尹寶珍，邵 靜，焦 石，殷成港，夏廣軍

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000)

延邊黃牛是我國(guó)著名的五大地方良種牛之一，生產(chǎn)實(shí)踐證明其具有生產(chǎn)高檔牛肉的遺傳基礎(chǔ)，而隨著分子遺傳學(xué)研究的不斷深入，從分子角度改良肉質(zhì)已成為一種趨勢(shì)。脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4)是脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的一種脂肪因子，能轉(zhuǎn)運(yùn)脂類(lèi)，促進(jìn)細(xì)胞的分化，調(diào)控脂類(lèi)代謝和脂肪沉積。UYSAL等[1]研究表明，敲除小鼠FABP4基因，降低了血漿膽固醇和甘油三酯水平，血脂異常也有所改善。HOASHI等[2]研究發(fā)現(xiàn)，日本黑毛和牛FABP4基因的多態(tài)性與肌內(nèi)棕櫚油酸含量顯著相關(guān)。閆偉等[3]研究表明，藏綿羊FABP4基因多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat，IMF)含量有關(guān)。SUNG等[4]研究表明，韓牛FABP4基因g.3691G>A位點(diǎn)與背膘厚和大理石花紋性狀顯著相關(guān)，可以作為韓牛肉質(zhì)性狀的候選基因。夏廣軍[5]研究發(fā)現(xiàn)FABP4基因在延邊黃牛公牛和閹牛的背最長(zhǎng)肌中差異表達(dá)，推測(cè)可能是影響延邊黃牛肉質(zhì)性狀的候選基因。FABP4基因在畜禽脂肪沉積中發(fā)揮重要作用，但在延邊黃牛群體中的作用機(jī)制尚不明確。本試驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)延邊黃牛不同組織中FABP4基因的表達(dá)水平，分析肌肉組織FABP4基因的表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪沉積的關(guān)系；利用直接測(cè)序和PCR-RFLP技術(shù)分析FABP4基因多態(tài)位點(diǎn)與延邊黃牛肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性，為研究延邊黃牛肌內(nèi)脂肪沉積機(jī)理和肉質(zhì)選育篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物從飼養(yǎng)管理、飼料配方和養(yǎng)殖環(huán)境一致的延邊黃牛育肥牛中隨機(jī)選擇30月齡公牛120頭(由琿春吉興牧業(yè)有限公司提供)。屠宰前每頭牛頸靜脈采血25 mL，加入抗凝劑，分裝-80℃保存?zhèn)溆?；另采集?2,13肋骨間背最長(zhǎng)肌和后腿肌，保存于-20℃，用于測(cè)定肌內(nèi)脂肪和肉質(zhì)性狀。屠宰后隨機(jī)選取3頭公牛采集腎臟、肺臟、心臟、脾臟、肝臟、后腿肌及背最長(zhǎng)肌各3 g，用眼科剪剪成0.3 cm3的組織塊裝入凍存管，投入液氮保存，用于提取總RNA。

1.2 基因組DNA、RNA提取及cDNA的合成參照TIANGEN-血液基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取延邊黃牛DNA樣本，并用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)。

根據(jù)Invitrogen Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提供的方法和步驟，提取延邊黃牛上述組織的總RNA。

在冰上配制混合液：dNTP 混合液(10 mmol/L)1 μL，寡 dT 引物(2.5 μmol/L)1 μL，RNA 2 μL，Nuclease-free H2O 6 μL，Total Volume 10 μL。在 PCR 儀上65℃反應(yīng)5 min；4℃放置。建立反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：上述反應(yīng)液 10 μL，5× 反轉(zhuǎn)錄緩沖液 4 μL，RNase抑制劑(40 U/μL) 0.5 μL，Reverse transcriptase 0.5 μL，Nuclease-free H2O 5 μL，Total Volume 20 μL。反轉(zhuǎn)錄程序：42℃ 30 min；95℃ 5 min；4℃保存。cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR以GAPDH作為內(nèi)參基因，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)FABP4基因在不同組織中的表達(dá)。根據(jù)FABP4、GAPDH基因序列，利用primer5.0和Oligo6.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物。引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量引物序列

反應(yīng)體系：2×miRcute Plus miRNA Premix(with SYBR&ROX)10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL，cDNA 5 μL，Nuclease-free H2O補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)程序：95℃反應(yīng)45 min；94℃反應(yīng)20 s；64℃ 反應(yīng)30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.4 FABP4基因多態(tài)性檢測(cè)

