周天驕，丁曉輝，王君暉

（浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳與再生生物學(xué)研究所，杭州310058）

1 植物的光呼吸

植物的核酮糖-1，5-雙磷酸羧化酶/加氧酶（ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco）是地球上最豐富的蛋白質(zhì)，它是所有光合生物（如藍細菌、藻類和陸地植物）催化固定大氣中CO2的關(guān)鍵物質(zhì)。大約30億年前，Rubisco從一個高濃度CO2和可忽略不計O2濃度的大氣環(huán)境中進化而來，因此，其作為氧化酶的活性并未體現(xiàn)[1]。然而，由于光合作用的出現(xiàn)，大氣中的O2濃度升高，CO2濃度下降，導(dǎo)致Rubisco同時進行羧化反應(yīng)和氧化反應(yīng)。Rubisco 固定CO2會產(chǎn)生2 分子的3-磷酸甘油酸（3-phosphoglycerate, 3-PGA），而3-PGA 進入卡爾文循環(huán)后合成糖類和其他有機化合物；Rubisco 和O2發(fā)生反應(yīng)會產(chǎn)生1 分子的3-PGA 和1分子的2-磷酸乙醇酸（2-phosphoglycolate, 2-PG）[2-3]。2-PG對植物有毒害作用，它通過限制磷酸果糖激酶和丙糖磷酸異構(gòu)酶的功能來致使核酮糖-1，5-雙磷酸（ribulose-1, 5-bisphosphate, RuBP）再生減少[3-4]。為了去除2-PG并使卡爾文循環(huán)的碳損失最小化，有氧光合作用的生物體進化出了光呼吸循環(huán)途徑（也稱為C2循環(huán)）[5-6]。在目前的大氣φ（CO2）/φ（O2）=0.04%/20.95%下，C3植物1/4～1/3的RuBP 分子被氧化而不是被羧化，所以大多數(shù)陸地植物在白天產(chǎn)生大量的2-PG[7-8]。光呼吸將2 分子2-PG 再循環(huán)為1 分子3-PGA，相當(dāng)于75%的有機碳被回收用于合成RuBP，并重新回到卡爾文循環(huán)，而25%的有機碳以CO2的形式損失[9]。

2 光呼吸途徑的基因通路

在高等植物中，光呼吸循環(huán)需要8 種核心酶和幾種輔助酶以用于回收Rubisco氧化反應(yīng)產(chǎn)生的2-PG，各個反應(yīng)分布在葉綠體、過氧化物酶體、線粒體和細胞質(zhì)中，因此，光呼吸代謝物的流動需要經(jīng)過許多膜通道步驟（圖1）。迄今為止，僅鑒定出了幾種質(zhì)體轉(zhuǎn)運蛋白：質(zhì)體乙醇酸/甘油酸轉(zhuǎn)運體（plastidic glycolate glycerate transporter,PLGG1）、質(zhì)體2- 酮 戊 二 酸/蘋 果 酸 轉(zhuǎn) 運 體（plastidic 2-oxoglutarate/malate transporter, DiT1）、谷氨酸/蘋果酸轉(zhuǎn)運體（glutamate/malate translocator, DiT2.1）和膽 汁 酸/鈉 轉(zhuǎn) 運 體（bile acid sodium symporter,BASS6），而大多數(shù)過氧化物酶體和線粒體轉(zhuǎn)運蛋白仍然未知[10-13]。其中，PLGG1 為筆者實驗室先前所報道的AtLrgB[14-15]。30 多年前，研究者就預(yù)測，在光呼吸途徑中，有一個轉(zhuǎn)運體把乙醇酸從葉綠體中運出的同時把甘油酸從細胞質(zhì)運入[16-17]。我們發(fā)現(xiàn)一個由At1g32080基因編碼的蛋白被反復(fù)報道，但功能未知，于是從美國SALK的T-DNA插入突變體庫中鑒定出它的突變體，由于該蛋白的C 端有一個LrgB 結(jié)構(gòu)域，所以將其命名為AtLrgB；在擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組中它是個孤兒基因，但無論是在低等還是高等植物中，都有它的同源基因[14]。此外，另有學(xué)者從日本RIKEN的轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽突變體庫中發(fā)現(xiàn)了該基因的突變體，遵從我們的命名建議，也稱它為AtLrgB[18]。另有研究小組從生物信息學(xué)的基因共表達分析入手，發(fā)現(xiàn)它與植物光呼吸相關(guān)的基因共表達，深入研究后發(fā)現(xiàn)，它的生化功能是質(zhì)體乙醇酸/甘油酸轉(zhuǎn)運體[11]。

