遲 媛 弓 敏 馬艷秋 遲玉杰

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院， 哈爾濱 150030； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

0 引言

食品原材料的清洗殺菌是食品加工中必不可少的環(huán)節(jié)，采用有效的殺菌方法可殺滅腐敗菌和致病菌，以保證食品質(zhì)量安全。存在于食品中的微生物種類繁雜，其中大腸埃希氏菌是食品中重要的腐生菌，能發(fā)酵多種糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，造成食品腐敗變質(zhì)，而且大腸桿菌產(chǎn)生的腸毒素、外毒素、志賀毒素、黏附素等致病物質(zhì)會(huì)增加人體患病風(fēng)險(xiǎn)[1-2]；芽孢桿菌屬已被證實(shí)為多種食品中常見的食品腐敗菌，其中枯草芽孢桿菌可分解食品中蛋白質(zhì)、糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，造成食品的風(fēng)味和口感產(chǎn)生不期望的變化，從而引起食品的腐敗變質(zhì)[3]；考克氏菌廣泛存在于海洋食品、腐乳、肉類等蛋白質(zhì)含量高的產(chǎn)品中，同樣極易造成食品的變質(zhì)[4]。因此，對(duì)食品中典型腐敗菌種進(jìn)行有效的殺滅是保證產(chǎn)品質(zhì)量安全的關(guān)鍵所在。

化學(xué)殺菌劑殺菌操作簡(jiǎn)便、成本低，目前國(guó)外食品加工企業(yè)一般采用次氯酸鈉殺菌劑對(duì)蛋源進(jìn)行殺菌處理，但是其單獨(dú)作用于菌體細(xì)胞時(shí)，滲透性較差，對(duì)菌體僅造成亞致死損傷，殺菌效果差[5]。超聲作為一種新型的非熱殺菌技術(shù)被廣泛應(yīng)用，在食品加工中一般以液體為介質(zhì)，作用過程產(chǎn)生空化效應(yīng)，破壞菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使微生物細(xì)胞處于亞損傷狀態(tài)，但是單獨(dú)作用時(shí)低強(qiáng)度下殺菌效果不明顯，需要大幅度增加超聲強(qiáng)度來提高殺菌效果，易造成能源的浪費(fèi)。因此，將超聲與化學(xué)殺菌劑聯(lián)合作用會(huì)大幅度提高殺菌效果[6-7]。國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)超聲協(xié)同化學(xué)殺菌劑產(chǎn)生的強(qiáng)化殺菌效應(yīng)進(jìn)行了研究，文獻(xiàn)[8]研究發(fā)現(xiàn)，超聲和臭氧共同作用對(duì)單增李斯特菌的殺菌效果比單一殺菌技術(shù)提升約30%；文獻(xiàn)[9]研究發(fā)現(xiàn)，萬古霉素和超聲協(xié)同作用會(huì)顯著提高對(duì)葡萄球菌的殺菌效果；文獻(xiàn)[10]研究發(fā)現(xiàn)，超聲會(huì)顯著提高戊二醛對(duì)孢子懸浮液的殺滅效果；文獻(xiàn)[11]研究發(fā)現(xiàn)，超聲結(jié)合牛至精油對(duì)生菜中大腸桿菌O157:H7的殺菌比單一牛至精油殺菌效果提高了26%。

微生物殺菌效果的動(dòng)力學(xué)模型是研究殺菌技術(shù)的關(guān)鍵理論之一，對(duì)其實(shí)際應(yīng)用具有理論指導(dǎo)意義[12-13]。目前，關(guān)于超聲協(xié)同化學(xué)殺菌劑的研究多數(shù)集中在證明二者之間的協(xié)同效應(yīng)，對(duì)其協(xié)同殺菌動(dòng)力學(xué)過程缺乏詳細(xì)研究。本文以食品中常見的3株典型菌種為模型菌，研究超聲協(xié)同次氯酸鈉對(duì)模型菌的殺菌效果，采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)、Weibull、Logistic模型擬合殺菌動(dòng)力學(xué)曲線，并對(duì)模型擬合度進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，利用生物電鏡觀察菌種微觀結(jié)構(gòu)破壞情況，并測(cè)定殺菌處理后3種指示菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的損失，以期為微生物殺菌提供重要的方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

