祝銀，朱劍*，李子孟，王姮，尤炬炬，劉琴

（1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山316021；2.浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山316021）

鉻（chromium, Cr）是人體必需的微量元素，廣泛分布于大氣、水體和土壤中，但自然界中不存在游離態(tài)的Cr，主要以鉻鐵礦（FeCr2O4）的形式存在于地殼中。Cr 常見化合價(jià)為+2、+3、+6，其中，三價(jià)鉻[Cr（Ⅲ）]和六價(jià)鉻[Cr（Ⅵ）]最為常見[1-4]。Cr（Ⅲ）能協(xié)同胰島素，參與生物體內(nèi)糖類、脂質(zhì)等的合成代謝，維持生物體內(nèi)正常的葡萄糖水平，促進(jìn)血紅蛋白的合成，同時(shí)抑制脂肪酸和膽固醇的合成[5-9]。而Cr（Ⅵ）由于具有強(qiáng)氧化性和高滲透性，極易被人體吸收，經(jīng)消化道、呼吸道、皮膚及黏膜侵入人體，有刺激、致癌、誘發(fā)基因突變的作用，對人體和環(huán)境有持久危害性，故有必要對生物和環(huán)境中的Cr形態(tài)進(jìn)行分析，以正確評估其對人體和環(huán)境的安全風(fēng)險(xiǎn)水平。

厚殼貽貝（Mytilus coruscus）生長速度快，出肉率高，營養(yǎng)豐富，味道鮮美，且經(jīng)濟(jì)效益高，已成為淺海規(guī)模養(yǎng)殖的主要貝類之一[10]。由于厚殼貽貝具有吸收或經(jīng)食物鏈傳遞富集重金屬的特性，因此被認(rèn)為是生態(tài)毒性研究的良好的無脊椎動(dòng)物模型之一[11-13]，但有關(guān)貽貝中Cr 形態(tài)的研究較少。鑒于厚殼貽貝龐大的市場需求和突出的富集能力，結(jié)合不同Cr 形態(tài)的生化特性，本研究以厚殼貽貝為對象，采用Cr（Ⅵ）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為染毒試劑，通過監(jiān)測厚殼貽貝體內(nèi)Cr形態(tài)及含量變化，探究Cr（Ⅵ）在厚殼貽貝中的轉(zhuǎn)化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)生物：厚殼貽貝（取自浙江省舟山市普陀區(qū)東河菜場），平均殼長（9.94±0.60）cm，殼寬（4.51±0.30）cm，殼高（3.23±0.20）cm。實(shí)驗(yàn)前馴養(yǎng)2 周，挑選健康、規(guī)格一致的個(gè)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)容器：選用尺寸為80 cm×50 cm×50 cm 的聚乙烯塑料桶，每次實(shí)驗(yàn)前將養(yǎng)殖桶徹底清洗干凈，曝曬消毒。

養(yǎng)殖條件：實(shí)驗(yàn)用海水取自浙江省舟山市普陀區(qū)桃花島附近海域，鹽度22.5～24.0，pH 8.0～8.2，經(jīng)沉淀、砂濾和充分曝氣后用于實(shí)驗(yàn)。采用無火焰原子吸收分光光度法[14]測得養(yǎng)殖海水中總Cr 質(zhì)量濃度為0.000 5 mg/L，采用二苯碳酰二肼分光光度法[14]測得養(yǎng)殖海水中Cr（Ⅵ）質(zhì)量濃度小于0.004 mg/L，而采用高效液相色譜-串聯(lián)電感耦合等離子體-質(zhì)譜法（high performance liquid chromatographyinductively coupled plasma-mass spectrometry,HPLC-ICP-MS）[15]測得養(yǎng)殖海水中Cr（Ⅵ）質(zhì)量濃度為0.000 4 mg/L。用以上方法測得的養(yǎng)殖海水中Cr 質(zhì)量濃度均符合GB 3097—1997《海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》[16]中的一類標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)期間室溫控制在20～24 ℃之間，水溫控制在22.1～23.7 ℃之間，24 h 保持充氣。實(shí)驗(yàn)中Cr（Ⅵ）質(zhì)量濃度使用國家有色金屬及電子材料分析測試中心生產(chǎn)的有效期內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。

實(shí)驗(yàn)試劑：Cr、Cr（Ⅵ）、Cr（Ⅲ）單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L，購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心。硝酸（HNO3，優(yōu)級(jí)純，德國Sigma 公司）；過氧化氫（H2O2，優(yōu)級(jí)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氨水（NH3·H2O，優(yōu)級(jí)純，德國Sigma 公司）；乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA-2Na，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司）；C18-SPE固相萃取柱（3 mL/g，美國Waters 公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q系統(tǒng)制備的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀和7900電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；微波消解儀（意大利Milestone公司）；微控?cái)?shù)顯電熱板及趕酸架（北京萊伯泰科儀器股份有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 暴露實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

向養(yǎng)殖桶內(nèi)的實(shí)驗(yàn)海水中添加Cr（Ⅵ）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配置成2個(gè)不同Cr（Ⅵ）質(zhì)量濃度（0.05和0.50 mg/L）的海水溶液，配置時(shí)扣除海水重金屬背景值。將厚殼貽貝隨機(jī)分為3組，分別為空白對照組、低劑量富集組[0.05 mg/L Cr（Ⅵ）]和高劑量富集組[0.50 mg/L Cr（Ⅵ）]，每組設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，暴露持續(xù)7 d。每個(gè)養(yǎng)殖桶中放入30 只厚殼貽貝、20 L 天然海水。實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)充氧，以保持水體中溶解氧含量充足和重金屬分布均勻。為避免餌料和糞便對Cr（Ⅵ）含量的影響，實(shí)驗(yàn)期間不投喂。采用靜態(tài)間歇換水方式，每24 h 100%更換清潔海水，并于換水前隨機(jī)取樣。每桶取水樣50 mL和4只厚殼貽貝作為平行樣，整貝勻漿，取勻漿后的樣品，放入真空冷凍干燥機(jī)中干燥，磨碎后過40 目篩，凍藏于-20 ℃冰箱中，30 d內(nèi)完成測定。每次換水時(shí)，重新按照設(shè)定的質(zhì)量濃度系列配置實(shí)驗(yàn)溶液。

1.3.2 樣品分析

1.3.2.1 總Cr測定

稱取0.500 g（精確至0.001 g）樣品，置于聚四氟乙烯消解罐中，依次加入5.0 mL 硝酸、2.0 mL 過氧化氫，加蓋搖勻，放置過夜。次日，將消解罐放入微波消解外罐中，旋緊密封，然后放入微波消解儀中消解。消解結(jié)束后，關(guān)閉微波消解儀，待外罐冷卻至室溫時(shí)，開蓋取出（將蓋內(nèi)側(cè)液珠洗入消解罐中），置于趕酸架上，于180 ℃條件下加熱趕酸至1.0 mL，冷卻至室溫后用超純水稀釋消化液，轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中并定容至刻度，采用電感耦合等離子體-質(zhì)譜法（inductively coupled plasma-mass spectrometry,ICP-MS）測定。

1.3.2.2 Cr形態(tài)測定

準(zhǔn)確稱取待測樣品0.500 0 g（精確到0.000 1 g），置于50 mL 離心管中，加入40.0 mL 20 mmol/L EDTA-2Na溶液，3 000 r/min渦旋1 min；然后置于氣浴恒溫振蕩器中，于60 ℃、180 r/min條件下振蕩1 h。振蕩完成后，冷卻至室溫，以4 ℃、7 000 r/min離心10 min；移取上清液5 mL，過已用5.0 mL 甲醇、5.0 mL超純水活化后的C18 柱，棄去前1.0 mL 上樣液，收集剩余上樣液，取1.0 mL 用超純水定容至5.0 mL，過0.22 μm濾膜后，用HPLC-ICP-MS分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 暴露液中Cr（Ⅵ）含量變化及遷移量

暴露液在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均未檢出Cr（Ⅲ），其Cr（Ⅵ）含量變化及遷移量如表1 所示。從中可知：低劑量組暴露液中Cr（Ⅵ）質(zhì)量濃度最高為第7天時(shí)的48.57 μg/L，最低為第1 天時(shí)的34.19 μg/L；高劑量組暴露液中Cr（Ⅵ）質(zhì)量濃度最高為第7 天時(shí)的488.23 μg/L，最低為第1 天時(shí)的387.28 μg/L。Cr（Ⅵ）質(zhì)量濃度隨暴露時(shí)間的延長而增加，但其質(zhì)量濃度變化速率逐漸降低；Cr（Ⅵ）遷移量隨暴露時(shí)間的延長而減小。這可能由以下2 方面的原因造成：一方面，隨著取樣次數(shù)的增加，厚殼貽貝數(shù)量變少，導(dǎo)致暴露液中Cr（Ⅵ）遷移量和Cr（Ⅵ）質(zhì)量濃度變化速率降低；另一方面，隨著暴露時(shí)間的延長，厚殼貽貝體內(nèi)Cr（Ⅵ）富集水平逐漸趨于平衡狀態(tài)，貝體蓄積能力的減弱使暴露液中Cr（Ⅵ）遷移量降低。

在暴露期間，低劑量組Cr（Ⅵ）總量約為7 000 μg，總遷移量為1 006.6 μg，遷移率為14.4%；高劑量組Cr（Ⅵ）總量約為7.0×104μg，總遷移量為6 085.0 μg，遷移率為8.7%。根據(jù)采樣時(shí)間節(jié)點(diǎn)和貽貝剩余數(shù)量，結(jié)合暴露液中Cr（Ⅵ）遷移量，得到單個(gè)厚殼貽貝在不同時(shí)間點(diǎn)的Cr（Ⅵ）遷移累積量（圖1）。從中可以看出：單個(gè)厚殼貽貝Cr（Ⅵ）遷移累積量呈現(xiàn)先快后緩的增長趨勢，低劑量組從第1 天的10.027 μg，增加到第7天的47.286 μg；高劑量組從第1天的69.627 μg，增加到第7天的288.218 μg。

表1 暴露液中Cr（Ⅵ）含量變化及遷移量Table 1 Contents and migration amounts of Cr(Ⅵ) in exposure solution

圖1 單個(gè)厚殼貽貝Cr（Ⅵ）遷移累積量Fig.1 Total amounts of Cr(Ⅵ)migration in single M.coruscus

2.2 厚殼貽貝Cr 含量變化

暴露期間，厚殼貽貝均正常生長，無死亡?？瞻讓φ战M的厚殼貽貝總Cr 與Cr（Ⅲ）質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（0.53±0.04）和（0.065±0.005）mg/kg。實(shí)驗(yàn)分析所用的數(shù)據(jù)均扣除空白對照組，其中Cr（Ⅵ）未檢出。

2.2.1 厚殼貽貝總Cr 含量變化

厚殼貽貝在整個(gè)暴露實(shí)驗(yàn)中總Cr 含量變化如圖2所示。在2種不同Cr（Ⅵ）劑量水平下，厚殼貽貝體內(nèi)總Cr含量均隨著積累時(shí)間的延長而不斷增加。低劑量組總Cr質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.530 mg/kg上升至1.766 mg/kg，平均增速為0.176 mg/（kg·d-1）；高劑量組總Cr質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.530 mg/kg上升至8.556 mg/kg，平均增速為1.146 mg/（kg·d-1）?？傮w來看，總Cr含量呈現(xiàn)階段性變化：第1—3天為主要富集階段，低、高劑量組在此階段分別完成了整個(gè)暴露實(shí)驗(yàn)富集量的74.8%和78.6%；第4—7 天總Cr 含量變化速率已低于平均增速，且趨于平穩(wěn)，說明可能將達(dá)到富集平衡狀態(tài)。至富集實(shí)驗(yàn)結(jié)束，低劑量組總Cr含量未超過安全限量值2.0 mg/kg；高劑量組總Cr含量在第1天就超過了安全限量值，表明水體中0.5 mg/L Cr（Ⅵ）的添加量足以使厚殼貽貝受到污染而不宜食用。

圖2 厚殼貽貝體內(nèi)總Cr含量變化Fig.2 Change of total Cr content in M.coruscus

2.2.2 厚殼貽貝Cr（Ⅲ）含量變化

厚殼貽貝體內(nèi)Cr（Ⅲ）含量隨時(shí)間變化曲線見圖3。Cr（Ⅲ）含量隨著暴露時(shí)間的延長而增加，高、低劑量組分別從0.065 mg/kg上升至2.431 mg/kg和0.408 mg/kg，平均增速分別為0.338 mg/（kg·d-1）和0.049 mg/（kg·d-1）。低劑量組前4 d 的富集量占總富集量的74.6%，后3 d 占25.4%；高劑量組前4 d的富集量占總富集量的82.2%，后3 d 富集甚微。表明厚殼貽貝中Cr（Ⅲ）富集的主要階段在第1—4 天。

