李祥明，王增凱，董明東，劉 磊

(江蘇大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院新材料研究院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

1 前 言

水凝膠是通過物理或/和化學(xué)交聯(lián)的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，是一類高度模擬軟組織特性的材料，能夠吸收高達(dá)自身重量70%的水分。此外，水凝膠具有細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的特性，能夠?yàn)榧?xì)胞的活動(dòng)和組織的形成提供穩(wěn)定的微環(huán)境，在藥物釋放與組織工程等方面具有廣泛的應(yīng)用[1]。目前用于制備水凝膠的聚合物有很多，包括合成聚合物和天然聚合物，其中天然聚合物因具有生物相容性好、免疫反應(yīng)低和可生物降解等優(yōu)點(diǎn)[2-4]，被廣泛應(yīng)用于組織工程和藥物遞送等領(lǐng)域。

蠶絲是蠶在結(jié)繭時(shí)吐出來的天然蛋白質(zhì)纖維(圖1a)[5]，主要由約70%的絲素蛋白和30%的絲膠蛋白組成，在紡織業(yè)中的使用已經(jīng)有幾千年的歷史，作為手術(shù)縫線也已有很長(zhǎng)的時(shí)間[6]。作為一種天然聚合物，絲素蛋白具有眾多優(yōu)點(diǎn)，如來源豐富、生物相容性好、力學(xué)性能優(yōu)異、可生物降解以及可化學(xué)改性等[7]。近年來，研究者對(duì)不同形式的絲素蛋白基材料在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用開展了廣泛的研究，包括凝膠[8]、膜[9]、纖維[10]、管[11]、海綿[12]和微球[13]等(圖1b)[14]。其中，水凝膠是絲素蛋白基材料的重要形式之一。絲素蛋白獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，使得能夠通過多種方法將其制備為水凝膠，這些水凝膠具有眾多可調(diào)控的性能，并已在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得了廣泛應(yīng)用。其中，光交聯(lián)絲素蛋白水凝膠由于制備條件溫和、副產(chǎn)物少、反應(yīng)過程容易控制，引起了研究者的關(guān)注。本文對(duì)光交聯(lián)絲素蛋白水凝膠的制備方法與應(yīng)用進(jìn)行了綜述。首先介紹絲素蛋白的制備、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，然后闡述光交聯(lián)絲素蛋白水凝膠的制備方法及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用，充分展示光交聯(lián)絲素蛋白水凝膠的特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)，并討論了未來的發(fā)展方向。

圖1 家養(yǎng)桑蠶及其結(jié)出來的繭(a)[5]；用蠶繭中絲素蛋白加工成的凝膠、纖維、膜、微球、管和海綿等眾多形式的材料(b)[14]Fig.1 Bombyx mori silkworm and cocoon(a)[5]; Various materials such as gels, fibers, films, microspheres, tubes and sponges processed by silk fibroin extracted from silkworm cocoons(b)[14]

2 絲素蛋白分子的結(jié)構(gòu)和特性

目前在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究最為廣泛的是家養(yǎng)的桑蠶絲，桑蠶絲由芯部的絲素蛋白(silk fibroin, SF)纖維和包覆在絲素蛋白纖維表面的絲膠蛋白組成(圖2a)[5]。桑蠶絲在使用前往往先將SF纖維外層包裹的絲膠蛋白去除(稱作脫膠)(圖2a)[5]，脫膠普遍采用的方法是將蠶繭浸泡在一定濃度的碳酸鈉沸水中煮特定的時(shí)間，脫膠時(shí)間是影響SF分子質(zhì)量的關(guān)鍵因素[14]，因此必須嚴(yán)格控制。為了得到再生SF水溶液，需要對(duì)脫膠后的SF纖維進(jìn)行進(jìn)一步溶解(圖2a)[5]。常用的方法是將脫膠后的SF纖維溶解在9.3 mol/L的溴化鋰(LiBr)水溶液和摩爾比為1∶2∶8的氯化鈣-乙醇-水三元體系中進(jìn)行處理，并進(jìn)一步在去離子水中透析3 d左右，然后離心或過濾以去除雜質(zhì)，便可得到再生SF水溶液[14, 15]。