指示菌：大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、考克氏菌(K.marina)，為實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

培養(yǎng)基及化學(xué)試劑：伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，青島海博生物科技有限公司；次氯酸鈉(NaClO)溶液，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。中和試劑：5 g/L的硫代硫酸鈉溶液，天津市天力化學(xué)試劑有限公司。戊二醛固定液，北京華越洋生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ3200DE型數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；核酸蛋白分析儀，北京維欣儀奧科技發(fā)展有限公司。S-3400 N(HITACHI)型掃描電鏡，日本Giko公司。

1.3 方法

1.3.1菌懸液的制備

將斜面保存的E.coli、B.subtilis、K.marina取出，并分別加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%的滅菌生理鹽水，將菌苔充分洗滌并吸取1 mL菌懸液到帶有玻璃珠的三角瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%的無菌生理鹽水進(jìn)行稀釋并振蕩30 min，將菌苔打碎，用核酸蛋白分析儀測(cè)定細(xì)胞濃度，調(diào)整菌懸液菌體濃度至107cfu/mL。

1.3.2懸液定量殺菌試驗(yàn)

參照GB 15981—1995中懸液定量的方法評(píng)價(jià)化學(xué)消毒劑的殺滅效果，用滅菌蒸餾水將10 g/L的NaClO溶液稀釋成質(zhì)量濃度為50、100、200 mg/L，吸取4.5 mL的NaClO溶液于滅菌試管中，加入0.5 mL菌懸液，混勻，并超聲處理，設(shè)置超聲功率60、120、150 W，超聲時(shí)間60、90、120、150、180 s。殺菌處理后，同時(shí)取0.5 mL菌液加入到4.5 mL的中和試劑內(nèi)終止消毒劑繼續(xù)殺菌，中和10 min，采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)不同殺菌條件下的殘留活菌數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。利用殺菌處理前后樣品微生物殘存率對(duì)數(shù)值表示超聲協(xié)同NaClO致死效果(致死率C為負(fù)數(shù)，其絕對(duì)值越大表示致死效果越強(qiáng))，空白組為不經(jīng)過超聲處理(即單獨(dú)次氯酸鈉殺菌處理)，試驗(yàn)重復(fù)3次，致死率計(jì)算公式為

(1)

式中N0——超聲輔助次氯酸鈉殺菌前細(xì)菌菌落菌體濃度，cfu/mL

N——超聲輔助次氯酸鈉殺菌后細(xì)菌菌落菌體濃度，cfu/mL

1.3.3微生物殺菌動(dòng)力學(xué)模型

微生物殺滅效果的動(dòng)力學(xué)模型是研究殺菌技術(shù)的關(guān)鍵理論，對(duì)其實(shí)際應(yīng)用具有重要的理論指導(dǎo)意義。本研究選用一級(jí)動(dòng)力學(xué)、Weibull、Logistic模型對(duì)超聲協(xié)同次氯酸鈉對(duì)3種典型菌株的殺菌動(dòng)力學(xué)過程進(jìn)行擬合并對(duì)3種模型進(jìn)行比較分析。

(1)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型

一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的使用是假設(shè)微生物具有相同的抗逆性，隨時(shí)間的變化微生物下降的對(duì)數(shù)值呈現(xiàn)線性變化[14]，模型公式為

(2)