在葉綠體中，2-磷酸乙醇酸磷酸酶（2-phosphoglycolate phosphatase, PGLP）使2-PG 去磷酸化以產(chǎn)生乙醇酸[19]，乙醇酸由PLGG1和BASS6轉(zhuǎn)運出來，并通過未知的轉(zhuǎn)運蛋白或通道進入過氧化物酶體[11-12,20]。在過氧化物酶體中，乙醇酸被乙醇酸氧化酶（glycolate oxidase,GOX）氧化為乙醛酸并生成H2O2，H2O2隨后被過氧化氫酶（catalase, CAT）分解為H2O和O2。乙醛酸在谷氨酸∶乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶（glutamate∶glyoxylate aminotransferase,GGAT）和絲氨酸∶乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶（serine∶glyoxylate aminotransferase,SGAT）的作用下生成甘氨酸；甘氨酸從過氧化物酶體中輸出，并被未知的轉(zhuǎn)運蛋白帶入線粒體。在線粒體中，甘氨酸脫羧酶復(fù)合物（glycine decarboxylase multienzyme system, GDC）和絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（serine hydroxymethyltransferase,SHMT）聯(lián)合作用將2分子甘氨酸轉(zhuǎn)化為1 分子絲氨酸、CO2和NH3，并產(chǎn)生還原型輔酶Ⅰ（reduced nicotinamide adenine dinucleotide, NADH）。絲氨酸從線粒體回到過氧化物酶體中被SGAT催化為羥基丙酮酸，羥基丙酮酸還原酶（hydroxypyruvate reductase, HPR）將產(chǎn)生的羥基丙酮酸還原為甘油酸并消耗NADH。最后，PLGG1將甘油酸轉(zhuǎn)運到葉綠體中，被甘油酸激酶（glycerate 3-kinase, GLYK）磷酸化為3-PGA[21]。最新研究表明，GLYK 在光照下表達編碼質(zhì)體定位GLYK（plastid-localized GLYK, ptGLYK）的長mRNA，但在黑暗中它通過啟動子的可變選擇表達一個短mRNA，編 碼 細 胞 質(zhì)GLYK（cytoplasmic GLYK,cytGLYK）。cytGLYK構(gòu)成光呼吸旁路，減輕波動光誘導(dǎo)的光抑制[22]。3-PGA 作為卡爾文循環(huán)的中間體可用于RuBP的再生。光呼吸是一個消耗能量的過程，1 mol RuBP 被氧化需要消耗3.25 mol 腺苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）和2 mol 還原型輔酶Ⅱ（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH），這大概占植物在大氣中固定CO2總能量的1/3[23]。

圖1 植物的光呼吸途徑Fig.1 Photorespiration pathway of plants

在過去的40年中，光呼吸的核心酶及其相應(yīng)的基因主要是以擬南芥為模式植物被鑒定出來[24]。觀察表明，相關(guān)酶的缺失會導(dǎo)致光呼吸表型，即突變體只能在高濃度的CO2條件下存活，在大氣環(huán)境中生長不良甚至致死，所以光呼吸是植物在含氧環(huán)境中正常生長所不可或缺的途徑[12,25]。它不僅僅是植物脫毒及碳骨架回收的過程，而且已經(jīng)與氮同化、三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle,TCA）、碳代謝和硫代謝等途徑整合，共同調(diào)控植物的生長和發(fā)育[26-29]。

