張君，孫思勉，趙琳，周航，林冬菊，霍小位

(河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北省藥物質(zhì)量分析控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002)

三七(Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen)為五加科植物三七的干燥根，又名田七，主產(chǎn)于中國(guó)云南、廣西.三七作為廣泛應(yīng)用的中藥，其有效成分主要有揮發(fā)油、黃酮、氨基酸等，具有止血生肌、活血化瘀、消腫定痛、滋補(bǔ)、強(qiáng)壯、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等作用[1].雖然三七使用廣泛，但三七根莖、三七花的干燥仍以傳統(tǒng)方法為主，三七中的皂苷、三七素、氨基酸、揮發(fā)油等主要有效成分在高溫下易分解，引起活性物質(zhì)損失從而導(dǎo)致三七的藥效下降[2-3].真空冷凍干燥技術(shù)可以有效地保存三七等中藥的藥效成分[4-7].云南省食品藥品監(jiān)管局于2018年發(fā)布了三七(凍干)、三七顆粒(凍干)、三七粉(凍干)、三七切片(凍干)4個(gè)中藥飲片炮制規(guī)范，表明真空冷凍干燥技術(shù)已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用于炮制三七制劑.

真空冷凍干燥技術(shù), 就是將含水的中藥材或西藥材料凍結(jié)成固態(tài), 調(diào)整其溫度，在真空條件下冰就會(huì)升華成為水蒸氣, 從而將藥物中的水分清除, 達(dá)到理想的效果[8].目前, 凍干技術(shù)不僅用于血清、血漿、疫苗、酶、抗生素、激素等藥品以及食品的生產(chǎn), 而且在對(duì)性質(zhì)不穩(wěn)定的化學(xué)藥品和中藥新劑型研發(fā)中的應(yīng)用也越來(lái)越多[9],還可以解決一些藥物新劑型長(zhǎng)期儲(chǔ)存容易發(fā)生沉降、絮凝、聚結(jié)、變質(zhì)的問(wèn)題，提高其穩(wěn)定性[10], 臨床治療效果良好的不少中藥制成凍干粉針后，其成型性、水溶性較注射液好，穩(wěn)定性大大提高[11]，天花粉、雙黃連等中藥粉針劑在臨床上的普遍應(yīng)用就是明證[9].實(shí)驗(yàn)證明真空冷凍干燥的三七，脫水徹底，干燥后的成品表面黃白色，質(zhì)輕，藥味濃[12].且從內(nèi)部結(jié)構(gòu)的保持和復(fù)水品質(zhì)角度來(lái)看，真空冷凍干燥切片具有較均一的多孔、疏松結(jié)構(gòu)，組織致密，復(fù)水時(shí)間短，復(fù)水比大，復(fù)水后口感佳，與新鮮三七差別最小，故真空冷凍干燥法優(yōu)于自然干燥法和熱風(fēng)干燥法等傳統(tǒng)干燥法[12].

通過(guò)目前的固有制劑與其他藥物凍干粉或凍干制劑的比較來(lái)看，凍干粉對(duì)提高藥物療效和提升藥物的某些治療優(yōu)勢(shì)有明顯作用，而且可以從某些方面更好地保證藥物有效成分的完整度.本文將以三七為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)三七凍干粉和三七普通粉的有效成分分析及藥理作用比較研究，提出三七凍干粉的優(yōu)勢(shì).

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種健康小鼠，雄性，70只，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，許可證號(hào)：SCXK(魯)20140007.

1.2 藥品及試劑

三七普通粉和三七凍干粉(河北祁一堂藥業(yè)有限公司)；對(duì)二甲苯(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)(批號(hào)RG322803，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)；人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)RG202004，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)；三七皂苷R1標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)RG 202683，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)；乙腈(福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司)；甲醇(福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；一次性毛細(xì)玻璃管(華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠生產(chǎn))；光學(xué)顯微鏡(制造商：Qimaging)；電子顯微鏡(德國(guó)卡爾蔡司公司)；柱溫箱(大連日普利科技儀器有限公司)；示差折光檢測(cè)器(SHOKO CO.LTD)；高效液相色譜儀(北京鋼臣科技有限公司).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 顯微鏡觀察

2.1.1 光學(xué)顯微鏡觀察

將三七普通粉末和三七凍干粉末均勻分散于載玻片上，置于光鏡下進(jìn)行觀察，選取合適的放大倍數(shù)進(jìn)行比對(duì)觀察.

