習洋，孫宇涵，李云

(1.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心 醫(yī)藥生物部，北京 100160；2.北京林業(yè)大學 生物科學與技術(shù)學院，北京 100083)

體細胞胚發(fā)生是體細胞向胚胎發(fā)生途徑轉(zhuǎn)變的重建過程，也是證明細胞全能性理論的經(jīng)典實例.

建立一個高頻率、同步化發(fā)生的體細胞胚培養(yǎng)系統(tǒng)，對深入揭示植物胚胎發(fā)育機制以及在植物遺傳轉(zhuǎn)化和人工種子等方面應(yīng)用均很重要[1].早在1973年Okamura[2]就在胡蘿卜細胞培養(yǎng)中采用低溫處理和饑餓處理相結(jié)合的方法獲得了較好的細胞同步化結(jié)果.陳春玲[3]通過控制培養(yǎng)基中2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)的質(zhì)量濃度來調(diào)控龍眼體胚的發(fā)育，研究表明經(jīng)過不同質(zhì)量濃度2,4-D處理后的材料染色體數(shù)目正常，且仍然保持著很強的體細胞胚發(fā)生能力，通過對龍眼整個體細胞胚發(fā)生過程的研究，根據(jù)不同發(fā)育階段材料對培養(yǎng)基中2,4-D的質(zhì)量濃度需求不同，實驗設(shè)計了多種同步化培養(yǎng)基并分別獲得了非胚性愈傷組織、胚性愈傷組織Ⅰ( 1 mg/L 2,4-D) 、胚性愈傷組織Ⅱ( 0.8 mg/L 2,4-D) 、胚性緊密結(jié)構(gòu)、不完全胚性緊密結(jié)構(gòu)、球形胚、玻璃化早期子葉形胚、成熟子葉形胚等 8 個階段的同步化調(diào)控材料.目前，通過調(diào)控培養(yǎng)得到同步化的植物體細胞胚仍是尚未解決的難題，進行過細胞同步化和體細胞胚發(fā)生的同步化培養(yǎng)研究的僅有胡蘿卜、水稻、枸杞、龍眼等少數(shù)幾種植物[1].

本實驗室前期利用不同時期的刺槐未成熟合子胚誘導愈傷組織，研究了幼胚胚齡和不同植物生長調(diào)節(jié)劑對于體細胞胚誘導的影響[4],并建立了刺槐胚性細胞懸浮系[5].本文是在已建立了刺槐體細胞培養(yǎng)體系基礎(chǔ)上，進一步對刺槐胚性愈傷組織的體細胞胚發(fā)生及同步控制進行了研究，建立了刺槐體細胞胚發(fā)生及同步控制的培養(yǎng)體系，以期有助于生理生化和分子水平上的刺槐體細胞胚發(fā)生機制研究.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

由刺槐55 d胚齡的未成熟合子胚誘導得到的嫩黃綠色、松散易碎、顆粒狀的刺槐胚性愈傷組織由北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院李云課題組提供.

1.2 低溫處理控制體細胞胚同步化

將多次繼代的胚性愈傷組織接種到體細胞胚誘導培養(yǎng)基中，置于4 ℃的低溫條件下分別處理0、7、14、21、28 d后轉(zhuǎn)移到正常溫度條件下培養(yǎng)，7 d后觀察體細胞胚生長情況，且每7 d統(tǒng)計體細胞胚的發(fā)生數(shù)目.體細胞胚誘導培養(yǎng)基為MS(Murashige & Skoog)+NAA(naphthylacetic acid) 0.5 mg/L+ BA(benzyladenine ) 0.5 mg/L+2-嗎啉乙磺酸 (MES) 500 mg/L+谷氨酰胺 500 mg/L+水解酪蛋白 500 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L[4].

1.3 蔗糖質(zhì)量濃度控制體細胞胚同步化

將多次繼代的胚性愈傷組織接種到附加不同質(zhì)量濃度(0，20，30，50，70 g/L)蔗糖的體細胞胚誘導培養(yǎng)基中，每7 d觀察體細胞胚生長情況，并統(tǒng)計體細胞胚的發(fā)生數(shù)目. 體細胞胚誘導培養(yǎng)基為MS+NAA 0.5 mg/L+ BA 0.5 mg/L+MES 500 mg/L+谷氨酰胺 500 mg/L+水解酪蛋白500 mg/L +瓊脂6 g/L.

1.4 外源植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度控制體細胞胚同步化

將多次繼代的胚性愈傷組織接種到附加不同質(zhì)量濃度(0，0.1，0.3，0.5，1.0 mg/L)2,4-D的體細胞胚誘導培養(yǎng)基中，每7 d觀察體細胞胚生長情況，并統(tǒng)計體細胞胚的發(fā)生數(shù)目. 體細胞胚誘導培養(yǎng)基為MS+BA 0.5 mg/L+谷氨酰胺 500 mg/L+水解酪蛋白500 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L.

1.5 懸浮培養(yǎng)控制體細胞胚同步化

選擇嫩黃綠色、顆粒狀、生長較快的胚性愈傷組織，置于培養(yǎng)基成分為1/2 MS+MES 500 mg/L+NAA 2.5 mg/L+BA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L的懸浮培養(yǎng)基中，得到分散度較好、穩(wěn)定性較強且具有胚性的懸浮培養(yǎng)細胞[5].

用吸管吸取懸浮液，將懸浮培養(yǎng)的胚性細胞用50目篩(孔徑0.28 mm)過濾，將留在篩上的細胞團均勻地接種到表面墊有濾紙的MS+NAA 0.5 mg/L+ BA 0.5 mg/L+MES 500 mg/L+谷氨酰胺 500 mg/L+水解酪蛋白500 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂3 g/L半固體愈傷組織的誘導培養(yǎng)基上，進行看護培養(yǎng).使用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析，每個處理3個重復.

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫對體細胞胚發(fā)生同步化的影響

將前期誘導得到的胚性愈傷組織在4 ℃條件下低溫處理，經(jīng)過42 d的恢復培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)隨著低溫處理時間的延長，體細胞胚子葉期同步化率逐漸降低(圖1).低溫處理7 d的子葉體細胞胚同步化率最高，為37.3%，而低溫處理14 d的子葉體細胞胚同步化率僅為27.3%，與低溫處理7 d的子葉體細胞胚相比延長低溫處理時間(21 d和28 d)的子葉體細胞胚同步化率均顯著降低(P<0.05).

圖1 不同低溫處理時間對體細胞胚子葉期同步化率的影響Fig.1 Effects of different freezing time on the synchronization of cotyledon somatic embryos

實驗觀察發(fā)現(xiàn)，低溫處理7 d的胚性愈傷組織顏色接近正常，愈傷組織基部邊緣有輕微褐化的現(xiàn)象.隨著低溫處理時間延長，胚性愈傷組織的褐化現(xiàn)象漸漸加重(表1).當?shù)蜏靥幚?1 d時胚性愈傷組織出現(xiàn)明顯的褐化現(xiàn)象，整個愈傷組織塊呈現(xiàn)褐色.而低溫處理28 d時其褐化現(xiàn)象與低溫處理21 d時差別不大，只是個別部位褐化更為嚴重.這一現(xiàn)象可能是由于低溫處理對刺槐胚性愈傷組織造成的傷害主要取決于溫度變化，而當?shù)蜏靥幚頊囟纫欢〞r，處理時間的長短對刺槐胚性愈傷組織造成的傷害沒有顯著差異.然而，較長的低溫處理時間會抑制刺槐胚性愈傷組織的體細胞胚發(fā)生.統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)，分析發(fā)現(xiàn)低溫處理7 d的子葉體細胞胚同步化率與對照有顯著差異 (P<0.05).

表1 不同低溫處理時間對體細胞胚發(fā)育的影響

胚性愈傷組織經(jīng)過低溫處理后畸形胚的發(fā)生率明顯降低(表1).徐元紅[6]在平貝母體細胞胚誘導和植株再生的過程中發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)低溫處理(0～5 ℃冰箱中處理60 d)的體細胞胚會發(fā)育成為畸形胚.Mahesh[7]認為低溫處理與低培養(yǎng)溫度綜合作用，可明顯提高體細胞胚的發(fā)生數(shù)量，且有利于體細胞胚的正常發(fā)育.從表1中可以發(fā)現(xiàn)，隨著低溫處理時間的延長，畸形胚的發(fā)生率逐漸降低，但下降幅度不大.綜合分析低溫處理實驗結(jié)果，在低溫(4 ℃)條件下將胚性愈傷組織處理7 d最有利于刺槐體細胞胚的同步化.