1.4.1引物設(shè)計(jì)與合成 使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)FABP4( NC-007312.4 )引物，引物序列見(jiàn)表2。引物由生工生物技術(shù)有限公司(上海)合成。

表2 PCR檢測(cè)引物序列

1.4.2PCR擴(kuò)增及測(cè)序 PCR擴(kuò)增總體積為20 μL，含2 μL的DNA模板、上下游引物各0.5 μL、7 μL的ddH2O、10 μL的2×Taq PCR Mastermix。程序如下：預(yù)變性95℃ 5 min；變性94℃ 30 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸10 min；4℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，放至凝膠成像系統(tǒng)觀察其擴(kuò)增結(jié)果。將所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及相應(yīng)引物分裝送至生工生物技術(shù)有限公司(上海)進(jìn)行測(cè)序。

1.4.3PCR-RFLP酶切反應(yīng) 將測(cè)序結(jié)果通過(guò)Chromas與原序列進(jìn)行比對(duì)，尋找PCR擴(kuò)增片段上存在的突變位點(diǎn)，并利用最適限制性?xún)?nèi)切酶NlaⅢ酶對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切分型。反應(yīng)體系為：1.4.2擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，0.5 μL，10×CutSmart Buffer 0.5 μL ，37℃酶切2 h，65℃ 20 min終止反應(yīng)，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，放至凝膠成像系統(tǒng)觀察酶切結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)分析采用2-△△CT方法計(jì)算FABP4基因的相對(duì)表達(dá)量，其中△Ct目的基因=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct = △Ct試驗(yàn)組-△Ct對(duì)照組。

采用SPSS Statistics統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one way-ANOVA)，結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P<0.05為結(jié)果差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 FABP4基因組織表達(dá)特征分析由圖1可以看出，以腎臟為參照，F(xiàn)ABP4基因在延邊黃牛7個(gè)組織中都有表達(dá)，表達(dá)水平從高到低依次為心臟、背最長(zhǎng)肌、后腿肌、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟。其中，在心臟中的表達(dá)量極顯著高于脾臟、后腿肌、肺臟、肝臟、腎臟(P<0.01)。

圖1 FABP4基因的組織表達(dá)譜 A.差異極顯著(P<0.01)

2.2 FABP4基因在肌肉組織中的表達(dá)水平與IMF含量的相關(guān)性分析由表3可以看出，背最長(zhǎng)肌組織FABP4 mRNA表達(dá)量與IMF含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)為0.994。后腿肌組織FABP4 mRNA表達(dá)量與IMF含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.952。

表3 FABP4 基因mRNA表達(dá)水平與IMF含量的相關(guān)分析

2.3 延邊黃牛FABP4基因多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)對(duì)延邊黃牛FABP4基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示，在約565 bp處存在單一、明亮的條帶，與目的條帶大小一致；經(jīng)測(cè)序分析，在第三外顯子發(fā)現(xiàn)g.3691 G>A位點(diǎn)，如圖3所示；該位點(diǎn)293 bp處有NlaⅢ酶酶切位點(diǎn)，對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行酶切，如圖4，顯示出3種基因型，即GG基因型(469 bp)；GA基因型(469,236,233 bp)和AA基因型(236,233 bp)。

圖2 FABP4基因位點(diǎn)的擴(kuò)增

圖3 FABP4基因引物g.3691 G>A位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果

圖4 FABP4基因g.3691 G>A位點(diǎn)NlaⅢ酶酶切電泳圖

2.4 FABP4基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析通過(guò)對(duì)FABP4基因多態(tài)性與延邊黃牛肉質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果見(jiàn)表4，可知，g.3691 G>A位點(diǎn)GG基因型的水分含量顯著高于GA和AA基因型(P<0.05)，GA基因型的脂肪含量顯著高于GG和AA基因型(P<0.05)，GG和AA基因型的蛋白含量顯著高于GA基因型(P<0.05)。