式中t——?dú)⒕幚頃r(shí)間，s

Dp——指數(shù)遞減時(shí)間，即某處理?xiàng)l件下每殺死90%的活菌數(shù)所需時(shí)間，s

(2)Weibull模型

Weibull模型用于描述各種線性和凹凸型曲線的非線性模型[15-16]，該模型假設(shè)菌體對(duì)殺菌強(qiáng)度的抗性具有差別且符合Weibull模型分布，文獻(xiàn)[17]研究發(fā)現(xiàn)Weibull模型能夠較好地?cái)M合微酸性電解水與苯扎氯銨聯(lián)合溫和熱處理對(duì)蠟樣芽孢桿菌的殺菌動(dòng)力學(xué)過程，本研究在Hussain基礎(chǔ)上做了簡(jiǎn)化處理，公式為

(3)

式中a——規(guī)模參數(shù)，表示一定條件下降低一個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)細(xì)菌所需時(shí)間

b——形狀因子，當(dāng)b<1時(shí)曲線向上凹；b>1時(shí)曲線向下凹；b=1時(shí)為一條直線

(3)Logistic 模型

Logistic模型假設(shè)菌體對(duì)殺菌強(qiáng)度的抗性具有差別，文獻(xiàn)[18]發(fā)現(xiàn)該模型能夠很好地?cái)M合微波對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌動(dòng)力學(xué)過程，本研究在文獻(xiàn)[18]基礎(chǔ)上做了簡(jiǎn)化處理，公式為

(4)

式中p——最低的殘存細(xì)菌菌落菌體濃度對(duì)數(shù)值

q、m——曲線方程的參數(shù)

(4)模型評(píng)價(jià)

Af、Bf、R2和均方根誤差4個(gè)參數(shù)通常作為一種定量的方法來評(píng)價(jià)模型[19]，Af是精確因子，表示預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值偏離程度。Bf是偏差因子，Bf>1表示模型預(yù)測(cè)值比實(shí)測(cè)值高；Bf<1表示模型預(yù)測(cè)值比實(shí)測(cè)值低；當(dāng)Bf越接近1，模型擬合度越高；均方根誤差和R2均表示模型的精確度、可靠度，當(dāng)R2越接近于1，均方根誤差越小，模型擬合度越好。

1.3.4掃描電鏡觀察

將3株菌種的單菌落分別接入液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h，取出。將含有菌株的液體培養(yǎng)基加到已滅菌的10 mL離心管中，8 000 r/min離心3 min，棄掉上清液，加入質(zhì)量濃度為200 mg/L的次氯酸鈉溶液5 mL，同時(shí)置于超聲體系，超聲強(qiáng)度150 W，時(shí)間120 s。加入等量中和劑終止殺菌，離心10 min，棄掉上清液，加入無菌生理鹽水進(jìn)行洗脫2次，轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管內(nèi)，得到滅菌處理過后的菌泥，加入戊二醛固定液于4℃條件下固定2 h。用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次10 min；然后采用50%、70%、90%、100%的乙醇進(jìn)行逐級(jí)脫水各1次，每次10 min；采用1∶1的100%乙醇/叔丁醇進(jìn)行置換10 min；臨界點(diǎn)干燥、噴金，電鏡下觀察、拍照，獲得電鏡結(jié)果圖，未經(jīng)殺菌處理的對(duì)照樣本作同樣處理。

1.3.5細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)損失的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[20]的方法對(duì)殺菌前后3種菌株菌懸液中可溶性蛋白及還原糖含量進(jìn)行測(cè)定，取經(jīng)過超聲處理、超聲聯(lián)合次氯酸鈉、單獨(dú)次氯酸鈉殺菌處理后的3種菌株的菌懸液，各吸取2 mL菌液至乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，每隔1 h取出，在7 000 r/min下離心10 min，取上層清液采用直接滴定法測(cè)定殺菌前后菌懸液中的還原糖含量。采用牛血清蛋白濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定可溶性蛋白含量，同樣取殺菌后的菌懸液樣品2 mL，在-20℃冰箱中冷凍12 h，加入0.01 mol/L Tris-HCl (pH值8.0)緩沖液，準(zhǔn)確吸取0.1 mL各處理樣品于10 mL具塞試管中，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G 250染色劑，混合后放置2 min，并于波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得相應(yīng)樣品的蛋白含量。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及分析

