董永芳，王金全，陳紅菊,楊婉瑩，黃麗波*，王春陽(yáng)*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081)

嘔吐毒素(deoxynivalenol，DON)是禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀桿菌等真菌產(chǎn)生的單端孢烯族類毒素，廣泛存在于糧谷類作物及飼料中。因此谷物及農(nóng)產(chǎn)品一旦被污染DON，則營(yíng)養(yǎng)價(jià)值受到損失嚴(yán)重，并造成農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)嚴(yán)重的損失[1]?，F(xiàn)已證實(shí)長(zhǎng)期食用被DON污染的農(nóng)產(chǎn)品能對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫毒性[2]，影響機(jī)體代謝等毒性作用[3-5]，飼料中含有一定量DON可降低豬的生產(chǎn)性能，并使細(xì)胞的緊密連結(jié)蛋白表達(dá)減少[6-7]。目前對(duì)污染的飼料可采取的脫毒策略有物理脫毒法、化學(xué)脫毒法和生物脫毒法，但DON的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了最有效的脫毒法為生物脫毒法，目前在市場(chǎng)上可以大規(guī)模應(yīng)用的DON脫毒劑鮮少，因此尋找一種有效的脫毒劑至關(guān)重要。

Hsp70(heat shock protein 70，Hsp70)在多數(shù)生物體內(nèi)均有表達(dá)，而且大多數(shù)細(xì)胞都能合成[8]。已證實(shí)其有分子伴侶功能，提高細(xì)胞對(duì)應(yīng)激原的耐受性、抗細(xì)胞凋亡、減輕細(xì)胞過(guò)氧化及炎癥性損傷等作用[9-11]。本課題組的前期研究證實(shí)日糧添加ZEN 引起斷奶仔豬小腸 Hsp70 表達(dá)異常[12]，本試驗(yàn)是在已有的研究基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)豬的飼養(yǎng)試驗(yàn)，驗(yàn)證DON脫毒菌對(duì)DON的脫毒效果，探討脫毒菌對(duì)DON致豬小腸內(nèi) Hsp70 分布和蛋白表達(dá)量的影響，為進(jìn)一步闡明DON脫毒菌在預(yù)防DON對(duì)豬消化機(jī)能的危害提供了試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 日糧鐮刀菌毒素含量的測(cè)定基礎(chǔ)日糧參考美國(guó)NRC (2012)營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)并根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)配制。試驗(yàn)所需日糧于試驗(yàn)正式開始前7 d一次性配制完成。在試驗(yàn)開始和結(jié)束后分別取樣，用以分析飼糧中的鐮刀菌毒素含量。 ZEN(玉米赤霉烯酮)、AFB1(黃曲霉毒素)、DON和 FB1(伏馬菌素)含量采用LC-MC檢測(cè)方法檢測(cè)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所完成。

表1 鐮刀菌毒素含量檢測(cè)結(jié)果 μg/kg

1.2 脫毒菌sp.WJ106脫毒菌：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所王金全提供[13]。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物分組、飼養(yǎng)管理及生長(zhǎng)性能指標(biāo)的測(cè)定試驗(yàn)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取4月齡日齡體質(zhì)量為(55.58±1.83) kg的健康PIC父母代生長(zhǎng)豬24頭，隨機(jī)分為3組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬，組間初始體質(zhì)量差異不顯著(P>0.05)。對(duì)照組：飼喂基礎(chǔ)飼糧； DON組：飼喂添加5 000 μg/kg的DON日糧(實(shí)測(cè)DON含量為5 429 μg/kg)。DON+脫毒菌組：飼喂在DON組日糧的基礎(chǔ)上添加脫毒菌15 mL/kg的日糧。

預(yù)試期7 d，正試期28 d。試驗(yàn)期間單籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水，飼養(yǎng)和免疫按常規(guī)程序進(jìn)行。

試驗(yàn)期間每天記錄試驗(yàn)豬的采食量和剩料量，并根據(jù)以上數(shù)據(jù)計(jì)算平均日增質(zhì)量(ADG) 、平均日采食量(ADFI) 和料質(zhì)量比〔F/G，日增質(zhì)量(g)/采食量(g)〕。

1.4 樣品采集試驗(yàn)結(jié)束后，將生長(zhǎng)豬電擊、放血致死。打開腹腔，快速取十二指腸、空腸和回腸組織(取材位置盡量一致)，1份置于Bouin's液中固定，用于觀察分析Hsp70 陽(yáng)性物質(zhì)分布規(guī)律；1份-80℃ 保存，用于Western blot分析。

1.5 免疫組化(超敏二步法)將石蠟切片(片厚5μm)貼于多聚賴氨酸處理的載玻片上，經(jīng)過(guò)脫蠟、脫苯至蒸餾水，檸檬酸緩沖液(pH 6.0)熱修復(fù)、3% H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、10% 犢牛血清封閉后進(jìn)行Hsp70的免疫組化染色。一抗為兔抗鼠Hsp70多克隆抗體(1∶100，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，4℃過(guò)夜；二抗為Polink-2 plus?超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒(PV-9001，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，DAB 顯色(PA110，TIANGEN)，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片后，在顯微鏡下觀察免疫陽(yáng)性細(xì)胞分布規(guī)律并拍照(陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色)。陰性對(duì)照的一抗用PBS代替，其他步驟相同。

1.6 Hsp70的Western blot分析取50～70 mg 凍存小腸組織，液氮研磨，提取總蛋白質(zhì)，并用BCA法測(cè)其濃度。上樣體積20μL；蛋白含量40 μg；電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h；一抗(兔抗 Hsp70多克隆抗體，1∶200，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；抗β-actin小鼠單克隆抗體，1∶300，碧云天生物技術(shù)有限公司)，4℃ 孵育過(guò)夜，TBST 洗3次；二抗(山羊抗小鼠IgG，1∶2 000，CW0102S；山羊抗兔IgG，1∶2 000，CW0103S，康為世紀(jì))，4℃孵育2 h，TBST 洗3次； ECL顯色(BeyoECL Plus P0081，碧云天生物技術(shù)有限公司)，F(xiàn)usion FX7高端多功能成像系統(tǒng)(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)拍照。

2 結(jié)果

2.1 生產(chǎn)性能檢測(cè)結(jié)果DON對(duì)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能的試驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示日糧中添加DON引起豬的ADG明顯下降(P<0.05 )， F/G顯著升高了(P<0.05)，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。在加入脫毒菌之后(表2)，DON+脫毒菌組豬的ADG有所升高，F(xiàn)/G、ADFI降低，接近對(duì)照組水平。試驗(yàn)過(guò)程中觀察到DON組的豬只在第1周階段的采食量有所下降，隨后豬的采食量又逐漸增加，并且高于對(duì)照組。

表2 DON對(duì)生長(zhǎng)豬生產(chǎn)性能的影響

2.2 小腸中Hsp70的分布觀察結(jié)果免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：十二指腸(圖1)、空腸(圖2)和回腸(圖3)均有Hsp70陽(yáng)性反應(yīng)物分布，Hsp70陽(yáng)性反應(yīng)物主要分布在小腸絨毛黏膜上皮細(xì)胞、小腸腺上皮細(xì)胞內(nèi)，陽(yáng)性反應(yīng)物顏色呈棕黃色、黃色，陰性對(duì)照不著色。DON組的陽(yáng)性反應(yīng)明顯強(qiáng)于對(duì)照組。DON組的3個(gè)腸段的Hsp70的表達(dá)量均提高，其中十二指腸的Hsp70陽(yáng)性表達(dá)量最高，包括小腸絨毛以及小腸腺體均呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，顏色為棕黃色或棕色，空腸段在絨毛上皮的頂端有強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)物分布，顏色為棕黃色，但弱于十二指腸和回腸，回腸段絨毛上皮及小腸腺上皮細(xì)胞的陽(yáng)性反應(yīng)均呈強(qiáng)陽(yáng)性。加入脫毒菌之后，小腸絨毛的陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度較DON組弱，十二指腸絨毛上皮的陽(yáng)性反應(yīng)減弱明顯，但仍高于對(duì)照組，空腸的陽(yáng)性反應(yīng)減弱不明顯，明顯強(qiáng)于對(duì)照組，而回腸段在絨毛上皮也可見陽(yáng)性反應(yīng)減弱明顯，但仍強(qiáng)于對(duì)照組。

圖3 回腸內(nèi) Hsp70的免疫組化結(jié)果及蛋白的相對(duì)表達(dá)量(a,d,g.100 μm；b,c,e,f,h,i.20 μm) 箭頭指示Hsp70的免疫陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì);iv.腸絨毛；ig.小腸腺；ie.腸絨毛上皮。a～c.對(duì)照組；d～f.DON組;g～i.脫毒菌組

圖2 空腸內(nèi) Hsp70的免疫組化結(jié)果及蛋白的相對(duì)表達(dá)量(a,d,g.100 μm；b,c,e,f,h,i.20 μm) 箭頭指示Hsp70的免疫陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì);iv.腸絨毛；ig.小腸腺；ie.腸絨毛上皮。a～c.對(duì)照組；d～f.DON組;g～i.脫毒菌組

圖1 十二指腸內(nèi) Hsp70的免疫組化結(jié)果及蛋白的相對(duì)表達(dá)量(a,d,g.100 μm；b,c,e,f,h,i.20 μm) 箭頭指示Hsp70的免疫陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì);iv.腸絨毛；ig.小腸腺；ie.腸絨毛上皮。a～c.對(duì)照組；d～f.DON組;g～i.脫毒菌組

2.3 Hsp70的Western blot分析結(jié)果結(jié)果表明，生長(zhǎng)豬小腸各段均有Hsp70蛋白表達(dá)(圖4)，DON組以十二指腸Hsp70蛋白相對(duì)表達(dá)量最高(P<0.05)，回腸次之，空腸最低，添加脫毒菌后，十二指腸和回腸的蛋白表達(dá)量明顯較DON組降低，趨于對(duì)照組水平，其中十二指腸最為顯著(P<0.05)，空腸的蛋白表達(dá)量降低不明顯，略高于對(duì)照組水平，無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

3 討論

3.1 DON脫毒菌對(duì)生長(zhǎng)豬生產(chǎn)性能的影響豬對(duì)DON最敏感。研究顯示DON能夠破壞腸道的黏膜免疫，打破腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)，增加了機(jī)體的易感性[14]。DON 經(jīng)口服后可以穿過(guò)機(jī)體小腸屏障被迅速吸收，進(jìn)入血液循環(huán)并分布至外周各器官，F(xiàn)ROBOSE等[15]對(duì)育肥豬飼喂含有4 mg/kg DON的日糧試驗(yàn)結(jié)果顯示育肥豬的ADG與ADFI顯著降低；斷奶仔豬試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.5，3.0 mg/kg2個(gè)劑量的DON會(huì)使ADG和ADFI隨著DON劑量的增加呈劑量依賴性的降低。本試驗(yàn)對(duì)生長(zhǎng)豬的試驗(yàn)結(jié)果同樣出現(xiàn)ADG明顯減少、體質(zhì)量減輕的情形。與已有的研究證實(shí)DON引起生產(chǎn)性能下降的現(xiàn)象相吻合[2,4-5,15]，分析主要因素是DON對(duì)豬小腸粘膜層的損壞，主要是絨毛損傷和上皮脫落，直接影響了腸黏膜上皮對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[7,16]。SUSAN-NED?LL等[17]在探究DON對(duì)易感動(dòng)物的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)DON的強(qiáng)大的飼料抑制作用，在許多情況下，由DON導(dǎo)致豬采食量下降引起的能量和營(yíng)養(yǎng)攝入減少的危害比DON的毒性作用本身更為明顯。而本試驗(yàn)中添加脫毒菌之后在一定程度上提高了生長(zhǎng)豬的生產(chǎn)性能，推測(cè)是脫毒菌減輕了DON對(duì)腸道結(jié)構(gòu)的損傷，提高了營(yíng)養(yǎng)攝入的緣由。

3.2 DON脫毒菌對(duì) 小腸Hsp 70表達(dá)的影響Hsp70是一種高度保守的內(nèi)源性的保護(hù)蛋白，在防止聚集和協(xié)助非天然蛋白的折疊方面具有重要的作用，在正常細(xì)胞中水平普遍較低，在應(yīng)激狀態(tài)下可顯著升高。Hsp70的高表達(dá)也是機(jī)體受到應(yīng)激的信號(hào)標(biāo)志，可能在保護(hù)腸黏膜免受細(xì)胞毒性物質(zhì)侵害和細(xì)胞應(yīng)激的影響方面發(fā)揮重要作用。TONOMURA等[20]認(rèn)為谷氨酰胺對(duì)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用，使細(xì)胞免受熱應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡可能是由Hsp70介導(dǎo)的。Hsp70在仔豬的表達(dá)的試驗(yàn)顯示，斷奶后胃和十二指腸中Hsp70的表達(dá)短暫增加，而回腸中Hsp70的表達(dá)短暫減少[21]，提示同一應(yīng)激條件下Hsp70在小腸3段內(nèi)的表達(dá)存在差異。OTAKA等[22]試驗(yàn)研究證明，Hsp70的過(guò)度表達(dá)可以阻止各種損傷因素引起的大腸黏膜炎癥過(guò)程的發(fā)生，在冰醋酸引起的小鼠結(jié)腸黏膜炎癥反應(yīng)模型中Hsp70是高水平表達(dá)。

完整的腸道的黏膜結(jié)構(gòu)是可以防止攝入飼料污染物的主要屏障，也是防止腸道感染的第一道防線，它有效防止腸道內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素等有害物質(zhì)通過(guò)腸黏膜進(jìn)入體內(nèi)，正常的腸道黏膜屏障由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、生物屏障和免疫屏障共同組成[18]，其中機(jī)械屏障的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)是相鄰腸上皮細(xì)胞之間的緊密連接蛋白[6-7,23]。

而氧化應(yīng)激是恰恰是DON 造成機(jī)體損傷的另一種已知機(jī)制，產(chǎn)生大量自由基消耗體內(nèi)抗氧化劑[23,24]。在本試驗(yàn)結(jié)果中顯示，3個(gè)腸段的Hsp70的表達(dá)量均提高，其中十二指腸的Hsp70陽(yáng)性表達(dá)量最高，包括小腸絨毛以及小腸腺體均呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，筆者分析認(rèn)為在十二指腸，是食糜最先接觸的腸道，DON含量在3個(gè)腸段中最高，所以當(dāng)DON損傷了小腸黏膜上皮細(xì)胞之間的緊密連接蛋白時(shí)，破壞了小腸黏膜的機(jī)械屏障、化學(xué)屏障和生物屏障，導(dǎo)致了胰液和膽汁對(duì)小腸的繼發(fā)損傷，因此激發(fā)了十二指腸黏膜的Hsp70的高表達(dá)。SERGENT等[25]研究發(fā)現(xiàn)，攝入的 DON大部分都在小腸的十二指腸和空腸經(jīng)過(guò)細(xì)胞旁路被吸收進(jìn)血液。本試驗(yàn)回腸段的陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)于空腸但弱于十二指腸，與DAVID等[21]對(duì)仔豬斷奶應(yīng)激引起小腸的Hsp70的表達(dá)相反，我們認(rèn)為可能原因是在回腸段DON濃度降低，但少量的DON會(huì)刺激回腸固有層彌散淋巴組織發(fā)生局部免疫反應(yīng)，進(jìn)而引起了Hsp70的高表達(dá)，同時(shí)也提示Hsp70的表達(dá)與應(yīng)激因素密切相關(guān)。

脫毒劑是通過(guò)改善飼料的品質(zhì)，為動(dòng)物及人類健康提供額外保障。目前對(duì)FB1、ZEA的處理效果均比較成熟，但DON的脫毒劑產(chǎn)品目前市場(chǎng)上僅有百奧明公司獨(dú)享專利成果，因此針對(duì)DON脫毒劑產(chǎn)品的研發(fā)也成為熱點(diǎn)。付苗苗等[26]發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌接種于毒素提取液中72 h后嘔吐毒素濃度可降低至50.0%。也有研究證實(shí)釀酒酵母能與DON結(jié)合[27]，LI等[13]證實(shí)了本次試驗(yàn)使用的DON脫毒菌對(duì)自然霉變小麥產(chǎn)生的DON具有良好的脫毒效果。本試驗(yàn)在加入脫毒菌之后，其3段腸絨毛上皮的陽(yáng)性反應(yīng)皆有所減弱，趨于對(duì)照組水平，依據(jù)已有的試驗(yàn)結(jié)論，根據(jù)該結(jié)果推測(cè)，一種因素是脫毒菌降解了部分DON，減少了腸道對(duì)DON的吸收，另一種原因可能是脫毒菌與腸道菌群一起對(duì)腸道起到了保護(hù)作用，在一定程度上緩解了DON對(duì)腸道的侵害，進(jìn)而改善了Hsp70蛋白的異常表達(dá)。

綜上所述，脫毒菌對(duì)于DON造成的生長(zhǎng)豬生產(chǎn)性能下降和小腸Hsp70蛋白的異常表達(dá)得到正向調(diào)節(jié)。

(感謝山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和山東省畜禽疫病防制工程技術(shù)研究中心為本試驗(yàn)提供的技術(shù)平)