鐘女奇，朱兆玲，陳劍煌，周 紅

（中山大學(xué)醫(yī)學(xué)教學(xué)中心，廣東 廣州 510080）

雙層溶血環(huán)[1]現(xiàn)象是多數(shù)產(chǎn)氣莢膜梭菌[2-3]在血平板上的生長特性之一，是醫(yī)學(xué)微生物學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)的重要、常規(guī)實(shí)驗(yàn)內(nèi)客之一；其內(nèi)環(huán)由θ毒素引起，較小、完全透明、在對光處可見到菌落周圍有一層很亮的小環(huán)圍繞著，外環(huán)由α毒素引起，大、不完全溶血。雙層溶血環(huán)的效果、穩(wěn)定性維持有多久，除了菌株、厭氧條件等外，培養(yǎng)基類型[3]也很關(guān)鍵。為了滿足繁重的醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的需要，筆者們在前人的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)[4]基礎(chǔ)上，在教學(xué)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備中，選用了一種市場上能方便購買到的苯乙醇瓊脂厭氧培養(yǎng)基（EPA）[5]與前代自制的哥倫比亞兔血瓊脂平板培養(yǎng)基（CRBA）[4、6]，進(jìn)行了相關(guān)的比較實(shí)驗(yàn)；雙層溶血環(huán)的效果更好、更穩(wěn)定、維持時間更長，可長達(dá)1周以上，大大滿足了教學(xué)要求，也符合科、教、研中的以“減少、替代和優(yōu)化”為核心的“3R”[7]原則要求。以下是兩種培養(yǎng)基的效果比較實(shí)驗(yàn)，希望拋磚引玉，為醫(yī)學(xué)教學(xué)等實(shí)驗(yàn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備

細(xì)菌培養(yǎng)箱、厭氧罐等

1.2 培養(yǎng)基與試劑

哥倫比亞兔血瓊脂平板[4]，苯乙醇厭氧培養(yǎng)基（購于廣州市迪景微生物科技有限公司），鈀粒（蘇州沃機(jī)械科技有限公司），美白指示劑[4]，檸檬酸A.R（洛陽市化學(xué)試劑廠批號150109），硼氫化鈉（天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司，批號：20140620）

1.3 方法

厭氧罐的密封性能檢查（美白指示劑；復(fù)蘇產(chǎn)氣莢膜桿菌，接種于皰肉培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)，第二天或6～8 h后觀察渾濁狀況，控制接種劑量1%[3]，進(jìn)行1～3區(qū)劃線；厭氧培養(yǎng)[4]；第2天觀察結(jié)果；效果穩(wěn)定性維持觀察。

2 結(jié) 果

兩種培養(yǎng)基均能獲得清晰、亮麗的雙層溶血環(huán)，但是同一菌株對兔血的溶血活性存在差異性、需要花更多的材料與時間去篩選，造成不必要的浪費(fèi)問題；CRBA平板出現(xiàn)的溶血環(huán)有時兩環(huán)分界不是很明晰，而EPA培養(yǎng)基更易分離出單菌落，兩環(huán)分界很明顯、環(huán)很有觀感，沒有滯泥感；在穩(wěn)定性方面CRBA內(nèi)雙層溶血環(huán)在4℃基本可維持5～6天，但在室溫只能1天左右，而EPA培養(yǎng)基出現(xiàn)的雙層溶血環(huán)的內(nèi)環(huán)，即使在18 h左右不如CBA明朗，但是第二天效果就勝于CRBA，并且EPA血平板效果穩(wěn)定性可維持1個月（4℃），在室溫1W左右。

3 討 論

（1）本試驗(yàn)中所用兩種血平板在營養(yǎng)成分上沒有多大的差異，均富含對α毒素產(chǎn)生有益的營養(yǎng)素[2]，但是EPA中苯乙醇能與厭氧罐中產(chǎn)生的O2反應(yīng)生成苯甲酸（降低了培養(yǎng)基的原pH 7.3+/-0.2），更徹底地消耗罐內(nèi)的氧氣，同時苯甲酸可利用罐內(nèi)產(chǎn)生的H還原為苯乙醇，這種良性循環(huán)，使得厭氧環(huán)境更徹底、提供的pH環(huán)境更接近6.0，更有利于α毒素的產(chǎn)生[3]，這種良好循環(huán)使得EPA培養(yǎng)皿內(nèi)環(huán)境中水分更少、更有力于觀察菌落；EPA培養(yǎng)皿內(nèi)厭氧環(huán)境維持時間也相對較長，已脫離厭氧罐環(huán)境，轉(zhuǎn)移到普通室溫環(huán)境中的菌株也能繼續(xù)生長。（2）苯乙醇是很好的防腐、保鮮劑，有利于紅細(xì)胞新鮮度的維持，這也使得EPA培養(yǎng)基中的雙層溶血環(huán)會更大，不至于在短時間內(nèi)雙環(huán)融合、出現(xiàn)單環(huán)現(xiàn)象。（3）雖然空白EPA的鮮艷性不如CRBA、在價格上稍微貴一些，但是實(shí)際上是節(jié)約了成本，因?yàn)槠洳恍枰ダ速M(fèi)兔子與時間了。（4）所以在雙層溶血環(huán)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示教中，EPA的應(yīng)用效果更勝一籌。

4 效果圖