn)品；HWS12 型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 處理方法

將新鮮萵苣洗凈后，去除多余的水分，用不銹鋼刀去皮切成厚度4 mm 左右的薄片，每個處理150片，分別于10 g/LL-抗壞血酸溶液（VC）、5 g/L 檸檬酸溶液、0.2 g/L 水楊酸（SA）溶液和 0.2 g/L 阿魏酸溶液中浸泡2 min，以去離子水浸泡作為對照組(CK)。各處理晾干后裝入塑料生鮮托盤中，并用保鮮膜封裝后放置 4 ℃冷庫中貯藏，于貯藏 0、3、6、9、12、15 d 分別取樣測定生理生化指標，每個處理重復3 次。

1.2.2 測定項目與方法

1.2.2.1 萵苣褐變度

鮮切萵苣褐變度（Browing degree，BD）的測定參照帥良等[18]的方法。取5 g 萵苣樣品加入10 mL 80%乙醇研磨成均漿，在室溫下避光反應30 min，每隔5 min 攪拌 1 次，4 ℃下 8 000 r/min 離心 10 min，收集上清液于420 nm 測定吸光度，以80%乙醇為空白，重復測定3 次。

式中：A為吸光度；V為提取液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.2.2 總酚含量和類黃酮含量

總酚含量的測定參考曹建康等[19]的方法。準確稱取1 g 樣品加入2 mL 經(jīng)過預冷的1% HCl-甲醇溶液，充分研磨后，倒入10 mL 離心管中，再加2 mL 1%HCl-甲醇溶液沖洗研缽，一并轉(zhuǎn)移到離心管中，4 ℃下放置20 min，10 000 r/min 離心15 min，收集上清液。分別于波長280 nm 和325 nm 處測定吸光值，以每克鮮重在波長280 nm 處的吸光值表示總酚含量，即A280/g FW；每克鮮重在波長325 nm 處的吸光值表示類黃酮含量，即A325/g FW。

粗酶液的提?。簻蚀_稱取1 g 樣品，加入4 mL 預冷的0.05 mol/L pH 6.8 的磷酸緩沖液（含1% PVP），充分研磨后，于4 ℃12 000 r/min 下離心15 min，上清液即為粗酶液，用于酶活性測定。

1.2.2.3 PPO 活性

參考Zhan 等[20]的方法，略有改動。3 mL 反應液中含2.8 mL 0.2 mol/L 鄰苯二酚（磷酸緩沖液配制），0.2 mL 粗酶液，在398 nm 下測定2 min 內(nèi)的吸光值，以每分鐘增加0.01 為一個酶活力單位（U），酶活性以U·g-1FW 表示，重復3 次，以緩沖液為空白對照。

1.2.2.4 POD 活性

參考Polle 等[21]的方法，略有修改。3 mL 反應液包括0.2%愈創(chuàng)木酚1.9 mL，0.1%H2O21 mL，粗酶液0.1 mL，在470 nm 處測定吸光值，以每分鐘增加0.01為一個酶活性單位（U），用 U·g-1FW 表示，每個處理重復3 次。

1.2.2.5 PAL 活性

PAL 活性測定參照Zhou 等[22]的方法。取1 g 樣品，加入3 mL 預冷的0.1 mol/L pH 8.8 硼酸緩沖液（含2 mmol/L 巰基乙醇，2 mmol/L EDTA）充分研磨后，于4 ℃12 000 r/min 下離心15 min，上清液即為粗酶液。取0.5 mL 粗酶液，2.5 mL 0.02 mol/L 的L-苯丙氨酸（40 ℃預熱 15 min），混勻后，反應液在 40 ℃水浴保溫1 h，加入0.1 mL 6 mol/L HCl 終止反應，測定290 nm 處的吸光值。以每分鐘A290變化0.01 為一個酶活單位（U），用 U·g-1FW 表示。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007，SPSS19.0 軟件進行圖表繪制及數(shù)值分析，計算標準偏差或進行Duncan’s多重差異顯著性分析，P＜0.05 時表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗褐變劑對鮮切萵苣褐變度的影響

由圖1 可知，隨著貯藏時間的延長，鮮切萵苣褐變度均呈上升趨勢。其中處理組低于CK。VC 和檸檬酸處理組的褐變度高于另兩個處理，但它們之間無明顯差異；阿魏酸處理除3 d 外，其他時間褐變度明顯低于SA 處理。由此可知，0.2 g/L 阿魏酸能顯著減少鮮切萵苣的褐變（P＜0.05），保證了貯藏期間鮮切萵苣的食用品質(zhì)。

2.2 不同抗褐變劑對鮮切萵苣總酚含量的影響

由圖2 可知，隨著貯藏時間的延長，各處理鮮切萵苣的總酚含量均呈上升趨勢。其中，CK 組樣品在貯藏6 d 后明顯高于處理組，貯藏15 d 時，CK 的總酚含量分別是VC 處理、檸檬酸處理、SA 處理和阿魏酸處理的1.46、1.48、1.52 和2 倍。對比處理組之間可知，VC 處理和檸檬酸處理之間萵苣的總酚含量沒有明顯差異，均高于水楊酸和阿魏酸處理，而阿魏酸處理在6 d 后顯著低于水楊酸處理（P＜0.05）。由此可知，阿魏酸處理能夠有效控制鮮切萵苣的總酚含量。

2.3 不同抗褐變劑對鮮切萵苣類黃酮含量的影響

由圖3 可知，隨著貯藏時間延長，不同處理鮮切萵苣的類黃酮含量均呈上升趨勢，其中以阿魏酸處理上升最少。VC、檸檬酸處理后的類黃酮含量與對照組之間總體上沒有太大差異；SA 和阿魏酸處理后的黃酮含量明顯低于其他處理，尤其是6 d 后呈顯著性差異（P＜0.05）。由此可知，SA 和阿魏酸均能抑制鮮切萵苣類黃酮的生成，其中以阿魏酸抑制效果最好。