3 優(yōu)化光呼吸途徑的方法

在小麥、水稻和大豆等C3作物中，光呼吸使光合作用轉(zhuǎn)化效率降低20%～50%[30]，在高溫和干旱條件下甚至更高[31]。因此，優(yōu)化光呼吸途徑長期被視為作物改良的目標(biāo)[32]，尤其是在世界人口穩(wěn)步增長、自然資源供應(yīng)有限和氣候變化帶來嚴峻的挑戰(zhàn)的背景下。目前，主要通過以下4 個方面調(diào)控和優(yōu)化光呼吸。

3.1 改造Rubisco

雖然Rubisco 在植物代謝中起著核心作用，但它是一種相對低效的酶[33]。Rubisco 一直是基因調(diào)控的目標(biāo)，目的是使其具有更高的CO2特異性和更高的催化效率，但這些努力只取得了有限的成功[34-36]。大多數(shù)Ⅰ型Rubisco（發(fā)現(xiàn)于陸地植物、綠藻和藍細菌中）似乎在催化效率和底物特異性之間表現(xiàn)出平衡。因此，通過增強Rubisco對CO2的特異性來降低其加氧酶活性可能會破壞CO2的催化位點，導(dǎo)致較低的酶活性[37]；反之亦然，如果改造具有更高酶活性的Rubisco，必須降低其對CO2的特異性，導(dǎo)致更高的氧化速率[38-39]。但這一特點在來自硅藻的Ⅰ型Rubisco 中沒有觀察到，它含有碳濃縮機制（carbon concentrating mechanisms,CCM），除了氧化速率較慢以外，還維持著與C3水平相近的酶特異性和羧化轉(zhuǎn)化率[40]。

盡管如此，只是略微改進Rubisco 也可能產(chǎn)生明顯的效果。據(jù)計算，將紅藻（Griffithsia monilis）中的Rubisco 移植到作物中，可使碳同化量增加25%，因為與植物Rubisco 相比，這種酶的CO2特異性/活性比增加了2 倍[35]。然而，將深紅紅螺菌（Rhodospirillum rubrum）[41]和 藍 細 菌（Synechoccoccus elongatus）[42]的Rubisco 取代煙草的Rubisco，轉(zhuǎn)基因植物只能在高濃度的CO2環(huán)境中生長，與相應(yīng)的野生型相比顯示出嚴重的生長缺陷。重新改造的S.elongatus轉(zhuǎn)基因植株在高濃度CO2條件下恢復(fù)了生長，但與野生型相比，Rubisco 水平顯著降低為原來的10%[43]。這表明，原則上可以將高催化性能的外源Rubisco 移植到植物中，但是單獨改良的Rubisco能否在田間條件下顯著提高光合作用產(chǎn)量，仍有待證明[44]。

3.2 實施CCM

除了直接改造Rubisco外，另外一種途徑是通過增加Rubisco 附近的CO2濃度，從而有效地抑制Rubisco 的氧化反應(yīng)，提高CO2的固定效率[45]。與植物Rubisco相比，藍細菌進化出對O2更敏感的酶，然而，使藍細菌在高氧環(huán)境中茁壯成長的是它們復(fù)雜的CCM。功能性CCM 所需的成分包括Rubisco 周圍的羧基體、碳酸酐酶以及無機碳轉(zhuǎn)運蛋白[46-50]。通過使用活性碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白和CO2吸收系統(tǒng)，藍細菌胞質(zhì)溶膠中積累的無機碳濃度比CCM 突變體高1 000 倍[51]。此外，Rubisco 和Ca2＋被封裝在羧基體內(nèi)，導(dǎo)致Rubisco 活性部位周圍的CO2濃度升高；而且羧基體的可選擇性滲透蛋白的外殼使內(nèi)部O2濃度最小化，從而防止浪費的光呼吸[52]。據(jù)估計，將一種功能性藍細菌CCM 移植到C3植物將導(dǎo)致CO2同化量增加36%～60%[53]。即使僅從CCM引入碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白，對光合作用也有明顯的凈效益[53-54]。

另一個研究方向是在無CCM 作物的葉綠體內(nèi)引入羧基體，預(yù)計在高溫和干旱條件下可使產(chǎn)量提高60%[53]。功能性羧基體已經(jīng)在大腸埃希菌中重組，證明其在外源宿主中具有強大的自組裝潛力，提高了將羧基體引入其他生物體的可行性[55]。將β-羧基蛋白引入煙草的葉綠體中，自組裝出更高級的蛋白結(jié)構(gòu)[56]。在煙草中表達藍細菌的Rubisco 和羧基體內(nèi)部結(jié)構(gòu)蛋白CcmM，葉綠體內(nèi)產(chǎn)生了這2種蛋白的聚合體，類似于早期的羧基組裝復(fù)合體[42]。這些結(jié)果為未來葉綠體功能性羧基體的研究奠定了基礎(chǔ)?？紤]到每個葉綠體所需的羧基體數(shù)目尚不清楚，引入這種復(fù)雜的CCM 是對植物有益還是負擔(dān)仍有待觀察[57]。

3.3 優(yōu)化光呼吸酶的表達

另外一種降低光呼吸對作物產(chǎn)量影響的方法是優(yōu)化光呼吸酶的表達，加速光呼吸通量，使葉綠體中2-PG 和乙醇酸的積累和毒性效應(yīng)最小化，從而提高RuBP 再生率，改善植物的生長。有研究表明，植物光呼吸途徑的通量受線粒體甘氨酸-絲氨酸轉(zhuǎn)化率的限制[58]。GDC 包含4 個亞基（L、H、P、T亞基），擬南芥GDC不同亞基的過表達支持該假設(shè)。H-蛋白[59]或L-蛋白[60]的過表達降低了CO2補償點，且優(yōu)化了植物的生長，這可能是由于光呼吸途徑的通量增加[61-62]。T-蛋白顯然不是一個限制因子，因為其活性的下調(diào)或上調(diào)都不會影響光合CO2的固定和植物的生長[63]。此外，當(dāng)植物暴露于高光呼吸壓力條件下，煙草中H-蛋白的過表達減少了對光系統(tǒng)Ⅱ的損害[62]。水稻線粒體SHMT的過表達也能夠提高水稻的光合效率和植株生產(chǎn)力[64]。在分子水平上，產(chǎn)生上述結(jié)果的原因和影響尚不清楚，但線粒體反應(yīng)的能力似乎可以控制整個光呼吸通量，或以某種方式參與光合活性的調(diào)節(jié)。近年研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸可能作為光呼吸轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的代謝信號，進一步支持了這一觀點[65]。

與那些有益的作用相比，SGAT 的過表達對植物有負面的影響。在大氣環(huán)境條件下，過表達SGAT 使植物光合作用的CO2攝取減少，絲氨酸和天冬酰胺消耗增加，從而擾亂C/N平衡，導(dǎo)致植物生長不良[66]。顯然，光呼吸與其他代謝途徑（如氮代謝）緊密相連，改造任一光呼吸酶也會對其他代謝過程造成影響，所以我們應(yīng)更好地理解這些代謝途徑的相互作用和相互依賴性。