應(yīng)用SPSS Statistics 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Origin軟件作圖，使用Curve Expert進(jìn)行模型擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲協(xié)同次氯酸鈉溶液的殺菌效果

次氯酸鈉具有強(qiáng)氧化性，屬于一種安全高效消毒液，被廣泛應(yīng)用于食品原料的清洗殺菌過程中。研究發(fā)現(xiàn)次氯酸鈉溶于水后水解形成次氯酸，次氯酸能夠穿透菌體細(xì)胞壁并進(jìn)一步破壞蛋白質(zhì)及酶系統(tǒng)，影響細(xì)胞生命活動(dòng)從而殺死微生物[21]。本研究選用60、120、150 W超聲與50、100、200 mg/L的次氯酸鈉聯(lián)合作用，研究超聲協(xié)同次氯酸鈉溶液對(duì)E.coli、K.marina、B.subtilis殺滅效果，殺菌動(dòng)態(tài)曲線如圖1所示。

圖1 超聲協(xié)同次氯酸鈉對(duì)3種指示菌的殺菌效果Fig.1 Effect of different ultrasonic treatments assisted sodium hypochlorite on inactivation of indicator bacteria

由圖1可知，E.coli、K.marina、B.subtilis的致死量隨NaClO質(zhì)量濃度的增加而不斷增加，且不同質(zhì)量濃度的NaClO對(duì)3種指示菌的致死量具有顯著差異(P<0.05)。當(dāng)NaClO質(zhì)量濃度達(dá)200 mg/L，單獨(dú)殺菌180 s后，菌懸液中E.coli、K.marina、B.subtilis致死率為(-3.83±0.134)、(-3.79±0.122)、(-2.38±0.136)個(gè)對(duì)數(shù)值，由此可見E.coli對(duì)NaClO的抗性較低，K.marina次之，而B.subtilis對(duì)NaClO具有較強(qiáng)的抗性，文獻(xiàn)[22]也研究了NaClO對(duì)E.coli和B.cereus的殺菌效果，研究結(jié)果得出當(dāng)NaClO質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)對(duì)E.coli的損壞程度較大，而對(duì)B.cereus的殺菌較弱，與本研究結(jié)果相一致，這可能是由于具有芽孢結(jié)構(gòu)的菌株對(duì)NaClO消毒液具有較強(qiáng)的抗性，加之菌體外層具有一層生物膜，NaClO難以滲透進(jìn)入菌體內(nèi)部，導(dǎo)致NaClO對(duì)芽孢桿菌的殺滅能力較弱[23-24]。同樣，文獻(xiàn)[25]研究了氯、二氧化氯和過氧乙酸對(duì)B.cereus孢子結(jié)構(gòu)的殺菌效果，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)3種化學(xué)殺菌劑具較強(qiáng)的抗性，需要濕熱條件對(duì)其進(jìn)行聯(lián)合殺菌，才能達(dá)到良好的殺菌效果。