圖3 厚殼貽貝體內(nèi)Cr（Ⅲ）含量變化Fig.3 Change of Cr(Ⅲ)content in M.coruscus

2.2.3 厚殼貽貝有機(jī)Cr 含量變化

在暴露實(shí)驗(yàn)中，暴露液中均檢出Cr（Ⅵ），但Cr（Ⅲ）未檢出；在厚殼貽貝中均未檢出Cr（Ⅵ），而Cr（Ⅲ）和總Cr都有檢出，且數(shù)值相差較大。表明暴露液中Cr（Ⅵ）轉(zhuǎn)化為其他形態(tài)而存在于厚殼貽貝體內(nèi)?？侰r 包括無機(jī)Cr 和有機(jī)Cr。其中，無機(jī)Cr分為Cr（Ⅱ）、Cr（Ⅲ）、Cr（Ⅳ）、Cr（Ⅴ）和Cr（Ⅵ）。而Cr（Ⅱ）是一種強(qiáng)還原劑，極易被氧化成Cr（Ⅲ）；Cr（Ⅳ）和Cr（Ⅴ）只是Cr（Ⅲ）與Cr（Ⅵ）轉(zhuǎn)化過程中的中間價(jià)態(tài)；Cr（Ⅲ）是最穩(wěn)定的氧化態(tài)，也是生物體內(nèi)Cr 的主要存在形態(tài)。綜上可得，總Cr 為有機(jī)Cr、Cr（Ⅲ）與Cr（Ⅵ）的總和；考慮到厚殼貽貝體內(nèi)未檢出Cr（Ⅵ），因此，本研究測定的總Cr為有機(jī)Cr與Cr（Ⅲ）的總和。通過差減法得到本研究有機(jī)Cr的含量（圖4）?？梢钥闯觯河袡C(jī)Cr 含量隨著暴露時(shí)間的延長而增加，低劑量組前3 d 的富集量占到總富集量的80.3%；高劑量組前3 d的富集量占到總富集量的83.4%。表明厚殼貽貝中有機(jī)Cr 富集的主要階段在第1—3天。

2.3 Cr 在厚殼貽貝中的形態(tài)特征

由暴露液和厚殼貽貝中Cr 含量的變化可知，Cr（Ⅵ）在厚殼貽貝體內(nèi)完全被還原或絡(luò)合，以Cr（Ⅲ）和有機(jī)Cr 的形態(tài)存在。厚殼貽貝在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中Cr 形態(tài)變化及轉(zhuǎn)化率見表2。暴露液中Cr（Ⅵ）遷移途徑包括環(huán)境吸附（養(yǎng)殖箱、厚殼貽貝的表殼）和厚殼貽貝體內(nèi)蓄積。因此，暴露液中Cr（Ⅵ）遷移量大于厚殼貽貝體內(nèi)Cr（Ⅵ）遷移累積量，導(dǎo)致計(jì)算得到的轉(zhuǎn)化率均在70%以下。

圖4 厚殼貽貝體內(nèi)有機(jī)Cr含量變化Fig.4 Change of organic Cr content in M.coruscus

由表2可知，隨著暴露量的增加，Cr轉(zhuǎn)化率都得到了提升，總Cr提升了2.6%～9.2%，Cr（Ⅲ）提升了0.9%～3.3%，有機(jī)Cr 提升了0.9%～8.3%。整體來看，Cr 形態(tài)轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的延長而降低：低劑量組總Cr 從開始的52.6%降到39.2%，降幅13.4%；高劑量組總Cr 從61.8%降到41.8%，降幅20.0%；低劑量組Cr（Ⅲ）從12.1%降到10.4%，降幅1.7%；高劑量組Cr（Ⅲ）從14.2%降到12.5%，降幅1.7%；低劑量組有機(jī)Cr 從開始的40.5%降到28.4%，降幅12.1%；高劑量組有機(jī)Cr 從48.8%降到29.3%，降幅19.5%?？傊?，總Cr轉(zhuǎn)化率降低較快，而Cr（Ⅲ）較慢，隨著時(shí)間的推移，Cr（Ⅲ）占總Cr的比例越來越高（圖5），有機(jī)Cr比例逐漸降低。上述結(jié)果表明，除暴露液遷移的Cr（Ⅵ）還原成Cr（Ⅲ）外，厚殼貽貝體內(nèi)部分有機(jī)Cr也能轉(zhuǎn)化為Cr（Ⅲ）。

綜上得到：Cr（Ⅵ）無法穩(wěn)定存在于厚殼貽貝體內(nèi)；Cr 在厚殼貽貝體內(nèi)主要以Cr（Ⅲ）和有機(jī)Cr 形態(tài)存在，其中Cr（Ⅲ）占21.0%～29.9%，有機(jī)Cr 占70.1%～79.0%；隨著時(shí)間的推移，部分有機(jī)Cr 轉(zhuǎn)化為Cr（Ⅲ），且Cr（Ⅲ）比例不斷升高。