SF是構(gòu)建SF基材料的基元。它主要由重鏈和輕鏈構(gòu)成，其中輕鏈的相對(duì)分子質(zhì)量?jī)H為26 kDa，而重鏈的相對(duì)分子質(zhì)量則高達(dá)390 kDa，它們通過二硫鍵連接在一起，另外還有一種含量較少的糖蛋白(P25)以疏水作用的方式與重鏈和輕鏈相結(jié)合[5]，三者復(fù)合形成膠束單元，在蠶的紡絲腺體內(nèi)流動(dòng)，最終在多種因素的協(xié)同作用下形成SF纖維[16-18]。在SF分子的組成上，輕鏈由非重復(fù)性且親水性較高的氨基酸序列組成，而重鏈則含有較多重復(fù)性的疏水氨基酸序列，包括甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-絲氨酸(GAGAGS)和甘氨酸-丙氨酸/絲氨酸/酪氨酸(G-A/S/T)二肽序列，這些疏水性較強(qiáng)的序列形成12個(gè)結(jié)晶區(qū)域并與親水性的非結(jié)晶區(qū)序列交替分布形成一整條重鏈[5, 19](圖2b)。其中，甘氨酸含量較高的重復(fù)序列可以在眾多因素(如溫度、甲/乙醇、剪切力、金屬離子和pH等)的誘導(dǎo)下形成疏水性較強(qiáng)的反平行β-折疊納米結(jié)晶區(qū)域[20, 21]，利用SF的這一特性，外部誘導(dǎo)可以使SF分子構(gòu)象由無定形結(jié)構(gòu)向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，從而形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，這是制備SF基水凝膠常用方法的基本原理。

SF纖維有著優(yōu)異的力學(xué)性能，這一方面得益于結(jié)晶區(qū)內(nèi)β-折疊結(jié)構(gòu)在納米空間上存在的限制；另一方面，SF纖維具有明顯的層級(jí)結(jié)構(gòu)，這種基于β-折疊自組裝形成的層級(jí)結(jié)構(gòu)(圖2c)對(duì)增強(qiáng)SF纖維的力學(xué)性能同樣起到至關(guān)重要的作用[22, 23]。β-折疊在SF基材料力學(xué)性能上也扮演了重要的角色，β-折疊含量不同，材料的力學(xué)性能也有所不同。為此，很多研究者嘗試通過不同方式處理SF基材料，以調(diào)控材料內(nèi)部β-折疊的含量。例如，室溫退火能夠誘導(dǎo)30%的β-折疊形成，而高壓蒸汽處理能得到含量大約為60%的β-折疊[24]。此外，采用SF制備的材料具有可降解的特性[25]。研究表明，這種降解性能受材料內(nèi)β-折疊含量的影響，因此可以通過控制β-折疊的含量來調(diào)控材料的降解性能[26, 27]。值得注意的是，富含β-折疊的SF基材料并不像阿爾茲海默癥中通過β-折疊組裝的淀粉樣多肽聚集體有著致病性[28]。研究結(jié)果表明，SF基材料具有很好的生物相容性，早在1993年就被美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)作為生物材料使用[29-31]。

圖2 蠶絲纖維的宏觀結(jié)構(gòu)和再生絲素蛋白水溶液的制備過程(a)[5]；絲素蛋白重鏈的分子結(jié)構(gòu)(b)[5]；蠶絲纖維的層級(jí)結(jié)構(gòu)(c)[22]Fig.2 Macrostructure of silk fiber and preparation process of regenerated silk fibroin aqueous solution (a)[5]; Molecular structure of the heavy chain of silk fibroin (b)[5]; The hierarchical structure of silk fibers (c)[22]

3 絲素蛋白基水凝膠的制備方法

由于具有良好的生物相容性，SF在生物材料中得到了廣泛使用，尤其是SF基水凝膠更受青睞。根據(jù)聚合物組成的不同，SF基水凝膠可以分為純SF水凝膠和共聚SF水凝膠。純SF水凝膠指參與水凝膠形成的聚合物組分只有SF，而共聚SF水凝膠指除了SF以外還有其他聚合物組分。參與SF共聚的聚合物通常包括聚乙二醇(PEG)[32]和聚乙烯醇(PVA)[33]等合成聚合物，以及蛋白質(zhì)[34]和多糖[35]等天然聚合物。對(duì)于一些特殊的應(yīng)用環(huán)境，單一組分制備的水凝膠表現(xiàn)出來的性能往往無法滿足實(shí)際應(yīng)用的需求，因此通過與其它材料復(fù)合來調(diào)控它們的性能成為有效的解決方案。SF與其他聚合物組分通過共混制備的復(fù)合水凝膠，能夠?qū)崿F(xiàn)SF與其他聚合物性能之間的互補(bǔ)，從而得到性能增強(qiáng)的材料。