在NaClO質(zhì)量濃度相同的情況下，不同功率的超聲協(xié)同NaClO殺菌，隨處理時(shí)間的增加，對(duì)E.coli、K.marina、B.subtilis的致死量逐漸增大。當(dāng)NaClO質(zhì)量濃度為200 mg/L，超聲150 W處理180 s時(shí)，對(duì)E.coli的致死率絕對(duì)值為(4.54±0.164)個(gè)對(duì)數(shù)值，對(duì)K.marina和B.subtilis的致死率絕對(duì)值分別為(4.28±0.123)、(3.97±0.134)個(gè)對(duì)數(shù)值，較相同NaClO濃度單獨(dú)處理相同時(shí)間相比致死量顯著提高，提高了13%～67%。此外，處理時(shí)間相同、NaClO質(zhì)量濃度相同的情況下，對(duì)3種菌的致死量隨超聲強(qiáng)度的增強(qiáng)而增加，且高強(qiáng)度的超聲對(duì)低強(qiáng)度的超聲的協(xié)同殺菌效果顯著增加(P<0.05)。當(dāng)NaClO質(zhì)量濃度為50、100、200 mg/L，超聲功率60 W，處理時(shí)間60～180 s，對(duì)比未經(jīng)過超聲處理的殺菌量不存在顯著差異(P>0.05)；當(dāng)超聲功率為150 W時(shí)，對(duì)比超聲功率60 W，相同時(shí)間對(duì)3種指示菌的致死效果顯著增加。相似地，文獻(xiàn)[26]研究了超聲波輔助二氧化氯對(duì)雞蛋表面大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的殺滅效果，研究得出59 kHz超聲協(xié)同50 mg/L二氧化氯，處理5 min，對(duì)3個(gè)菌種的殺菌量達(dá)4個(gè)對(duì)數(shù)值，與本研究得出相同的規(guī)律，即超聲波會(huì)顯著提高殺菌劑的殺菌效果，可能是協(xié)同作用時(shí)超聲波優(yōu)先作用于菌體生物被膜結(jié)構(gòu)，通過強(qiáng)烈的空化效應(yīng)破壞生物被膜三維結(jié)構(gòu)使內(nèi)部菌體暴露，導(dǎo)致細(xì)菌通透性增加，菌體蛋白質(zhì)及DNA滲漏，代謝酶活性降低，殺菌劑便可直接作用于裸露的菌體，強(qiáng)化殺菌效應(yīng)[27-29]。文獻(xiàn)[30]做了前期工作，采用160 W的超聲波和5～62℃的熱處理聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)比二者單獨(dú)使用具有更好的殺菌效果，且處理時(shí)間短，耗能少。文獻(xiàn)[31]研究同樣得出超聲在微生物殺菌過程中與其他滅菌技術(shù)聯(lián)合效果更好，如熱處理，氯化作用，加壓條件下等。

2.2 超聲協(xié)同次氯酸鈉溶液殺菌效果動(dòng)力學(xué)分析

運(yùn)用一級(jí)動(dòng)力學(xué)、Weibull、Logistic模型對(duì)超聲協(xié)同NaClO對(duì)E.coli、K.marina、B.subtilis的滅活動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)行擬合，其擬合模型參數(shù)如表1～3所示。

表1 3種模型擬合超聲協(xié)同次氯酸鈉對(duì)E.coli致死效果的動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)Tab.1 Kinetic curve parameters of three models fitting lethal effect of ultrasound combined with sodium hypochlorite on E. coli

表2 3種模型擬合超聲協(xié)同次氯酸鈉對(duì)K.marina致死效果的動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)Tab.2 Kinetic curve parameters of three models fitting lethal effect of ultrasound combined with sodium hypochlorite on K. marina

表3 3種模型擬合超聲協(xié)同次氯酸鈉對(duì)B.subtilis致死效果的動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)Tab.3 Kinetic curve parameters of three models fitting lethal effect of ultrasound combined with sodium hypochlorite on B. subtilis

