李倬，陳朗，姜濤，劉麗霞，張麗，王瑞，李耀東

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州730030）

牦牛（Bos mutus）是一種古老而原始的物種，家養(yǎng)牦牛由野生牦牛經(jīng)過長期的自然進(jìn)化和人工馴化而來，屬于?？疲˙ovidae）牛亞科（Bovinae）牛屬（Bos）牦牛亞屬（Poephagus），是唯一能在青藏高原的高寒牧區(qū)繁衍的牛亞科動物，具有耐寒、耐粗、耐勞、耐缺氧等特點[1-2]。

主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex,MHC）是一組緊密連鎖的基因簇，在對病原體抗原的免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，具有高度的遺傳多態(tài)性，與哺乳動物對許多傳染病和代謝疾病的抗性或易感性有關(guān)[3-4]。牛MHC被稱為牛白細(xì)胞抗原（bovine lymphocyte antigen,BoLA），位于牛的第23 號常染色體上[5]，結(jié)構(gòu)與其他哺乳動物的MHC相似，包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類基因，其中BoLAⅡ類基因通過向T細(xì)胞呈遞連接在肽結(jié)合槽上的加工肽抗原而發(fā)揮作用[6]。BoLA-DQA基因位于BoLAⅡ類基因的α亞區(qū)，編碼α1功能區(qū)，是BoLA抗原分子的重要組成部分，由緊密相連的重復(fù)基因簇組成，包含5個基因座，其中DQA1、DQA2和DQA3基因是高度多態(tài)的[7-9]。牛DQA基因具有高度多態(tài)性，尤其是在抗原相關(guān)的結(jié)合區(qū)內(nèi)[10]，迄今為止，IPD數(shù)據(jù)庫（https://www.ebi.ac.uk/ipd/mhc/）中牛的DQA等位基因有65個。牛DQA基因與疾病的易感性和抗性相關(guān)[11-13]，也可作為乳腺免疫應(yīng)答和牛結(jié)核病感染相關(guān)的候選基因[14-15]。

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）是在基因組水平上由單個核苷酸的變異（堿基的缺失、插入、轉(zhuǎn)換和顛換等）所引起的DNA序列多態(tài)性，是最具有潛力的第3代分子標(biāo)記方法，而直接測序法是最直接、最準(zhǔn)確的檢測SNP位點的方法[16]。本研究以青海大通牦牛為研究對象，采用基因組DNA混合池擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序的方法，對DQA2基因的SNP進(jìn)行分析，并對其mRNA和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測和分析，為牦牛MHC基因的深入研究提供基礎(chǔ)資料，也為MHC基因的致病機(jī)制和免疫機(jī)制探究提供有利條件，還為牦牛抗病分子標(biāo)記篩選提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從青海省大通種牛場購買牦牛55頭，采集其尾靜脈血液各10 mL，并立即于-20 ℃條件下冷凍保存，帶回實驗室。采用傳統(tǒng)的酚-三氯甲烷（氯仿）抽提法提取牦牛血液基因組DNA，利用UV1800 紫外分光光度計（蘇州島津儀器有限公司）和0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的濃度和純度。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中普通牛DQA2基因（登錄號：XM_024983852）序列，利用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）在線軟件Primer-BLAST 設(shè)計引物，引物信息見表1，分段擴(kuò)增獲得牦牛DQA2基因全部外顯子和部分內(nèi)含子序列，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 DQA2基因引物信息Table 1 Primer information of DQA2 gene

1.3 基因組DNA 混合池的構(gòu)建和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增

將每個基因組DNA質(zhì)量濃度調(diào)整至100 ng/μL，等量混合后構(gòu)建DNA 混合池，以混合池DNA 為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（20μL）：混合DNA 1 μL，2×PowerTaq反應(yīng)聚合酶（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）11 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，滅菌超純水7.2 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火（退火溫度見表1）30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.4 DQA2 基因擴(kuò)增序列測定與分析