根據(jù)交聯(lián)機(jī)制，可以將SF基水凝膠分為物理交聯(lián)水凝膠和化學(xué)交聯(lián)水凝膠。物理交聯(lián)SF基水凝膠是指參與水凝膠形成的聚合物鏈通過非共價(jià)鍵相互作用形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，如氫鍵、靜電作用和疏水相互作用等[36]。SF分子結(jié)構(gòu)中交替排列的重復(fù)序列具有較強(qiáng)的疏水性，在外界因素作用下易發(fā)生疏水區(qū)域的自組裝，形成β-折疊結(jié)構(gòu)的物理交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。常用的物理交聯(lián)手段包括升高溫度[37]、旋流處理[38]和超聲處理[39]等。物理交聯(lián)時(shí)間普遍較長(zhǎng)，且由于分子之間形成β-折疊限制了聚合物鏈的移動(dòng)，得到的水凝膠雖然強(qiáng)度較高但是通常較脆?；瘜W(xué)交聯(lián)SF基水凝膠是指參與水凝膠形成的聚合物鏈之間形成了共價(jià)鍵交聯(lián)[40]，這種方法通常包括交聯(lián)劑交聯(lián)、酶交聯(lián)和光交聯(lián)。其中，交聯(lián)劑交聯(lián)是一種簡(jiǎn)便的化學(xué)交聯(lián)方法，戊二醛和京尼平是常用的水凝膠交聯(lián)劑，它們能夠與蛋白質(zhì)分子鏈上的側(cè)基反應(yīng)生成共價(jià)鍵。SF分子鏈側(cè)基上含有較多活性官能團(tuán)，如羥基、羧基和氨基等，可以為這些交聯(lián)劑化學(xué)交聯(lián)提供活性位點(diǎn)[41, 42]。但是需要注意的是，戊二醛等交聯(lián)劑可能存在毒性，當(dāng)這些交聯(lián)劑制備的水凝膠用作醫(yī)用材料時(shí)，如果它們從水凝膠內(nèi)釋放到周圍組織中，可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性[4]。對(duì)于化學(xué)交聯(lián)的SF基水凝膠，研究者又發(fā)展出了酶交聯(lián)和光交聯(lián)SF基水凝膠。酶交聯(lián)是一種更綠色安全的方法，其凝膠化能夠在體溫、中性pH和水溶液環(huán)境下進(jìn)行。這種溫和的方法有利于細(xì)胞和一些不穩(wěn)定活性分子的包埋，而且可以實(shí)現(xiàn)前驅(qū)液可注射的原位凝膠化。酶交聯(lián)法雖然具有眾多優(yōu)點(diǎn)，但是也有很多不足，如凝膠時(shí)間較長(zhǎng)、酶容易失活，從而導(dǎo)致交聯(lián)形成凝膠的效率下降等。與酶交聯(lián)相比，光交聯(lián)不僅具有制備條件溫和、副產(chǎn)物少、生物相容性好的優(yōu)點(diǎn)，還克服了酶交聯(lián)耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)，同時(shí)這種高效率的交聯(lián)方式還具有較高的可控性。

4 光交聯(lián)絲素蛋白基水凝膠

4.1 光交聯(lián)體系及其優(yōu)勢(shì)

光交聯(lián)SF基水凝膠的制備機(jī)理主要源于自由基引發(fā)鏈聚合反應(yīng)。光引發(fā)劑在吸收光源的能量后形成自由基，攻擊預(yù)聚物上面的活性基團(tuán)，受攻擊的活性基團(tuán)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)從而形成聚合物鏈之間的交聯(lián)。光引發(fā)交聯(lián)制備水凝膠通常包括3個(gè)要素：光源、光引發(fā)劑和帶有活性基團(tuán)的預(yù)聚物。光源通常包括紫外光(200～400 nm)和可見光(400～800 nm)，其中紫外光使用較為廣泛，但其可能對(duì)DNA造成破壞并導(dǎo)致細(xì)胞死亡[43]，因此，人們漸漸避免使用紫外光，改用可見光引發(fā)交聯(lián)，減少可能造成的損害。