決定系數(shù)一般用來對(duì)模型擬合程度做一個(gè)總體評(píng)價(jià)[32]，由表1～3可知，采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合獲得不同殺菌處理?xiàng)l件下的直線，其部分決定系數(shù)R2小于0.95，尤其當(dāng)NaClO質(zhì)量濃度及超聲強(qiáng)度增大后線性擬合效果較差。而利用Weibull模型擬合的動(dòng)力學(xué)曲線，其R2均大于0.95。Logistic模型對(duì)高強(qiáng)度的超聲體系協(xié)同NaClO的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)行擬合，R2在0.90～0.95之間。一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型認(rèn)為微生物殘留菌數(shù)量與時(shí)間呈現(xiàn)線性關(guān)系[33]，而本研究發(fā)現(xiàn)超聲協(xié)同NaClO殺菌更符合非線性模型，在超聲功率及NaClO質(zhì)量濃度較低的情況下的殺菌動(dòng)力學(xué)過程中Weibull模型和Logistic模型均可以很好地?cái)M合動(dòng)力學(xué)曲線，隨超聲功率及NaClO質(zhì)量濃度的增加，Weibull模型更加符合殺菌過程。因此，超聲協(xié)同NaClO對(duì)3種典型菌株的殺菌過程更加符合Weibull模型。

2.3 模型擬合度評(píng)價(jià)

為了進(jìn)一步比較Weibull模型和Logistic模型對(duì)超聲協(xié)同NaClO殺菌過程的擬合度，進(jìn)一步比較分析了模型評(píng)價(jià)參數(shù)Af、Bf、均方根誤差和R2。由表4可知，Weibull模型的Af和均方根誤差均低于Logistic模型，說明Weibull模型預(yù)測(cè)的平均精確度較高，離散程度較低，同時(shí)Weibull模型的Bf和R2較Logistic模型更接近于1。因此，Weibull模型從整體上能夠很好地?cái)M合超聲協(xié)同NaClO的殺菌動(dòng)力學(xué)過程。

表4 數(shù)學(xué)模型評(píng)價(jià)參數(shù)的比較Tab.4 Comparison of evaluation indices of mathematics model

通過比較Weibull模型和Logistic模型回歸方程所得預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的接近程度，以實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)為橫坐標(biāo)，模型預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)為縱坐標(biāo)作圖，利用線性擬合得到的相關(guān)性方程及決定系數(shù)R2來判斷預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的差異。由圖2可知，Weibull模型和Logistic模型對(duì)超聲協(xié)同NaClO對(duì)3種典型菌株致死率的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有較好的相關(guān)性。線性相關(guān)方程的斜率及截距越接近于0，R2越接近于1，表明模型擬合效果越好。Weibull模型對(duì)E.coli、K.matina、B.subtilis殺菌擬合得到的方程分別為y=1.002 52x+0.007 36、y=0.994 97x-0.021 13、y=0.990 0x-0.003 6，對(duì)應(yīng)的決定系數(shù)分別為0.983 8、0.985 8、0.985 3；Logistic模型擬合得到的方程分別為y=0.996 99x+0.046 92、y=0.985 78x-0.007 16、y=1.003 1x+0.015 2，對(duì)應(yīng)的決定系數(shù)分別為0.965 3、0.963 6、0.964 4。因此，Weibull模型較Logistic模型能夠較好地模擬超聲協(xié)同NaClO殺菌的動(dòng)力學(xué)過程。

圖2 超聲協(xié)同次氯酸鈉溶液殺菌效果預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的相關(guān)性Fig.2 Correlation between observed and predicted values for inactivation effects of sodium hypochlorite combined with ultrasonic treatment

2.4 Weibull模型參數(shù)與超聲強(qiáng)度的關(guān)系分析

通過比較得出Weibull模型較線性模型和Logistic模型能夠很好地?cái)M合超聲協(xié)同次氯酸鈉的殺菌動(dòng)力學(xué)過程。參數(shù)a可以反映殺菌的效果[34]，由圖3和表5分析得出，參數(shù)a與超聲強(qiáng)度具有很好的負(fù)相關(guān)，R2均不小于0.917。模型公式中形狀參數(shù)b與超聲強(qiáng)度呈現(xiàn)較好的負(fù)相關(guān)，R2均不小于0.852，b值隨超聲強(qiáng)度的增加逐漸減小，且較高強(qiáng)度的超聲協(xié)同作用下參數(shù)b均小于1，參數(shù)b反映的是曲線形狀，說明曲線拖尾明顯，在同一超聲強(qiáng)度作用下，延長(zhǎng)殺菌時(shí)間并不一定能夠顯著提高殺菌效果，而且由相關(guān)研究同樣證明超聲強(qiáng)度增加到一定程度后，其空化效應(yīng)會(huì)減弱，殺菌率也會(huì)趨于平緩，與其他相關(guān)研究結(jié)果一致[35]。