選取擴(kuò)增效果良好的牦牛DQA2基因4段引物的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序，利用Editseq軟件對測序峰圖進(jìn)行檢測后篩選SNP 位點，并利用MEGA 6.0 軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列比對。

1.5 等位基因頻率估算

利用軟件MWSnap的標(biāo)尺工具測量DQA2基因SNP 位點峰圖的峰高，對各等位基因頻率進(jìn)行估算，估算公式為fi=hi/(ha+hb)。其中：i=a/b，fi表示SNP位點中a/b等位基因的頻率，hi表示SNP位點中a/b等位基因的峰高，ha和hb分別表示測序峰圖上等位基因a和b的峰高。

1.6 mRNA 和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用RNAfold 網(wǎng)頁服務(wù)器（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）和NPS（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在線軟件預(yù)測牦牛DQA2基因mRNA和編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛DQA2 基因擴(kuò)增結(jié)果

利用1%瓊脂糖電泳檢測牦牛DQA2基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果（圖1）顯示，DQA2基因各擴(kuò)增片段大小均與預(yù)期相符，且條帶清晰，特異性良好。

2.2 牦牛DQA2 基因SNP 位點篩選和等位基因頻率估算

序列測定結(jié)果表明，牦牛DQA2基因共有14個SNP 位點，測序峰如圖2 所示。牦牛DQA2基因的SNP 位點分別位于內(nèi)含子1（g.135T＞C）、外顯子2（g.4296A＞G 和g.4374A＞C）、外顯子3（g.5103G＞A、g.5127C＞A、g.5137T＞C、g.5141G＞A和g.5187C＞T）和外顯子4（g.5527A＞G、g.5576G＞C、g.5602C＞T、g.5606G＞A、g.5659C＞T 和g.5666C＞A）上，其中外顯子2上的2個SNP、外顯子3上的4個SNP和外顯子4上的3個SNP是錯義突變，共導(dǎo)致DQA2基因的9個氨基酸發(fā)生改變，具體突變信息見表2。對各SNP位點突變前后的等位基因頻率進(jìn)行估算，結(jié)果表明：僅有外顯子3上的g.5137T＞C位點突變前后等位基因頻率相同，其余SNP位點突變前頻率均大于突變后（表2）。

圖1 牦牛DQA2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplification of DQA2 gene in yak

2.3 牦牛DQA2 基因mRNA 二級結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用RNAfold和NPS在線軟件預(yù)測牦牛DQA2基因各SNP 突變前后的mRNA 二級結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果分別見圖3 和表3：位點g.4374A＞C、g.5527A＞G、g.5576G＞C和g.5606G＞A的mRNA二級結(jié)構(gòu)與突變前差異較大；8 個SNP 位點（g.4296A＞G、g.4374A＞C、g.5127C＞A、g.5187C＞T、g.5527A＞G、g.5576G＞C、g.5602C＞T和g.5659C＞T）的mRNA二級結(jié)構(gòu)自由能有所降低，這些SNP位點均增大了牦牛DQA2基因的穩(wěn)定性；而4 個SNP 位點（g.5103G＞A、g.5137T＞C、g.5141G＞A 和g.5606G＞A）的mRNA二級結(jié)構(gòu)自由能有所增大，表明這4個位點均降低了牦牛DQA2基因的穩(wěn)定性；僅有1 個SNP 位點（g.5666C＞A）的mRNA 二級結(jié)構(gòu)自由能與突變前相同，說明該位點對牦牛DQA2基因的穩(wěn)定性沒有影響。所有錯義突變均使得DQA2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，突變前后二級結(jié)構(gòu)各組分中無規(guī)則卷曲所占比例最高，其次為延伸鏈，β-轉(zhuǎn)角所占比例最低。

3 討論

圖2 牦牛DQA2基因SNP位點測序峰圖Fig.2 Sequencing peak diagrams of SNP sites for DQA2 gene in yak

表2 牦牛DQA2基因SNP位點突變信息和等位基因頻率Table 2 Mutation information and allele frequency of SNP sites for DQA2 gene in yak