在選擇光引發(fā)劑時(shí)，需要考慮光引發(fā)劑產(chǎn)生的自由基的潛在細(xì)胞毒性，特別是應(yīng)用于生物醫(yī)藥方面時(shí)需要尤為注意[44]。自由基聚合光引發(fā)劑因其優(yōu)異的生物相容性得到了廣泛的應(yīng)用，其中Irgacure 2959具有適度的水溶性、低的細(xì)胞毒性和相對(duì)較小的免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，因此被普遍使用在紫外光引發(fā)聚合中。此外，一些引發(fā)效率高、生物相容性好和水溶性更好的光引發(fā)劑，如苯基-2,4,6-三甲基苯甲?；⑺徜?LAP)和偶氮引發(fā)劑VA-068也逐漸進(jìn)入人們的視野并得到應(yīng)用[45]。與此同時(shí)，為了避免使用紫外光聚合造成的潛在危害，可見光下構(gòu)建的交聯(lián)系統(tǒng)引起了人們的注意。與紫外光相比，可見光具有更高的安全性，同時(shí)在可見光下使用的光引發(fā)劑如曙紅Y和樟腦醌等具有相對(duì)更低的細(xì)胞毒性和更高的水溶性[45, 46]。因此，在可見光下構(gòu)建的交聯(lián)系統(tǒng)用于醫(yī)用材料中更凸顯優(yōu)勢(shì)。然而，在比紫外光能量低的可見光下交聯(lián)，固化速率可能會(huì)變慢[47]。

帶有活性基團(tuán)的預(yù)聚物是制備光交聯(lián)水凝膠的另一個(gè)必備要素。預(yù)聚物的活性基團(tuán)是指在光交聯(lián)過程中，經(jīng)光引發(fā)劑作用后能夠發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并使聚合物發(fā)生交聯(lián)的官能團(tuán)。這些官能團(tuán)可以是聚合物分子自身攜帶的，也可以是額外修飾的，主要起交聯(lián)作用。預(yù)聚物的選擇決定了最終水凝膠的很多關(guān)鍵性能，如降解性能和力學(xué)性能等。例如，同樣采用紫外光交聯(lián)的體系，以合成聚合物聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)制備的水凝膠和天然蛋白質(zhì)甲基丙烯酸甲酯化明膠(GelMA)制備的水凝膠在降解性能和力學(xué)性能方面都存在明顯差異。

與其他的交聯(lián)方式相比，光驅(qū)動(dòng)聚合物交聯(lián)形成水凝膠的方法具有眾多優(yōu)點(diǎn)。首先，通過光源的開關(guān)，能夠很容易地實(shí)現(xiàn)聚合反應(yīng)的開始和終止；其次，可以通過精確調(diào)節(jié)光劑量來實(shí)現(xiàn)材料功能的可調(diào)性；此外，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)曝光時(shí)間和空間的精確控制，從而達(dá)到對(duì)材料整體或局部生物學(xué)性能的調(diào)控；最后，光驅(qū)動(dòng)聚合能夠在體內(nèi)以一種非入侵的方式進(jìn)行，具有良好的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景[47]。

4.2 光交聯(lián)絲素蛋白基水凝膠的制備方法

基于以上優(yōu)點(diǎn)，近年來研究人員做了大量的工作，試圖將光交聯(lián)方法與SF的特性結(jié)合，制備出性能出眾的水凝膠。按照光交聯(lián)體系中所使用的光源，可以將光交聯(lián)SF基水凝膠分為紫外光交聯(lián)SF基水凝膠和可見光交聯(lián)SF基水凝膠。

4.2.1 紫外光交聯(lián)絲素蛋白基水凝膠

紫外光驅(qū)動(dòng)制備水凝膠在很多聚合物中都有研究，如PEGDA、GelMA和透明質(zhì)酸(MeHA)等[48-50]。這些紫外光交聯(lián)系統(tǒng)的共同特點(diǎn)是利用光引發(fā)劑形成的自由基攻擊聚合物分子上的乙烯基團(tuán)，隨后乙烯基團(tuán)間進(jìn)一步反應(yīng)，促使聚合物分子間形成化學(xué)鍵，最終形成水凝膠[51]。乙烯基團(tuán)間反應(yīng)形成的共價(jià)鍵在交聯(lián)的過程中起到了重要的作用，明膠和透明質(zhì)酸等天然聚合物中修飾的乙烯基，也是起到同樣的交聯(lián)作用。