2.1.2 電子顯微鏡觀察

將三七普通粉末和三七凍干粉末，分別借助于棉球直接撒落在載物片上，再用洗耳球輕吹試樣，除去附著的微粒，將載有微粒的載玻片翻轉(zhuǎn)，對(duì)準(zhǔn)試樣臺(tái)，用小鑷子輕輕敲打，使顆粒均勻地落在試樣臺(tái)上，噴涂導(dǎo)電膜后，置于電鏡下進(jìn)行觀察，選取合適的放大倍數(shù)進(jìn)行比對(duì)觀察.

2.2 三七普通粉和三七凍干粉的溶解度考察

將三七普通粉和三七凍干粉配置成終質(zhì)量濃度相同的混懸液(終質(zhì)量濃度0.01 g/mL). 肉眼觀察其溶解度是否有明顯區(qū)別.

2.3 三七普通粉和凍干粉有效成分含量的測(cè)定

2.3.1 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制

精密稱(chēng)取干燥至恒重的人參皂苷Rg1、 Rb1和三七皂苷R1對(duì)照品4.1、4.3、1.7 mg置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液.

2.3.2 供試品溶液的配制

精密稱(chēng)定三七普通粉、三七凍干粉各0.5 g，置于50 mL的容量瓶中，用甲醇定容，稱(chēng)定質(zhì)量，放置過(guò)夜，并將其超聲1 h，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得.

2.3.3 色譜條件

色譜柱：上海月旭UltimateXB-C18 (250 mm×4.6 mm)；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量30 μL；流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，采用梯度洗脫，0～12 min，A-B (體積比為19∶81)，12～70 min (體積比為36∶64).

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定

混合對(duì)照品溶液分別稀釋0.75、2、4、6、10倍，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定.以進(jìn)樣質(zhì)量濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到3種對(duì)照品的線(xiàn)性回歸方程.三七皂苷R1在17～170 μg/mL與其峰面積之間呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，其線(xiàn)性回歸方程為y=19 287x-34.752，r=0.999 1;人參皂苷Rg1在41～410 μg/mL與其峰面積之間呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，其線(xiàn)性回歸方程為y=30 228x-114.76，r=0.999 5；人參皂苷Rb1在43～430 μg/mL與其峰面積之間呈良好的線(xiàn)性關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=16 005x-48.407，r=0.999 8.

2.4 三七普通粉和三七凍干粉的藥理作用比較

2.4.1 動(dòng)物分組及給藥

小鼠按體重隨機(jī)分為7組，每組10只：空白對(duì)照組、普通三七粉高劑量組(2 g/kg)、普通三七粉中劑量組(1 g/kg)、普通三七粉低劑量組(0.5 g/kg)、三七凍干粉高劑量組(2 g/kg)、三七凍干粉中劑量組(1 g/kg)、三七凍干粉低劑量組(0.5 g/kg).按10 g體質(zhì)量灌胃給藥0.2 mL，每天1次，連續(xù)給藥10 d.每2天稱(chēng)量1次體質(zhì)量.

2.4.2 毛細(xì)玻管法測(cè)凝血時(shí)間

末次給藥30 min后，用毛細(xì)玻管插入小鼠眼球靜脈叢，自血液流進(jìn)玻管內(nèi)計(jì)時(shí)，待血柱約5 cm時(shí)取出毛細(xì)玻管，平放于實(shí)驗(yàn)桌上，每隔30 s折斷毛細(xì)玻管兩端約0.5 cm，并緩慢向左右拉開(kāi)，觀察斷端有無(wú)凝血絲，記錄從毛細(xì)玻管采血至出現(xiàn)凝血絲的時(shí)間即為凝血時(shí)間.

2.4.3 剪尾法測(cè)出血時(shí)間

末次給藥30 min后，將每只小鼠尾尖剪掉約1 cm，待血液自行溢出時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí).每隔30 s用濾紙輕輕吸去血滴，直至濾紙吸時(shí)無(wú)血為止，即為出血時(shí)間.

2.4.4 耳腫脹實(shí)驗(yàn)測(cè)定抗炎作用

末次給藥30 min后，用二甲苯50 μL均勻涂抹每只鼠的右耳，30 min后頸部脫臼處死，分別用打孔器取相同部位左右耳片，分析天平稱(chēng)重，以左右耳片差值為腫脹度，計(jì)算腫脹率，腫脹率=(右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量)/左耳質(zhì)量×100%.