2.4 不同抗褐變劑對鮮切萵苣相關(guān)酶活性的影響

由圖4 可見，隨著貯藏時間延長，各處理組鮮切萵苣的PPO 活性均呈先上升后下降的趨勢。其中，CK、VC、檸檬酸和阿魏酸處理均在9 d 時活性達到最大值，而SA 則是在12 d 時活性達到最大，且CK 在整個貯藏期的活性都較其他處理高，阿魏酸處理后PPO 活性一直處于較低水平。檸檬酸處理9 d 前活性低于VC 處理，但高于SA 和阿魏酸處理，9 d 后明顯高于其他三個處理。SA 處理在整個貯藏期與阿魏酸處理相差不大，僅在12 d 時顯著高于阿魏酸處理（P＜0.05）。由此可知，阿魏酸能夠有效抑制PPO 活性的升高。

由圖5 可知，在整個貯藏期間，各處理組鮮切萵苣的POD 活性變化趨勢與PPO 一致，呈先上升后下降的趨勢。在貯藏的前9 天，各個處理POD 活性相差不大，到9 d 時各處理POD 活性達到最大值，且CK顯著高于其他處理（P＜0.05）；此后各處理POD 活性降低，但CK 始終保持較高趨勢，抗褐變劑處理之間無明顯差異，阿魏酸和SA 處理保持較低的POD活性。由此可知，阿魏酸處理能夠抑制POD 活性的升高。

由圖6 可知，隨著貯藏時間的延長，各組的鮮切萵苣的PAL 活性呈上升趨勢。其中CK、VC 和檸檬酸的上升趨勢基本一致，檸檬酸處理組在貯藏前6 天活性與CK 和VC 組間無明顯差異，9 d 起低于這兩個處理；而經(jīng)SA 和阿魏酸處理后的鮮切萵苣的PAL 活性增長較為平緩，顯著低于其他三個處理（P＜0.05），且阿魏酸處理始終低于SA 處理。由此可知，阿魏酸處理能夠保持萵苣較低的PAL 活性。

3 討論與結(jié)論

褐變是影響鮮切果蔬品質(zhì)和貨架期的重要因子。目前普遍認為果蔬褐變的原因分為酶促褐變和非酶促褐變，而酶促褐變是造成鮮切果蔬褐變的主要原因[3]，其中最有說服力的機制為酚-酶區(qū)域分布學說[23]，在果蔬的正常發(fā)育過程中，酶和酚類底物在細胞內(nèi)通過一系列膜系統(tǒng)呈區(qū)域性分布，以致它們彼此分開，從而不發(fā)生酶促氧化反應[24]，當受到機械傷害時，這種區(qū)室化的平衡被打破，酶和底物接觸，發(fā)生氧化反應生成醌，醌類物質(zhì)再經(jīng)過聚合作用形成褐色產(chǎn)物，從而導致褐變[25]。因此酶促褐變的發(fā)生需要具備三個條件：酚類底物、活性氧和酚酶。

酚類物質(zhì)是酶促褐變的底物，除類黃酮外，大部分的酚類物質(zhì)均來自苯丙氨酸[26]。PAL 是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵限速酶，它能催化苯丙氨酸向酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)變；PPO 是酶促褐變過程中的關(guān)鍵酶，它將酚類物質(zhì)氧化成醌，而POD 的作用是在活性氧存在的條件下氧化多酚物質(zhì)，與PPO 協(xié)同作用使果蔬發(fā)生褐變[27-28]。本研究中，4 種抗褐變劑處理鮮切萵苣后，其PAL、PPO 和POD 活性均有不同程度的上升，但都比對照活性低，其中阿魏酸處理后較其他3 種處理活性低（圖4～6）。阿魏酸處理的萵苣的PAL 活性較低，則產(chǎn)生較少的酚類物質(zhì)，PPO 和POD 活性較低，則減少了酚類物質(zhì)氧成醌。研究表明，酚類物質(zhì)含量與褐變程度密切相關(guān)[29-30]。但也有研究表明，果蔬的褐變度與總酚含量呈負相關(guān)，與POD 活性呈正相關(guān)，而與PPO活性不相關(guān)[31]。本研究中，4 種抗褐變劑處理后萵苣中總酚含量和類黃酮含量均隨貯藏時間的延長逐漸增加，但是增長幅度較對照小，尤其是0.2 g/L 阿魏酸處理（圖2 和圖3）；本研究中采用幾種常見的抗褐變劑處理鮮切萵苣，發(fā)現(xiàn)均能不同程度的減緩褐變度的增加（圖1），其中0.2 g/L 阿魏酸處理的效果最好，表明阿魏酸能抑制萵苣褐變，很好地保持鮮切萵苣的貯藏品質(zhì)。

阿魏酸是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的酚酸，能夠與多糖和木質(zhì)素結(jié)合形成細胞壁骨架[32]，它由苯丙烷代謝途徑中PAL 催化苯丙氨酸產(chǎn)生。研究表明，與其他酚類物質(zhì)相比，阿魏酸表現(xiàn)出較強的抗氧化性[33]，因此它在食品貯藏保鮮中應用廣泛。本研究中，0.2 g/L阿魏酸處理鮮切萵苣，能有效降低PAL、PPO、POD 活性，減少酚類物質(zhì)的產(chǎn)生，從而減輕褐變，保持鮮切萵苣的貯藏品質(zhì)，這為鮮切萵苣的貯藏保鮮提供了新方法，同時為研究代謝產(chǎn)物對苯丙烷代謝途徑的反饋調(diào)節(jié)提供理論依據(jù)。