對(duì)于SF來說，盡管在早期就有研究將乙烯基團(tuán)接枝到脫膠SF纖維表面[52, 53]，但是在SF分子鏈上進(jìn)行修飾的研究并不多，而且相關(guān)水凝膠的研究也鮮有報(bào)道。因此，制備紫外光交聯(lián)SF基水凝膠經(jīng)常采用的策略是將沒有紫外光交聯(lián)能力的SF與具有紫外光交聯(lián)能力的其他聚合物進(jìn)行共混，制備半互穿網(wǎng)絡(luò)(semi-IPN)水凝膠和互穿網(wǎng)絡(luò)(IPN)水凝膠。半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠是指當(dāng)有兩種或兩種以上的聚合物共混制備水凝膠時(shí)，若只有其中一種聚合物發(fā)生交聯(lián)形成聚合物網(wǎng)絡(luò)，而其他聚合物只是簡(jiǎn)單地分布在這些網(wǎng)絡(luò)之間，則會(huì)形成半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。若每種聚合物交聯(lián)得到單獨(dú)的網(wǎng)絡(luò)并交織在一起，則會(huì)形成互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠[33]。在半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的研究中，Kunda等制備出了光交聯(lián)的聚乙烯醇(PVA)/SF半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠，經(jīng)甲基丙烯酸異氰基乙酯修飾后PVA具有光交聯(lián)的能力，將其與SF共混并經(jīng)紫外光引發(fā)聚合，便會(huì)形成半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。其中能夠在紫外光下交聯(lián)的PVA形成自己?jiǎn)为?dú)的網(wǎng)絡(luò)，SF不具備交聯(lián)能力，便會(huì)分布在PVA形成的網(wǎng)絡(luò)之間[33]。在互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的研究中，Xiao等將GelMA與SF共混制備出了GelMA和SF分別獨(dú)立交聯(lián)的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠。GelMA是明膠經(jīng)甲基丙烯酸酐修飾后的產(chǎn)物，具有紫外光交聯(lián)能力，GelMA在紫外光和光引發(fā)劑Irgacure 2959存在的條件下發(fā)生交聯(lián)，形成化學(xué)交聯(lián)的明膠網(wǎng)絡(luò)，隨后將其暴露于甲醇溶液中，誘導(dǎo)SF形成β-折疊結(jié)構(gòu)的物理交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)交織在一起形成互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠(圖3)。與GelMA/SF形成的半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠相比，這種互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠在機(jī)械強(qiáng)度和降解性能方面都有大幅度的改善[34]。但是用于包載細(xì)胞等活性物質(zhì)時(shí)，往往要避免使用有機(jī)溶劑。因此，研究者在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn)方法，采用超聲而非甲醇處理的方法誘導(dǎo)SF形成β-折疊網(wǎng)絡(luò)，從而避免有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞等活性物質(zhì)的損傷。此外，采用改進(jìn)方法制得的GelMA/SF互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠顯示出高溶脹率、優(yōu)異的力學(xué)性能以及對(duì)膠原酶酶促降解的抵抗能力[54]?；ゴ┚W(wǎng)絡(luò)水凝膠具有單一聚合物網(wǎng)絡(luò)無法呈現(xiàn)的性能，可以通過調(diào)控聚合物的比例實(shí)現(xiàn)對(duì)材料性能的調(diào)控，這被稱為協(xié)同增益現(xiàn)象，在其它研究中也有類似報(bào)道[55, 56]。因此，利用紫外光引發(fā)交聯(lián)制備的SF互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)光驅(qū)動(dòng)體系下SF參與水凝膠的制備，而且能夠?qū)崿F(xiàn)SF和其他聚合物之間性能的互補(bǔ)，達(dá)到意想不到的增益效果，這一思路在SF水凝膠開發(fā)中具有巨大的潛力。

圖3 改性明膠(a)和GelMA/SF互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠(b)制備示意圖；GelMA水凝膠、GelMA/SF-1半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠和GelMA/SF-1互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠(從左往右)的光學(xué)照片(c)[34]Fig.3 Schematic diagram of preparation of gelatin methacrylate (a) and GelMA/SF IPN hydrogel (b); Representative optical images of GelMA, GelMA/SF-1 semi-IPN and GelMA/SF-1 IPN hydrogel (from left to right)(c)[34]