3.4 設(shè)計光呼吸旁路

設(shè)計光呼吸旁路的目的在于避免線粒體甘氨酸脫羧和NH3的釋放，降低光呼吸的能量成本。目前，在模式植物中主要設(shè)計了3種光呼吸旁路（圖2）。

第1種是在葉綠體中引入甘油酸旁路。該途徑在葉綠體中將乙醇酸轉(zhuǎn)化為甘油酸，并釋放1 分子的CO2，甘油酸再回到卡爾文循環(huán)中[67]。該過程避免了NH3的釋放，ATP 消耗少。由于整個過程在葉綠體中進行，因此CO2會在Rubisco 附近釋放，從而減少氧化反應(yīng)[68-69]。將大腸埃希菌的甘油酸途徑引入擬南芥、馬鈴薯和茶樹的葉綠體后，轉(zhuǎn)基因植株的光合作用增強，生長速率加快，生物量增加。有趣的是，在葉綠體中單獨過表達乙醇酸脫氫酶（glycolate dehydrogenase,GDH）的轉(zhuǎn)基因植株中也意外地觀察到生長的改善，這表明需要更多的探究來充分了解葉綠體中發(fā)生的生物化學(xué)變化[67-69]。

第2 種是在過氧化物酶體中引入甘油酸旁路。在煙草的過氧化物酶體中引入大腸埃希菌乙醛酸醛連接酶（glyoxylate carboligase,GCL）和羥基丙酮酸異構(gòu)酶（hydroxypyruvate isomerase,HYI），將乙醛酸轉(zhuǎn)化為羥基丙酮酸，進而轉(zhuǎn)化為甘油酸，從而繞過線粒體[70]。雖然這種替代途徑可能會降低2-PG回收的成本，但在這些煙草株系中無法檢測到HYI蛋白，因此，其對植物產(chǎn)量的影響有待證實[71]。

第3種是在葉綠體中引入蘋果酸合成途徑。該途徑需要表達GOX、CAT 和蘋果酸合成酶（malate synthetase, MS），在葉綠體中將2-PG 氧化為CO2，從而繞過NH3的釋放，并提高了Rubisco周圍的CO2濃度，可以導(dǎo)致生物量增加。這一途徑在擬南芥中進行試驗表明，轉(zhuǎn)基因植株的光合速率和鮮質(zhì)量均有所提高[72]。

最近，這些光呼吸旁路經(jīng)過改造已應(yīng)用于煙草中。SOUTH等在煙草的葉綠體中設(shè)計了3種旁路：1）使用大腸埃希菌乙醇酸氧化途徑中的5 個基因；2）使用植物的乙醇酸氧化酶和蘋果酸合成酶以及大腸埃希菌中的過氧化氫酶；3）使用植物的蘋果酸合成酶和綠藻乙醇酸脫氫酶。同時，利用RNA干擾技術(shù)（RNA interference,RNAi）抑制PLGG1，防止乙醇酸的輸出。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草植株的生產(chǎn)力比野生型植株提高了40%[30]。

事實上，自然光呼吸和各種合成旁路之間實際流量的分布仍然難以確定，為了評估這些旁路對植物光呼吸代謝的影響，還應(yīng)開展進一步的研究工作。

4 展望

光呼吸是植物長期進化中獲得的重要代謝途徑，可以使植物在含氧環(huán)境中健康成長；但它同時又是浪費能量的過程，成為制約作物產(chǎn)量的重要因素。目前已鑒定出光呼吸途徑的核心基因通路，然而過氧化物酶體和線粒體的大部分相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白和通道仍然未知，還需要進一步探究。另外，更深入地了解光呼吸中間產(chǎn)物在其他代謝途徑中的作用也是一個重要的研究方向。目前已有幾種調(diào)控和優(yōu)化光呼吸的方法，植株的生物量也有所增加，但是大部分使用的是模式植物，將這些方法應(yīng)用到主要糧食作物上仍是一個巨大的挑戰(zhàn)，且對植物抗逆性的影響還不可預(yù)知。盡管如此，優(yōu)化光呼吸的研究具有良好的發(fā)展前景，代謝工程、合成生物學(xué)和數(shù)學(xué)建模等方向的結(jié)合為優(yōu)化光呼吸途徑開啟了新的大門，有望達到提高農(nóng)作物產(chǎn)量的最終目的。

圖2 3種優(yōu)化光呼吸途徑的方法Fig.2 Three approaches to optimizing photorespiration pathway