MHC在哺乳動物免疫系統(tǒng)的發(fā)展中起著核心作用，其中位于Ⅱ類區(qū)域的DQ 分子的主要作用是引發(fā)CD4＋T細(xì)胞反應(yīng)[17]。BoLA單倍型具有重復(fù)的DQ基因，在病毒感染過程中，BoLA-DQ 分子呈現(xiàn)不同的病原體表位[18]，且T細(xì)胞可以在DQ分子中識別Ag[19]。牛DQA2是BoLA的成員，是疾病的易感性和抗性遺傳標(biāo)記中的一個重要候選基因，研究其多態(tài)性對牛的抗病分子選育具有重要的意義。近年來，已有大量關(guān)于牛DQA2基因多態(tài)性和序列變異的研究。TRAUL 等發(fā)現(xiàn)野牛的3 個DQA2等位基因與普通牛序列無差異[20]。高樹新在荷斯坦牛、西門塔爾牛和三河牛的DQA2基因外顯子2上檢測到20個多態(tài)位點[21]。NIRANJAN等發(fā)現(xiàn)水牛DQA2基因的α2 區(qū)域與普通牛差異較大[22]。HOU 等在奶牛DQA2基因上檢測到13個新的SNP位點，其中有4個SNP導(dǎo)致蛋白質(zhì)中氨基酸發(fā)生改變[23]。孫菲菲等在渤海黑牛DQA2基因外顯子區(qū)域檢測到3 個SNP 位點[24]。UGBO 等發(fā)現(xiàn)，牛DQA2基因上的77個氨基酸突變對其蛋白質(zhì)功能有負(fù)面影響[25]。GE等發(fā)現(xiàn)，中甸牦牛DQA2基因的α1區(qū)域具有高度多態(tài)性[26]。XI 等研究表明，中國牦牛DQA2序列僅有α2 區(qū)域與普通牛有差異，其他區(qū)域均無差異[27]。MEMON 等克隆獲得大額牛的DQA2基因序列，比對發(fā)現(xiàn)該基因與其他動物的DQA基因相似度較高，而與其他牛DQA的等位基因差異較大[28]。本研究在牦牛DQA2基因外顯子區(qū)域共檢測到13 個SNP位點，這些研究結(jié)果均表明牛DQA2基因具有較高的多態(tài)性。

圖3 牦牛DQA2基因SNP突變前后mRNA二級結(jié)構(gòu)Fig.3 Secondary structure of mRNA of SNP sites before and after mutation in yak DQA2 gene

mRNA 二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)表達(dá)量之間呈顯著正相關(guān)，對翻譯蛋白質(zhì)的效率有很大影響，且對基因功能具有調(diào)控作用[29]。牦牛DQA2基因上的8個SNP位點增大了mRNA二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，而4個SNP位點降低了mRNA二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，這些改變可能對DQA2蛋白質(zhì)的翻譯和基因的功能有影響?；蛲怙@子序列中的核苷酸錯義突變能改變編碼的氨基酸，從而改變蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步使蛋白質(zhì)的功能發(fā)生改變。牦牛DQA2上的氨基酸突變對其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)造成了一定的影響，這有可能會改變該基因在牦牛免疫應(yīng)答中的作用。另外，牦牛DQA2基因上的SNP位點位于具有抗原結(jié)合位點和編碼α1、α2 功能區(qū)的外顯子2、3 區(qū)域，以及包含跨膜區(qū)的外顯子4 區(qū)域，發(fā)生在這些區(qū)域的氨基酸改變可能會對機(jī)體細(xì)胞的抗原呈遞和跨膜運輸產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響生物體對疾病的抗性。因此，對牦牛DQA2基因的SNP多態(tài)性進(jìn)行研究可為牦牛疾病相關(guān)分子標(biāo)記的篩選提供理論基礎(chǔ)。

表3 牦牛DQA2基因SNP突變前后mRNA二級結(jié)構(gòu)自由能和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)Table 3 Free energy of secondary structures of mRNA and secondary structure of protein of SNP sites before and after mutation in yak DQA2 gene