最近，在SF分子鏈上修飾乙烯基團(tuán)進(jìn)行光交聯(lián)水凝膠制備的研究取得進(jìn)展。Kim等在SF溶解的過程中，將甲基丙烯縮水甘油酯(GMA)單體加入到溶解1 h的SF/LiBr混合液中，然后在60 ℃下攪拌3 h后進(jìn)行透析和凍干，即可得到乙烯基團(tuán)修飾的SF分子(圖4a和4b)[57]。整個(gè)修飾過程在水溶液中完成，不使用有機(jī)溶劑，綠色環(huán)保。為了增加SF修飾時(shí)的穩(wěn)定性和修飾后的水溶性，他們首先降解SF，然后將降解的SF溶解于氯化鋰/二甲基亞砜中，隨后加入甲基丙烯酸異氰基乙酯并在氮?dú)獗Ｗo(hù)下實(shí)現(xiàn)了乙烯基團(tuán)在SF分子上的修飾。修飾后的SF在磷酸緩沖鹽溶液(PBS緩沖液)中顯示出很好的溶解性，制備得到的水凝膠展現(xiàn)出很好的彈性和觸變性[58]。此外，他們利用3D打印技術(shù)將修飾后的SF水溶液作為打印墨水，實(shí)現(xiàn)了各種器官的高分辨率打印。利用光引發(fā)交聯(lián)提高水凝膠的穩(wěn)定性，打印出來的三維結(jié)構(gòu)水凝膠具有較高的分辨率(圖4c)和優(yōu)異的回彈性(圖4d)[57]。除SF分子修飾外，有研究報(bào)道在SF納米/微米顆粒上修飾乙烯基團(tuán)。將這些修飾后的顆粒與修飾了乙烯基團(tuán)的殼聚糖共混，在紫外光下進(jìn)行共聚，實(shí)現(xiàn)光交聯(lián)SF水凝膠的制備[59]，成功在SF分子上修飾乙烯基團(tuán)，使得單獨(dú)的SF在紫外光下能夠交聯(lián)形成水凝膠網(wǎng)絡(luò)，這將豐富光交聯(lián)SF水凝膠的制備方法和拓寬SF水凝膠的應(yīng)用范圍。

圖4 GMA改性SF的制備(a)；GMA改性SF分子的示意圖(b)；3D打印的三維結(jié)構(gòu)SF水凝膠具有較高的分辨率(c)和優(yōu)異的回彈性(d)[57]Fig.4 Preparation of GMA modified SF (a); Schematic diagram of modification of SF molecule with GMA (b); 3D printed three-dimensional structure SF hydrogels with high resolution (c) and excellent resilience (d)[57]

除了以上方法外，利用核黃素在紫外光下交聯(lián)SF也被研究者報(bào)道。核黃素是一種天然的光引發(fā)劑，其光交聯(lián)是非特異性的，在很多材料如PEG、膠原蛋白和藻酸鹽的交聯(lián)中均有應(yīng)用。Kuang等將核黃素和辣根過氧化物酶(HRP)添加到SF水溶液中，并向反應(yīng)體系中持續(xù)通入氧氣，在紫外光照下，核黃素被激發(fā)產(chǎn)生活性氧自由基，這些活性氧自由基能夠與SF分子上的氨基和苯酚基等作用，最終引發(fā)SF交聯(lián)形成水凝膠。這種水凝膠具有很好的彈性和透明度，在細(xì)胞培養(yǎng)中展現(xiàn)出優(yōu)異的細(xì)胞相容性。雖然該方法避免了SF上的修飾，制備的水凝膠也具有一定的優(yōu)異特性，但是這種方法形成水凝膠的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)(大約30 min)，仍有很大的改進(jìn)空間[60]。