表5 相關(guān)性方程Tab.5 Correlation equation

圖3 Weibull模型參數(shù)a和b與超聲強(qiáng)度的關(guān)系Fig.3 Correlation between Weibull model parameter a or b and ultrasonic intensity

2.5 超聲協(xié)同次氯酸鈉的殺菌機(jī)理分析

2.5.1掃描電鏡觀察結(jié)果

為了進(jìn)一步探究超聲協(xié)同NaClO對(duì)3種典型菌株細(xì)胞菌體破壞情況，本研究利用生物掃描電鏡對(duì)超聲協(xié)同NaClO及單獨(dú)NaClO處理前后E.coli、K.matina、B.subtilis的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖4所示。

由單獨(dú)NaClO溶液及超聲協(xié)同NaClO溶液殺菌處理前后3種指示菌掃描電鏡結(jié)果(圖4，放大倍數(shù)2 000～3 500)，可以看出3種菌株殺菌前后菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。未經(jīng)殺菌處理的E.coli(圖4a)呈現(xiàn)規(guī)則的長(zhǎng)桿狀，菌體胞壁周圍完整，輪廓清晰，胞質(zhì)均勻；K.marina(圖4d)表現(xiàn)為球形，胞壁光滑完整，輪廓清晰，胞質(zhì)均勻；B.subtilis為規(guī)則的梭形，胞壁光滑完整，且細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間無間隙，胞質(zhì)均勻飽滿。

圖4 超聲協(xié)同次氯酸鈉對(duì)指示菌處理前后的掃描電鏡圖Fig.4 SEM photos of indicator bacteria before and after treatment with ultrasound combined with sodium hypochlorite

由圖4b、4e、4h可知，經(jīng)過NaClO單獨(dú)處理后3種指示菌菌體塌陷，原生質(zhì)溶出，其中E.coli菌體中部凹陷嚴(yán)重且存在部分細(xì)胞碎片，K.marina細(xì)胞壁裂解，細(xì)胞皺縮，B.subtilis表現(xiàn)嚴(yán)重的皺縮現(xiàn)象，細(xì)胞質(zhì)損失嚴(yán)重。而超聲協(xié)同NaClO處理后，3種指示菌菌體破壞大，其中E.coli形態(tài)變化最為嚴(yán)重(圖4c)，多數(shù)菌體已呈現(xiàn)碎片狀態(tài)，K.marina細(xì)胞壁破裂崩解，胞質(zhì)溶出，B.subtilis菌體表面起皺，胞質(zhì)溶出并向外滲出，細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重皺縮且殘存少部分細(xì)胞碎片。關(guān)于菌體殺菌機(jī)理目前多數(shù)研究學(xué)者認(rèn)為細(xì)菌的死亡是通過破壞菌體細(xì)胞壁使菌株內(nèi)部結(jié)構(gòu)暴露，引起菌體對(duì)外界環(huán)境的抗性降低，進(jìn)而在殺菌條件下致使其死亡[36-38]。超聲協(xié)同NaClO會(huì)加速菌體裂解死亡，可能原因是在殺菌過程中超聲優(yōu)先作用于菌體細(xì)胞壁，破壞了菌體外層結(jié)構(gòu)，NaClO便直接作用于裸露的菌體，加速菌體細(xì)胞死亡。文獻(xiàn)[39]建立了超聲波產(chǎn)生的剪切力造成微生物表面附近塌陷的模型，進(jìn)一步闡明了超聲波能夠破壞菌體外層結(jié)構(gòu)，此外，文獻(xiàn)[40]關(guān)于超聲波的殺菌機(jī)制進(jìn)行了闡釋，認(rèn)為超聲產(chǎn)生的空化效果，即微泡的形成、生長(zhǎng)和潰滅導(dǎo)致機(jī)械效應(yīng)，進(jìn)而破壞菌體結(jié)構(gòu)。

2.5.2細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)損失

為了進(jìn)一步研究超聲協(xié)同NaClO對(duì)3種典型菌株菌體的破壞情況，測(cè)定并比較了超聲協(xié)同NaClO和單獨(dú)NaClO殺菌處理前后細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)損失情況，其中單獨(dú)NaClO溶液處理?xiàng)l件為200 mg/L、2 min，超聲協(xié)同NaClO處理?xiàng)l件為150 W、200 mg/L、180 s，結(jié)果如圖5所示。

圖5 超聲協(xié)同次氯酸鈉殺菌對(duì)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)損失的影響Fig.5 Effect of ultrasonic assisted sodium hypochlorite sterilization on loss of intracellular material of bacteria

由圖5可知，經(jīng)過殺菌處理的3種菌株菌懸液中還原糖及可溶性蛋白質(zhì)均出現(xiàn)增加的現(xiàn)象，超聲聯(lián)合NaClO殺菌處理較單獨(dú)NaClO殺菌，菌懸液中還原糖及可溶性蛋白質(zhì)含量顯著增加，還原糖及可溶性蛋白質(zhì)含量均增長(zhǎng)了近30%，尤其以E.coli菌懸液最為明顯，還原糖含量(質(zhì)量比)及可溶性蛋白質(zhì)含量(質(zhì)量濃度)分別達(dá)到0.76 g/(100 g)、57.36 mg/mL。由此可見，超聲協(xié)同NaClO會(huì)極大地?fù)p傷菌體細(xì)胞膜，進(jìn)而改變細(xì)胞膜通透性，使菌體中可溶性蛋白質(zhì)及還原糖滲出，加速了菌體死亡，與掃描電鏡結(jié)果相一致。

3 結(jié)束語

超聲協(xié)同NaClO對(duì)3種典型菌種的致死起到了一定的協(xié)同作用，且表現(xiàn)為高強(qiáng)度的超聲功率(60 W以上)能夠顯著提高NaClO的殺菌效果，在超聲功率150 W、NaClO質(zhì)量濃度200 mg/L、作用時(shí)間180 s的條件下對(duì)大腸桿菌、考克氏菌、枯草芽孢桿菌的殺菌量分別為(4.54±0.164)、(4.28±0.123)、(3.97±0.134)個(gè)對(duì)數(shù)值，對(duì)比單獨(dú)NaClO的殺菌量提高了13%～67%。對(duì)其殺菌效果動(dòng)力學(xué)過程進(jìn)行分析得出，與一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和Logistic模型相比，Weibull模型整體上能更好地?cái)M合超聲協(xié)同次氯酸鈉對(duì)大腸桿菌、考克氏菌、枯草芽孢桿菌的失活動(dòng)力學(xué)過程。通過觀察超聲協(xié)同次氯酸鈉對(duì)3種典型菌株微觀結(jié)構(gòu)的變化發(fā)現(xiàn)，超聲協(xié)同次氯酸鈉會(huì)破壞菌體細(xì)胞壁，導(dǎo)致質(zhì)壁分離，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)外溢，促使胞質(zhì)內(nèi)部還原糖及蛋白質(zhì)等物質(zhì)滲出，部分細(xì)胞器溶解及細(xì)胞皺縮，最終致使細(xì)胞死亡。該研究可為超聲協(xié)同次氯酸鈉廣泛用于微生物殺菌提供方法依據(jù)。