表4 FABP4基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

FABP4基因最早被 SPIEGELMAN等[6]在脂肪細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，是研究畜禽脂肪沉積與代謝的熱門(mén)候選基因。談笑[7]利用3T3-L1細(xì)胞超表達(dá)FABP4基因，顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化與脂質(zhì)沉積；干擾FABP4基因表達(dá)，抑制脂肪細(xì)胞的分化。魏勝娟[8]研究表明，F(xiàn)ABP4正向調(diào)控牛脂質(zhì)代謝，在脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著重要作用。屠云潔等[9]研究發(fā)現(xiàn)，清遠(yuǎn)麻雞的FABP4基因主要在腹脂、肝臟中表達(dá)，在心肌、胸肌和腿肌中均不表達(dá)。FABP4基因在鴨的大部分組織中均有表達(dá)，其中在脂肪組織中表達(dá)量最高，在腎、肺、間腦中不表達(dá)[10]。鵝FABP4基因在脂肪、腎、心中表達(dá)量較高，在肌肉、肺、胃、肝、垂體、下丘腦、睪丸中存在微量表達(dá)，在脾、小腸不表達(dá)[11]。LIU等[12]用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FABP4 基因在大鼠各組織中廣泛表達(dá)。李曉玲[13]利用半定量RT-PCR方法檢測(cè)了豬各組織中FABP4基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在背最長(zhǎng)肌、心、脾、肝、肺、腿肌、腎中均有表達(dá)，而腿肌、背最長(zhǎng)肌的表達(dá)量最高，肺的表達(dá)量最低。本研究利用qRT-PCR檢測(cè)了FABP4基因在延邊黃牛不同組織中的表達(dá)量，結(jié)果表明FABP4基因在背最長(zhǎng)肌、心臟、后腿肌、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟都有表達(dá)，在心臟中的表達(dá)量最高，在腎臟中的表達(dá)量最低。心臟中的表達(dá)量極顯著高于脾臟、后腿肌、肺臟、肝臟、腎臟，可能是物種的差異和實(shí)驗(yàn)條件的不同導(dǎo)致本研究結(jié)果與上述報(bào)道不一致。

徐秋良等[14]研究表明，F(xiàn)ABP4基因在90，120，160和200日齡綿羊背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量與相應(yīng)日齡的背最長(zhǎng)肌肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)。GERBENS等[15]研究顯示，豬FABP4基因mRNA表達(dá)量與IMF含量顯著相關(guān)。余俊旭[16]研究發(fā)現(xiàn)，天府肉羊股二頭肌中FABP4基因的表達(dá)量與股二頭肌中IMF含量表現(xiàn)為顯著負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果表明，延邊黃牛后腿肌與背最長(zhǎng)肌中FABP4基因表達(dá)差異顯著，F(xiàn)ABP4基因在后腿肌中的表達(dá)量與IMF含量顯著正相關(guān)，F(xiàn)ABP4基因在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量與IMF含量極顯著正相關(guān)。提示FABP4基因的表達(dá)影響肌內(nèi)脂肪含量，并在不同部位肌肉組織中存在表達(dá)差異。

KENJI等[17]檢測(cè)日本黑牛FABP4 基因多態(tài)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4 基因I74V位點(diǎn)影響脂肪酸的形成。余橫偉等[18]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4基因g.2834 C>G位點(diǎn)CC基因型眼肌面積及脂肪含量顯著高于CG和GG基因型；g.4420 A>G位點(diǎn)TT基因型背膘厚顯著高于CT和CC基因型。CHO等[19]研究發(fā)現(xiàn)FABP4基因220A>G (I74V) 和348+303T>C 位點(diǎn)與牛體內(nèi)脂肪酸沉積和背膘厚顯著相關(guān)。MICHAL等[20]研究發(fā)現(xiàn)牛FABP4基因g.7516 GA位點(diǎn)與延邊黃牛的水分含量、脂肪含量以及蛋白含量呈現(xiàn)不同程度的相關(guān)性(P<0.05)，但與大理石花紋沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性，可能是樣本數(shù)量或遺傳背景不同的影響。綜上所述，F(xiàn)ABP4基因可以作為延邊黃牛肌內(nèi)脂肪沉積和肉質(zhì)性狀的候選基因。

FABP4基因在延邊黃牛不同的組織中的表達(dá)量也不同，表達(dá)水平從高到低依次為心臟、背最長(zhǎng)肌、后腿肌、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟，且心臟的表達(dá)量極顯著高于脾臟、后腿肌、肺臟、肝臟和腎臟。后腿肌組織中FABP4 mRNA表達(dá)量與IMF含量呈顯著正相關(guān)，與背最長(zhǎng)肌組織中IMF含量極顯著正相關(guān)。在FABP4基因還發(fā)現(xiàn)g.3691 G>A突變位點(diǎn)，該位點(diǎn)與延邊黃牛水分含量、脂肪含量、蛋白含量顯著相關(guān)。因此該基因可以作為延邊黃牛肌內(nèi)脂肪沉積和肉質(zhì)性狀的候選基因。