2.2 蔗糖質(zhì)量濃度對體細胞胚發(fā)生同步化的影響

將經(jīng)過多次繼代的胚性愈傷組織接種到5種不同蔗糖質(zhì)量濃度的體細胞胚誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基為MS+NAA 0.5 mg/L+ BA 0.5 mg/L+MES 500 mg/L+谷氨酰胺 500 mg/L+水解酪蛋白500 mg/L+瓊脂6 g/L.培養(yǎng)28 d后觀察體細胞胚的發(fā)育情況，56 d后統(tǒng)計子葉期體細胞胚的同步化情況和畸形胚的發(fā)生情況及體細胞胚的敗育情況.

如圖2所示，在蔗糖質(zhì)量濃度升高的培養(yǎng)基中誘導得到的體細胞胚其同步化率遠高于對照組(P<0.05).當蔗糖質(zhì)量濃度為50 g/L時，其子葉體細胞胚的同步化率最高，可達35.0%，與蔗糖質(zhì)量濃度為30 g/L的對照組的體細胞胚同步化率(17.3%)相比有顯著差異(P<0.05).Bomal[8]在對黑云杉的體細胞胚誘導實驗中發(fā)現(xiàn)，滲透壓升高導致的水分饑餓能夠促進體細胞胚的同步化發(fā)生.本實驗中得出相同的結(jié)論.當培養(yǎng)基中的蔗糖質(zhì)量濃度升高到50 g/L時，培養(yǎng)基中的碳源豐富，能夠滿足胚狀體發(fā)生的需要，與對照組相比，此時的培養(yǎng)基滲透壓升高，水分相對不足，胚性愈傷組織在水分饑餓的條件下漸漸停止增殖分裂，隨后細胞開始分化，向胚狀體方向發(fā)展.當培養(yǎng)基中的蔗糖質(zhì)量濃度降低為20 g/L時，體細胞胚的同步化率也略有升高，為18.3%，與對照組相比差異不顯著.分析原因，可能是由于培養(yǎng)基中的蔗糖質(zhì)量濃度較低，此時體細胞胚的發(fā)育主要受到能量供給的限制，而滲透壓的調(diào)節(jié)作用處于次要地位造成的.當培養(yǎng)基中無蔗糖存在時，其子葉體細胞胚的同步化率顯著低于有蔗糖條件下的子葉體細胞胚的同步化率.這可能是由于愈傷組織轉(zhuǎn)移到無糖培養(yǎng)基后，其能量供應(yīng)不足，組織停止發(fā)育，使得體細胞胚生長緩慢甚至褐化死亡.

圖2 不同蔗糖質(zhì)量濃度對體細胞胚子葉期同步化率的影響Fig.2 Effects of different sucrose mass concentration on the synchronization of cotyledon somatic embryos

在植物體細胞胚的誘導培養(yǎng)過程中，長久以來沒有克服的技術(shù)難題是無法抑制畸形胚的發(fā)生，本研究中也存在同樣的問題.如圖3所示，畸形胚的發(fā)生率隨著蔗糖質(zhì)量濃度的改變而發(fā)生變化.當培養(yǎng)基中的蔗糖質(zhì)量濃度過高或過低時都會導致畸形胚的發(fā)生率顯著升高.培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量濃度降為0時，畸形胚發(fā)生率達到最高，為78.3%，分析原因，可能是因為在不含蔗糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)基滲透壓過低，供應(yīng)細胞合成的碳源不充足等原因?qū)е碌?然而，統(tǒng)計分析顯示培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量濃度為20和50 g/L時體細胞胚畸形率彼此之間無顯著性差異.

圖3 不同蔗糖質(zhì)量濃度對體細胞胚敗育和畸形發(fā)生的影響Fig.3 Effects of different sucrose mass concentration on the abortive somatic embryogenesis and abnormal embryogenesis

實驗中發(fā)現(xiàn)，體細胞胚的敗育現(xiàn)象存在于體細胞胚誘導、同步化及體細胞胚成苗的全過程中.觀察實驗中處于不同蔗糖質(zhì)量濃度培養(yǎng)條件下的刺槐體細胞胚的敗育情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量濃度降為0時，敗育率最高，為59.0%(圖3).這可能是由于培養(yǎng)基中不添加蔗糖時胚性細胞難以增殖，而此培養(yǎng)條件適宜非胚性細胞的增殖，此時，愈傷組織中的胚性細胞逐漸喪失胚性，轉(zhuǎn)化為非胚性細胞，因此在這種無蔗糖的培養(yǎng)條件下，恢復培養(yǎng)物中胚性細胞的體細胞胚發(fā)生潛能是不可能的.提高培養(yǎng)基中的蔗糖質(zhì)量濃度雖然也會使體細胞胚的敗育率增高，但是這種影響遠低于蔗糖質(zhì)量濃度降低時的影響.當培養(yǎng)基中的蔗糖質(zhì)量濃度為50 g/L時，體細胞胚的敗育率為15.0%，且大部分敗育的胚狀體都分布在與培養(yǎng)基接觸的部分.

綜合上述實驗結(jié)果，培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量濃度為50 g/L時最適宜調(diào)控刺槐的體細胞胚同步化.

2.3 外源植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度對體細胞胚發(fā)生同步化的影響

將經(jīng)過多次繼代的胚性愈傷組織接種到含有不同2,4-D的體細胞胚誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基為MS+ BA 0.5 mg/L+MES 500 mg/L+谷氨酰胺 500 mg/L+水解酪蛋白500 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L.培養(yǎng)28 d后觀察愈傷組織上體細胞胚的發(fā)育情況，培養(yǎng)56 d后統(tǒng)計刺槐子葉期體細胞胚的同步化發(fā)生情況和畸形胚的發(fā)生情況.

實驗結(jié)果如圖4所示，2,4-D不僅對體細胞胚的誘導起決定作用，還可以控制體細胞胚的同步化發(fā)育，隨著培養(yǎng)基中2,4-D質(zhì)量濃度的降低體細胞胚的同步化率相應(yīng)升高.當培養(yǎng)基中2,4-D的質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時，體細胞胚的同步化率最高，為43.6%.劉選明[9]在對雜交水稻的體細胞胚同步化研究中發(fā)現(xiàn)2,4-D能夠影響胚性細胞的活力，高質(zhì)量濃度的2,4-D顯著抑制體細胞胚的發(fā)生和發(fā)育，使胚性愈傷組織進入周而復始的增殖周期而無法分化成胚狀體.當培養(yǎng)基中不含2,4-D時，體細胞胚的同步化率有所下降，但此時的同步化率與2,4-D質(zhì)量濃度為0.3 mg/L時差異不顯著.

圖4 2,4-D質(zhì)量濃度對體細胞胚子葉期的同步化率的影響Fig.4 Effects of different 2,4-D mass concentration on synchronization of cotyledon somatic embryo

袁澍等[10]研究發(fā)現(xiàn)2,4-D通過與細胞內(nèi)的激素受體蛋白結(jié)合而對某些控制植物體胚發(fā)生的特異表達基因起調(diào)控作用，它可以激活某些控制細胞胚性的相關(guān)基因，增加胚胎發(fā)生特異蛋白的表達量；此外，2,4-D對畸形胚的發(fā)生有較好的抑制效果，在適宜的質(zhì)量濃度下，2,4-D能夠抑制多種畸形體細胞胚的發(fā)生.本研究也得出了相同的結(jié)論，隨著培養(yǎng)基中2,4-D質(zhì)量濃度的升高，畸形胚的發(fā)生率逐漸降低.但是2,4-D質(zhì)量濃度為0.1～0.5 mg/L時的畸形胚發(fā)生率差異并不顯著(圖5).

圖5 2,4-D質(zhì)量濃度對畸形胚發(fā)生率的影響Fig.5 Effects of 2,4-D mass concentration on abnormal embryogenesis

綜合上述實驗結(jié)果，培養(yǎng)基中的2,4-D質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時最適宜體細胞胚同步化的調(diào)控.

2.4 懸浮培養(yǎng)細胞的體細胞胚同步化誘導

圖6a-i顯示了各發(fā)育階段的同步化體細胞胚.將懸浮培養(yǎng)的胚性細胞用50目篩(孔徑0.28 mm)過濾，將留在篩上的細胞團接種到鋪有濾紙的半固體體細胞胚誘導培養(yǎng)基上(圖6g)，培養(yǎng)基為MS+NAA 0.5 mg/L+ BA 0.5 mg/L+MES 500 mg/L+谷氨酰胺 500 mg/L+水解酪蛋白500 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂3 g/L.培養(yǎng)7 d后觀察到細胞團的數(shù)量明顯增多，14 d左右可以發(fā)現(xiàn)有少量體細胞胚發(fā)生(圖6h).培養(yǎng)21 d左右，球形胚大量發(fā)生(圖6i)，占到總胚狀體數(shù)目的67.3%.在得到的胚狀體中，有部分球形胚進入了魚雷胚期和子葉胚期，但二者的數(shù)目僅占總胚數(shù)的20.4%和12.3%(表2).隨著總胚數(shù)的逐漸增加，球形胚數(shù)量逐漸減少，魚雷期和子葉期的體細胞胚數(shù)量逐漸增加，但球形胚期的體細胞胚仍占主要地位.實驗中沒有觀察到典型的大量心形胚的發(fā)生時期.這可能是由于心形胚的發(fā)育時期較短，不易觀察.培養(yǎng)至28 d時，總體細胞胚數(shù)的增加開始減緩，球形胚向魚雷胚和子葉胚的轉(zhuǎn)化也逐漸停滯，畸形胚的數(shù)量顯著增加.分析原因可能與營養(yǎng)物供給不足有關(guān).將培養(yǎng)21 d的球形胚轉(zhuǎn)接至新鮮的墊有濾紙的誘導培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)能夠有效降低畸形胚的發(fā)生比例，得到大量同步化的正常發(fā)育的體細胞胚.

a.同步化的球形體細胞胚；b.同步化的魚雷胚；c.同步化的子葉胚；d.起始密度為2 g時的懸浮培養(yǎng)細胞團；e.懸浮培養(yǎng) 21 d后的胚性細胞團；f.懸浮培養(yǎng)21 d后的胚性培養(yǎng)物；g.接種到看護培養(yǎng)基上的懸浮培養(yǎng)物；h.看護培養(yǎng)14 d后 得到的球形胚；i.看護培養(yǎng)21 d后得到的球形胚和個別魚雷胚.圖6 同步化的各發(fā)育階段的體細胞胚Fig.6 Synchronized somatic embryo at different developmental stages

表2 看護培養(yǎng)下不同時期的體細胞胚發(fā)生率

表中數(shù)據(jù)為每個時期統(tǒng)計3個培養(yǎng)皿中體細胞胚數(shù)目.

3 討論

1)低溫可以導致細胞發(fā)育的停滯，即形成溫度傷害，這種溫度傷害?？梢杂脕碚{(diào)控體細胞胚的同步化發(fā)生.李鳳榮[11]研究了不同低溫處理時間下蠶豆根尖細胞分裂的同步化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低溫處理時間對細胞的同步化率有顯著影響.周愛文[12]的研究表明，溫度對于植物細胞的有絲分裂具有顯著的影響，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的下降細胞分裂速度減緩、細胞周期延長，相應(yīng)地延長了細胞分裂期的時間，分裂指數(shù)相應(yīng)提高，細胞的同步化率也相應(yīng)升高.當培養(yǎng)溫度恢復至正常水平時，大量細胞即進入DNA的合成期，隨后出現(xiàn)一個明顯的細胞分裂高峰.低溫處理可以提高紅豆杉懸浮培養(yǎng)細胞的同步化程度，以4 ℃處理24 h后，再恢復培養(yǎng)24 h，紅豆杉懸浮細胞分裂指數(shù)可達到10.26%[13].毛春娜[14]在對半夏懸浮培養(yǎng)細胞的同步化調(diào)控中采用了低溫處理的方法，并發(fā)現(xiàn)低溫處理可以顯著提高細胞的同步化率，有效地提供高細胞分裂指數(shù).本實驗結(jié)果也顯示，低溫處理可以促進刺槐體細胞胚的同步化發(fā)生，且低溫處理后的刺槐體細胞胚大小均一、發(fā)育良好,畸形胚的發(fā)生率明顯降低.低溫處理操作簡單、方便，且短暫的低溫處理一般不會引起細胞DNA和染色體的變異，目前，低溫培養(yǎng)在動物細胞和植物細胞培養(yǎng)領(lǐng)域是倍受青睞的同步化調(diào)控方法.

2)蔗糖作為碳源，為植物細胞的呼吸代謝提供必要的能源，同時蔗糖還是培養(yǎng)物與培養(yǎng)環(huán)境維持滲透壓平衡的主要調(diào)節(jié)者.在植物細胞培養(yǎng)方面，目前的研究大多集中在蔗糖對植物胚性愈傷組織的影響上，而針對蔗糖在體細胞胚同步化調(diào)控方面的研究卻很少.本實驗發(fā)現(xiàn)，在添加不同質(zhì)量濃度蔗糖培養(yǎng)基中，刺槐體細胞胚發(fā)生的同步化水平存在顯著差異.這說明蔗糖質(zhì)量濃度對刺槐體細胞胚的同步化發(fā)生有著重要影響.分析原因，可能是由于不同發(fā)育階段的植物體細胞胚對滲透壓有著不同的需求，因此可以通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中蔗糖的質(zhì)量濃度來調(diào)節(jié)滲透壓從而控制體細胞胚的發(fā)育，使其停滯在某一發(fā)育階段[15].但是長期處于高蔗糖質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基中會極大地降低愈傷組織的胚胎發(fā)生能力，導致畸形胚的發(fā)生和胚狀體敗育.本實驗綜合了蔗糖質(zhì)量濃度對畸形胚和胚狀體敗育的影響，認為培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量濃度為50 g/L時最適宜調(diào)控刺槐的體細胞胚同步化，此時的體細胞胚同步化率達到35.0%.

3)在調(diào)控植物體細胞胚的同步化發(fā)育方面外源植物生長調(diào)節(jié)劑也發(fā)揮著重要作用.楊映根[16]在青杄體細胞胚發(fā)生的實驗中發(fā)現(xiàn)，在含有脫落酸(ABA)的分化培養(yǎng)基中青杄子葉期體細胞胚的同步化率可達80%以上.Merkle[17]在對針葉樹體細胞胚的同步化發(fā)生研究中也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過ABA處理后可產(chǎn)生大量高質(zhì)量同步化的成熟體細胞胚.2,4-D是誘導愈傷組織必不可少的生長激素[18]，2,4-D對內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)和平衡起重要作用[19]，57.7%的雙子葉植物和幾乎所有的單子葉植物在體細胞胚的誘導階段均使用了2,4-D[20].低質(zhì)量濃度的2,4-D不僅能夠促進體細胞胚的發(fā)生，而且還能夠調(diào)控體細胞胚的同步化.在本實驗中，低質(zhì)量濃度的2,4-D能夠顯著促進刺槐體細胞胚的同步化發(fā)生，且同步化率可達43.6%.然而2,4-D促進體細胞胚同步化的機制尚不清楚，還有待于進一步的研究.

4)植物細胞懸浮培養(yǎng)具有促進胚性細胞大量快速增殖、形成均一的小細胞團和單細胞等優(yōu)點，是建立體細胞胚同步化的良好實驗體系[21].本實驗通過建立刺槐的胚性細胞懸浮培養(yǎng)體系，探索了植物生長調(diào)節(jié)劑和培養(yǎng)方法對體細胞胚同步化的影響.細胞懸浮培養(yǎng)對刺槐體細胞胚的同步化調(diào)控是有效的，與固體培養(yǎng)相比，懸浮培養(yǎng)時胚性愈傷組織能夠更均勻更充分地吸收營養(yǎng)[22-23]，有利于體細胞胚胎發(fā)生的同步化[24].在一些植物的體細胞胚同步化誘導中，懸浮培養(yǎng)往往和ABA處理[25-26]、肌醇饑餓[27]、密度梯度離心[28-29]等方法結(jié)合使用，以實現(xiàn)體細胞胚的同步發(fā)育.本實驗中將懸浮培養(yǎng)和半固體看護培養(yǎng)相結(jié)合，將懸浮培養(yǎng)16 d的胚性細胞接種到墊有濾紙的半固體培養(yǎng)基上，使其與培養(yǎng)基充分均勻接觸，解決了固體培養(yǎng)時通常存在的培養(yǎng)物與培養(yǎng)基接觸不均勻的問題.結(jié)果表明，當懸浮培養(yǎng)物在半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)21 d左右時，球形胚大量發(fā)生，占到總胚狀體數(shù)目的67.3%.

4 展望

目前，能夠成功進行體細胞胚同步化的植物品種還很少，對于植物體細胞胚同步化條件的優(yōu)化還有待進一步研究. 本研究探索了刺槐體細胞胚同步化發(fā)生的培養(yǎng)條件，并綜合畸形胚和胚狀體敗育的情況得出了各方法誘導刺槐體細胞胚同步化發(fā)生的最適條件，希望能夠為其他植物種類的體細胞胚同步化調(diào)控提供參考.通過對體細胞胚發(fā)生中調(diào)控基因的研究，進一步明確外源培養(yǎng)條件在體細胞胚發(fā)生各階段的調(diào)控機理，必將對于更多植物品種的體細胞胚發(fā)生同步化，以及利用體細胞胚技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因受體奠定基礎(chǔ),為實現(xiàn)通過基因修飾進行體細胞胚同步化控制創(chuàng)造條件.