2.4.5 不同三七粉對(duì)小鼠免疫器官的影響

不同三七粉給藥組小鼠頸部脫臼處死后，迅速解剖，摘取小鼠的脾臟和胸腺，稱(chēng)取每個(gè)器官的質(zhì)量，計(jì)算器官指數(shù).器官指數(shù)=器官質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g).

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 顯微鏡觀察結(jié)果

3.1.1 光學(xué)顯微鏡觀察

如圖1所示，在光鏡下觀察，三七普通細(xì)粉顆粒大小不均，顆粒聚集明顯，形態(tài)各異，圖1中散布極細(xì)粉等現(xiàn)象.與三七普通粉相比，三七凍干粉大小分布較均勻，形態(tài)多呈橢圓形，少見(jiàn)聚集.由光鏡結(jié)果可知，三七凍干粉的顆粒更為分散細(xì)膩.

粒徑為20 μm；物鏡：UPLFLN 40×/0.75.圖1 光鏡下三七普通粉(a)、三七凍干粉(b)形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of ordinary P. notoginseng powder(a)lyophilized P. notoginseng powder(b)under light microscope

3.1.2 電子顯微鏡觀察

如圖2所示，在電子顯微鏡下觀察，三七普通細(xì)粉顆粒大小差異明顯，出現(xiàn)顆粒聚集，顆粒邊緣較為鋒利的特征.而三七凍干粉顆粒大小較為均勻，邊緣較為圓潤(rùn)，少見(jiàn)聚集，顆粒更為分散.由此可見(jiàn)，凍干粉粉碎后的顆粒更為細(xì)膩均勻.

3.2 溶解度觀察

如圖3所示，在2種粉末溶液配制終質(zhì)量濃度相同的情況下，三七普通粉混懸液溶液較為透明，瓶底顆粒沉積現(xiàn)象明顯，溶解度較差.而三七凍干粉粉末溶液更為渾濁，呈現(xiàn)明顯的混懸狀態(tài)，表明溶液的分散更為均勻.

粒徑為100 μm；普通粉630×；凍干粉860×.圖2 電子顯微鏡下三七普通粉(a) 三七凍干粉(b)的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of ordinary P. notoginseng powder (a)lyophilized P. notoginseng powder(b)under electron microscope

圖3 三七普通細(xì)粉混懸液(a) 三七凍干粉混懸液(b)Fig.3 Suspension of ordinary P. notoginseng powder (a)suspension of lyophilized P. notoginseng powder(b)

3.3 三七粉和凍干粉有效成分的含量測(cè)定

經(jīng)高效液相色譜分析檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4. 三七普通粉中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為11.2、29.0、39.6 mg/g；三七凍干粉中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為9.6、32.2、34.0 mg/g.

由此可得，三七普通粉的三七皂苷R1和人參皂苷Rb1含量較三七凍干粉各高出14.3%和14.1%，而人參皂苷Rg1的含量則低于三七凍干粉10%.

1.三七皂苷Rl；2.人參皂苷Rgl；3.人參皂苷Rbl.圖4 混合對(duì)照品(a)、三七普通粉(b)和三七凍干粉(c)的HPLC譜 (n=3)Fig.4 HPLC atlas of mixed reference(a)、ordinary P. notoginseng powder (b)and lyophilized P. notoginseng powder(c)

3.4 三七普通粉和凍干粉對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

如圖5所示，給藥期間，各組小鼠之間的體質(zhì)量沒(méi)有顯著性差異，表明各給藥組小鼠均沒(méi)有出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng).

圖5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量變化(n=10)Fig.5 Changes in body mass of experimental animal (n=10)

3.5 三七普通粉和凍干粉對(duì)小鼠凝血實(shí)驗(yàn)的影響

如表1所示，與空白對(duì)照組比較，普通粉高劑量組能夠明顯縮短凝血時(shí)間(P<0.05)，其他給藥組沒(méi)有顯著性差異，表明普通粉高劑量組有一定的凝血作用.