4.2.2 可見光交聯(lián)絲素蛋白基水凝膠

與紫外光驅(qū)動(dòng)的光交聯(lián)SF基水凝膠相比，可見光交聯(lián)SF水凝膠的報(bào)道相對(duì)較少。Whittaker等提出了在可見光(452 nm)下釕介導(dǎo)SF交聯(lián)形成水凝膠的方法，在該體系下，釕作為催化劑，過硫酸銨充當(dāng)電子受體，在可見光下形成的中間體使得SF分子上的酪氨酸被氧化并發(fā)生相互間的反應(yīng)，形成二酪氨酸交聯(lián)(圖5)。研究結(jié)果表明，利用該方法制備出的水凝膠在完全吸水的情況下表現(xiàn)出約78 MPa的儲(chǔ)能模量，對(duì)小鼠的軟骨前細(xì)胞培養(yǎng)表現(xiàn)出良好的生物相容性和細(xì)胞增殖效果。此外，這種方法實(shí)現(xiàn)SF凝膠化的轉(zhuǎn)變僅僅需要2 min，克服了京尼平和酶交聯(lián)耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)[61]。為了調(diào)控并改善水凝膠的力學(xué)性能，Whittaker和Balu等又進(jìn)一步利用此原理制備出釕介導(dǎo)的可見光交聯(lián)SF/彈性蛋白共聚水凝膠、SF/聚(N-乙烯基己內(nèi)酰胺)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠和SF/石墨烯復(fù)合水凝膠[62-64]。這些水凝膠都表現(xiàn)出與干細(xì)胞之間具有良好的相容性，以及在兆帕范圍內(nèi)儲(chǔ)能模量的可調(diào)控性。然而，該方法使用的催化劑釕和電子受體過硫酸銨具有潛在的毒性[65, 66]。為此，Applegate等提出用核黃素作為光引發(fā)劑、在可見光下驅(qū)動(dòng)SF交聯(lián)的策略。前面曾提到核黃素作為紫外光引發(fā)劑交聯(lián)SF，事實(shí)上，核黃素也可以作為引發(fā)劑在可見光下交聯(lián)SF。在可見光下，核黃素吸收光能后奪取SF分子上酪氨酸的電子并形成酪氨酸自由基，酪氨酸自由基之間發(fā)生反應(yīng)最終生成二酪氨酸鍵。此方法在一定程度上和釕介導(dǎo)的SF光交聯(lián)有相似的地方，但是避免了其潛在的毒性。該方法形成的SF水凝膠同樣表現(xiàn)出良好的彈性以及光學(xué)透明性，這可能是二酪氨酸鍵交聯(lián)形成SF水凝膠的共同特點(diǎn)[66]。

圖5 釕介導(dǎo)絲素蛋白分子酪氨酸交聯(lián)示意圖(a)；釕介導(dǎo)絲素蛋白交聯(lián)制備水凝膠的過程(b)[61]Fig.5 Schematic diagram for ruthenium-mediated tyrosine cross-linking of SF (a); The procedure of constructing the ruthenium-mediated SF cross-linking hydrogel (b)[61]

5 光交聯(lián)絲素蛋白基水凝膠的應(yīng)用

5.1 藥物釋放

人體的一些組織如骨和軟骨等天生缺乏血管，當(dāng)這些部位發(fā)生病變或者受到外界損傷時(shí)，全身性給藥比較困難。在這類情況下，局部給藥效率較高，成為替代全身性給藥的治療方法。水凝膠作為局部給藥的藥物載體材料，不僅具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，還可以負(fù)載藥物分子進(jìn)行緩釋，因而受到廣泛關(guān)注。近年來，研究者對(duì)局部給藥治療中作為藥物載體的光交聯(lián)SF基水凝膠進(jìn)行了初步探索。

Kundu等評(píng)估了模型藥物熒光標(biāo)記的右旋糖酐在SF/PVA光交聯(lián)半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠中的釋放性能。結(jié)果表明，右旋糖酐的釋放特性依賴水凝膠中SF的含量和右旋糖酐的相對(duì)分子質(zhì)量。通過控制SF的含量或者右旋糖酐的相對(duì)分子質(zhì)量能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)藥物釋放的調(diào)控，這種可控的水凝膠體系具有作為緩釋藥物遞送載體的潛力[33]。視黃酸是維生素A的代謝產(chǎn)物，在眼睛發(fā)育和信號(hào)傳導(dǎo)過程中起著至關(guān)重要的作用，Bhattacharjee等將其偶聯(lián)到核黃素光交聯(lián)的SF水凝膠上，用于角膜基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)。研究結(jié)果表明，這種水凝膠能更好地支持細(xì)胞粘附、增殖，促使細(xì)胞外基質(zhì)的形成和角膜細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)[67]?？紤]到SF基水凝膠的生物相容性優(yōu)勢(shì)，它更適合遞送激素類和多肽類等具有高生物活性的藥物，還可以通過控制光交聯(lián)程度實(shí)現(xiàn)藥物的可控釋放，如長(zhǎng)效釋放和短期釋放等。

5.2 組織工程

光交聯(lián)SF水凝膠具有固化效率高、水凝膠性能可控性高和易原位成膠等優(yōu)點(diǎn)，在組織工程中具有巨大的應(yīng)用潛力。近年來，光交聯(lián)SF水凝膠在組織工程特別是在軟骨組織工程的應(yīng)用中取得了突破性進(jìn)展。在軟骨組織工程中，來自膝關(guān)節(jié)、氣管等組織的軟骨細(xì)胞可在人工基質(zhì)上生長(zhǎng)，經(jīng)皮下植入并在體內(nèi)成熟后，表現(xiàn)出類天然軟骨組織的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)功能?；诖?，Hong等將甲基丙烯酸縮水甘油酯修飾的SF通過3D打印的方式制成水凝膠，并用于軟骨細(xì)胞的體外分化能力研究和小鼠氣管體內(nèi)移植的可行性研究。經(jīng)過長(zhǎng)達(dá)4周的體外細(xì)胞培養(yǎng)，這種水凝膠依然能夠維持軟骨細(xì)胞的活性，并支持細(xì)胞的增殖和分化。兔模型上氣管的體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)表明，移植的SF水凝膠周圍有新的軟骨樣組織和上皮細(xì)胞形成。該研究表明，利用3D打印制備的SF水凝膠可應(yīng)用于軟骨再生等相關(guān)的組織工程領(lǐng)域[68]。此外，外傷或疾病等對(duì)角膜造成的損傷會(huì)影響視力甚至可能導(dǎo)致失明，角膜移植在治療角膜疾病或角膜損傷上表現(xiàn)出良好的治療效果，但是可用于角膜治療的供體往往比較有限，目前角膜組織工程為這一問題提供了解決方案。光交聯(lián)SF水凝膠在角膜組織工程上也有應(yīng)用。核黃素可見光交聯(lián)的SF水凝膠具有透明度高、與角膜接觸緊密和彈性好等優(yōu)點(diǎn)，有望在醫(yī)用領(lǐng)域作為人工角膜使用[66]。另一方面，負(fù)載視黃素的紫外光交聯(lián)SF水凝膠用于體外促進(jìn)人角膜干細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種復(fù)合SF支架對(duì)人角膜細(xì)胞的形成具有促進(jìn)作用[67]。

5.3 其他應(yīng)用

以肽和蛋白質(zhì)構(gòu)建的具有精確空間圖案以及微納米結(jié)構(gòu)的生物材料有著重要的應(yīng)用。光刻技術(shù)為加工這些復(fù)雜圖案和結(jié)構(gòu)提供了一種快速、直接和高保真的選擇。利用光刻技術(shù)將乙烯基改性SF溶解在六氟異丙醇或甲酸中，將其作為光致抗蝕劑，在紫外光下構(gòu)造精密復(fù)雜圖案已經(jīng)得到實(shí)現(xiàn)[69, 70]。此外，在可見光下以核黃素作為光引發(fā)劑，水作為溶劑，利用SF作為光致抗蝕劑，光刻得到的圖案能達(dá)到40～50 μm的分辨率[67, 71]。通過這些手段得到的具有微結(jié)構(gòu)的材料可作為生物友好的納米結(jié)構(gòu)支架和柔性微設(shè)備來研究基底和細(xì)胞的相互作用，同時(shí)也可應(yīng)用于生物電子學(xué)、光子學(xué)和治療學(xué)等領(lǐng)域的研究[72]。

6 結(jié) 語(yǔ)

近年來，由于光響應(yīng)的眾多優(yōu)點(diǎn)，光驅(qū)動(dòng)聚合物形成凝膠的研究成為熱點(diǎn)。利用紫外光和可見光驅(qū)動(dòng)形成SF基水凝膠的研究取得了階段性進(jìn)展。這些水凝膠可用于藥物釋放和組織工程等相關(guān)生物醫(yī)用領(lǐng)域，盡管取得了一些階段性成果，但目前仍有很多問題需要解決，仍有很多工作需要進(jìn)一步探索。首先，雖然目前已經(jīng)開發(fā)出了多種光交聯(lián)制備SF水凝膠的方法，但部分光交聯(lián)體系下，SF形成水凝膠的機(jī)理還有待進(jìn)一步的理解；其次，制備的水凝膠作為載藥或組織工程支架在體內(nèi)使用時(shí)，藥物遞送性能、力學(xué)性能和降解性能等還需深入研究；最后，利用光交聯(lián)的優(yōu)勢(shì)，將SF與其他功能性、生物學(xué)信號(hào)豐富的聚合物或無機(jī)物相結(jié)合，制備出能滿足實(shí)際需求的復(fù)合材料，還有待進(jìn)一步發(fā)展和探索。這些研究和探索將為構(gòu)建SF基生物醫(yī)用材料提供良好的理論和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，最終使這些材料在臨床中得到應(yīng)用。