2.4 Cr（Ⅵ）在厚殼貽貝中的轉(zhuǎn)化規(guī)律

相關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)：Cr（Ⅵ）進(jìn)入厚殼貽貝體內(nèi)，易被金屬硫蛋白的巰基基團(tuán)螯合，導(dǎo)致Cr（Ⅵ）含量降低[7,17]；另外，Cr（Ⅵ）可通過非特異性離子通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生反應(yīng)，被還原成Cr（Ⅲ）；而Cr（Ⅲ）能形成多齒配位化合物，不易穿過細(xì)胞膜，且反應(yīng)活性很低，是Cr在生物體內(nèi)的主要存在形式[18-19]。JOBBY 等[7]提出，在高等植物、藻類等生物體中存在的特定分子如金屬硫蛋白、植物螯合素、羥基和硫酸根等作為官能團(tuán)與Cr（Ⅵ）形成化學(xué)鍵，使得Cr（Ⅵ）被螯合或被還原成Cr（Ⅲ）；REVATHI 等[20]利用高粱研究Cr 在其中的轉(zhuǎn)化，與JOBBY 等[7]的研究結(jié)果類似。SEMENIUK等[21]利用放射性同位素51Cr研究了浮游植物中短期Cr（Ⅲ）與Cr（Ⅵ）的積累，結(jié)果表明，Cr（Ⅲ）是浮游植物細(xì)胞內(nèi)最主要的存在形態(tài)。以上學(xué)者的相關(guān)結(jié)論均證明Cr（Ⅵ）不能穩(wěn)定存在于生物體內(nèi)，而是通常被還原成Cr（Ⅲ）或以有機(jī)絡(luò)合物的形式存在生物體內(nèi)，本研究結(jié)果與其一致。

表2 厚殼貽貝的Cr形態(tài)變化及轉(zhuǎn)化率Table 2 Morphological change and conversion rate of Cr in M.coruscus %

圖5 厚殼貽貝中Cr（Ⅲ）在總Cr中的占比Fig.5 Ratio of Cr(Ⅲ)to total Cr in M.coruscus

根據(jù)上述結(jié)果，結(jié)合Cr 形態(tài)特征和轉(zhuǎn)化率，可得到Cr（Ⅵ）在厚殼貽貝體內(nèi)的轉(zhuǎn)化規(guī)律：實(shí)驗(yàn)初期，暴露液中Cr（Ⅵ）遷移量大，厚殼貽貝富集轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)，其體內(nèi)Cr（Ⅵ）蓄積量迅速增加，但都被還原成Cr（Ⅲ）和有機(jī)Cr，使得厚殼貽貝體內(nèi)的總Cr、Cr（Ⅲ）和有機(jī)Cr 含量均顯著提升，其中有機(jī)Cr 為主要存在形態(tài)，約占總Cr 的77%。實(shí)驗(yàn)中期，隨著厚殼貽貝鉻Cr含量的增加及其富集能力的減弱，總Cr、Cr（Ⅲ）和有機(jī)Cr 的轉(zhuǎn)化率逐漸降低，其含量增速也逐漸放緩。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，厚殼貽貝趨于富集平衡狀態(tài)，導(dǎo)致其Cr（Ⅵ）蓄積量降低，Cr 含量增長接近停滯，總Cr、Cr（Ⅲ）和有機(jī)Cr的轉(zhuǎn)化率大幅下降，且有機(jī)Cr 部分轉(zhuǎn)化為Cr（Ⅲ），使Cr（Ⅲ）占比提升至29.9%。

3 結(jié)論

本研究以厚殼貽貝為研究對象，采用Cr（Ⅵ）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為染毒試劑，通過比較同一形態(tài)Cr的含量變化，監(jiān)測不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)Cr的形態(tài)變化，確認(rèn)了Cr在厚殼貽貝中的形態(tài)特征，并探討了Cr（Ⅵ）在厚殼貽貝中的轉(zhuǎn)化規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Cr在厚殼貽貝體內(nèi)主要以Cr（Ⅲ）和有機(jī)Cr 形態(tài)存在，其中Cr（Ⅲ）占21.0%～29.9%，有機(jī)Cr 占70.1%～79.0%；隨著時(shí)間的推移，有機(jī)Cr部分轉(zhuǎn)化為Cr（Ⅲ），使Cr（Ⅲ）比例不斷升高；Cr（Ⅵ）無法穩(wěn)定存在于厚殼貽貝體內(nèi)。