表1 普通三七粉與凍干三七粉對(duì)小鼠出血時(shí)間及凝血時(shí)間的影響(mean±SD,n=10)

3.6 三七普通粉和凍干粉對(duì)小鼠耳部腫脹實(shí)驗(yàn)的影響

如表2所示，凍干粉高劑量組能夠明顯減輕二甲苯所致小鼠耳腫脹的腫脹度，與空白組比較有顯著性差異(P<0.05)，表明凍干粉高劑量組有一定的抗炎作用.該組的腫脹率也較低，但是與空白對(duì)照組比較沒(méi)有顯著性差異.

表2 普通三七粉與凍干三七粉對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響(mean±SD,n=10)

3.7 三七普通粉和凍干粉對(duì)小鼠免疫器官的影響

如表3所示，各給藥組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)與空白對(duì)照組比較沒(méi)有顯著性變化，表明三七普通粉和凍干粉對(duì)小鼠的免疫器官均沒(méi)有顯著影響.

表3 普通三七粉與凍干三七粉對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響(mean±SD,n=10)

4 結(jié)果與討論

冷凍干燥技術(shù)的干燥效果好，對(duì)物質(zhì)的影響較小，是生物活性物質(zhì)和許多中藥材較理想的干燥方法.凍干能夠使物質(zhì)中的熱敏成分，例如蛋白質(zhì)、微生物和其他生物活性成分得到保護(hù)，減少易揮發(fā)及易氧化成分的損失，最大限度地保持物質(zhì)原本的性狀.凍干粉加水后溶解迅速而完全.此外，在藥材凍干之后進(jìn)行真空或氮?dú)夥饪冢愿艚^氧氣，低溫存放，能延長(zhǎng)藥材的保存時(shí)間[13].本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，三七凍干粉較三七普通粉，顆粒大小更為均勻，邊緣更為圓潤(rùn)，少見(jiàn)聚集，顆粒更為分散細(xì)膩.溶解度觀察結(jié)果顯示凍干粉溶液的分散更為均勻，進(jìn)一步明確了三七凍干粉在顆粒均一性及溶解度方面的優(yōu)勢(shì).

現(xiàn)代研究表明普通三七粉干燥過(guò)程極易破壞其內(nèi)含的皂苷和揮發(fā)油等活性成分，影響三七的藥用價(jià)值和療效，而凍干三七粉能有效地將這些成分保留下來(lái)[14].而且凍干三七粉含水量少，同等質(zhì)量，凍干三七粉的活性成分含量較高. 因此，凍干三七粉給生產(chǎn)生活帶來(lái)便利的同時(shí)將降低三七炮制過(guò)程中有效成分的損失[15].在本研究中HPLC的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示三七凍干粉與三七普通粉的有效成分含量不同，三七普通粉的三七皂苷R1和人參皂苷Rb1含量較三七凍干粉分別高出14.3%和14.1%，而三七凍干粉中人參皂苷Rg1的含量則高于普通粉10%. 以上結(jié)果表明，三七凍干粉與三七普通粉有效成分的含量存在差異，而有效成分含量的差異可能造成其藥理活性的差異.目前，對(duì)三七凍干粉的藥理活性?xún)?yōu)勢(shì)的闡述并不清楚.

在本研究中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三七普通粉的抗凝血作用較為明顯，而三七凍干粉的抗炎作用明顯優(yōu)于三七普通粉，因此三七普通粉與三七凍干粉的藥理活性存在明顯差異.據(jù)報(bào)道，三七總皂苷具有良好的抗凝血效果，三七總皂苷中又以三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1 3種成分的含量最高. 此外，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1均能夠降低炎癥因子的表達(dá)[16-19]，有明顯的抗炎作用. 因此，三七凍干粉與三七普通粉藥理活性的差異可能與其有效成分的含量存在差異有關(guān)，具體的作用機(jī)制仍有待深入研究.

綜上所述，三七普通粉與三七凍干粉在顆粒均一性、溶解度、有效成分含量及藥理活性方面存在差異.其中，三七凍干粉在顆粒均一性及溶解度方面具有優(yōu)勢(shì)，其人參皂苷Rg1的含量較普通粉高，而三七皂苷R1和人參皂苷Rb1含量較三七普通粉低. 此外，三七普通粉有明顯的促凝血作用，而三七凍干粉則顯示出一定的抗炎活性.本研究首次系統(tǒng)的闡述了三七普通粉和三七凍干粉在有效成分及藥理活性方面的差異，將為三七凍干粉和三七普通粉的應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù).