阿如娜，楊 超，陳 灰，魏泓毓，劉 科，賀鵬飛，2*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

子宮內(nèi)膜炎是導(dǎo)致奶牛繁殖力顯著下降的主要疾病之一，據(jù)報道，我國奶牛子宮內(nèi)膜炎年發(fā)病率為30%～40%，在內(nèi)蒙古自治區(qū)患有不孕癥的奶牛中約有66.3% 由子宮內(nèi)膜炎引起，該病極大制約了我國奶牛業(yè)的發(fā)展[1-3]。前列腺素E2(PGE2)為炎癥反應(yīng)中疼痛和發(fā)熱的介質(zhì)，參與炎癥的病理生理過程，PGE2的生物合成受3種酶的順序調(diào)控，磷脂酶A2 (PLA2)- 環(huán)氧合酶(COX)-前列腺素E2合成酶(PGES)[4-7]。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌內(nèi)毒素，在機(jī)體受到革蘭陰性菌感染時，LPS作用于細(xì)胞膜受體引起機(jī)體一系列的炎癥反應(yīng)。在奶牛子宮內(nèi)膜組織、子宮上皮細(xì)胞及輸卵管上皮細(xì)胞中，LPS可上調(diào)COX-2和mPGES-1表達(dá)促進(jìn)PGE2合成，這種效應(yīng)在TAO組眼眶成纖維細(xì)胞也有報道[8-10]。PGE2在炎癥發(fā)生期可促進(jìn)炎癥發(fā)展，抑制PGE2的合成具有抗炎效應(yīng)，其合成途徑是抗炎藥物篩選的有效靶點(diǎn)。

最新的研究進(jìn)展表明，激活免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的α-7nAChR 可以調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)，并且可能成為治療炎癥疾病及炎性細(xì)胞因子相關(guān)疾病的新靶點(diǎn)。α-7nAChR由同源的α-7亞基組成的五聚體，其對 Ca2+具有高度通透性[11]。激活α-7nAChR可以通過下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、Toll樣受體4(TLR4)的表達(dá)、募集 JAK2 蛋白形成異源二聚體并觸發(fā) signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3)介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，負(fù)性調(diào)節(jié)NF-κB 與 DNA 的結(jié)合等機(jī)制參與抗炎效應(yīng)[12]。在人星形膠質(zhì)細(xì)胞中，α-7nAChR可能通過調(diào)節(jié)PGE2合成發(fā)揮抗炎作用[13]，但相關(guān)研究較少，α-7nAChR是否通過調(diào)節(jié)PGE2合成發(fā)揮抗炎作用有待證實(shí)。

在炎性奶牛子宮膜組織中，α-7nAChR是否調(diào)控PGE2合成尚無相關(guān)研究報道。因此，本研究采用LPS刺激奶牛子宮內(nèi)膜組織建立子宮內(nèi)膜炎模型，探討激動α-7nAChR對PGE2合成的關(guān)鍵酶COX-2 和mPGES-1的表達(dá)及PGE2分泌的影響，初步闡明奶牛子宮膜組織α-7nAChR在炎癥發(fā)生時對PGE2合成的調(diào)控機(jī)理，以為后續(xù)α-7nAChR通過調(diào)節(jié)PGE2合成發(fā)揮抗炎作用機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要試劑及儀器BCA 試劑盒(Thermo，德國)；胎牛血清(Inc，中國)；6×蛋白上樣緩沖液(biosharp，中國)；DMEM/F-12(Gibco，美國)；PNU-282987(MCE 生物公司,美國)；青霉素(Gibco，美國)；鏈霉素(Gibco，美國)；脂多糖(LPS，Sigma，美國)；兩性霉素 B、SDS(GENERAY，中國)；甲基牛扁堿(MLA，MCE 生物公司,美國)； AxyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit(Axygen Scientific，美國)；SYBR Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa，日本)；Primer Script RT Master Mix(TaKaRa，日本)；Prostaglandin E2ELISA Kit-Monoclonal item:514010 (Cayman chemical，美國)； T-PER 組織蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑(Thermo，德國)；Western 封閉液、超敏顯色液 ( Pierce，中國 ) ； 蛋白酶抑制劑 ( Pierce，中國 ) ；SDS-PAGE 制膠試劑盒(Solarbio，中國)； Trizma base(Sigma，美國)；COX-2單克隆抗體 ( Cell Signaling，美國) ；β-actin單克隆抗體(天津三箭，中國)；mPGES-1單克隆抗體(Cayman chemical，美國)；羊抗兔 IgG HRP-linked、羊抗鼠 IgG HRP-linked(Cell Signaling，美國)；抗體稀釋液(biosharp，中國)；qPCR引物均由 Invitrogen公司合成。

超純水儀，中國Biotech 公司；高速低溫離心機(jī)，德國 Beckman 公司；制冰機(jī)，日本Panasonic 公司；高壓自動蒸汽滅菌鍋，日本 Hirayama 公司；酶標(biāo)儀，美國 Bio-TEK 公司；低速臺式離心機(jī)，中國上海安亭公司；-80℃低溫冰箱，德國Thermo 公司；電子天平，德國Sartorius 公司；-20℃低溫冰箱，中國美菱公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，法國 Vilber 公司；ABIViiATM7 型實(shí)時熒光定量 PCR 儀，德國Life公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，德國Thermo公司；超凈工作臺，日本Airtech公司。

1.2 試驗(yàn)組織健康奶牛雙側(cè)子宮角采自內(nèi)蒙古呼和浩特市某屠宰場，樣品保存在無菌生理鹽水緩沖液中，1 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，通過肉眼觀察卵泡大小及黃體形態(tài)，選取發(fā)情前期的雙側(cè)子宮角部位組織進(jìn)行組織培養(yǎng)。

1.3 組織培養(yǎng)將新鮮組織用生理鹽水(含100 IU/mL雙抗，2.5 mg/ L兩性霉素 B)沖洗3遍，4℃保存1 h；無菌條件下，縱向剖開子宮角用彎剪刀和眼科鑷子取下將含有子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的子宮內(nèi)膜組織并剪成直徑大小約為2 mm的碎塊，放入含有5 mL培養(yǎng)液(DEME/F-12，10%胎牛血清(血清56℃ 熱滅火30 min)，100 IU/mL雙抗，2.5 mg/L兩性霉素B)的六孔板中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(5% CO2、37℃)培養(yǎng)，每天更換1次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)5 d 直至組織生長穩(wěn)定之后,進(jìn)行藥物處理后收集組織及上清。

1.4 LPS作用時間篩選終濃度1 mmol/L LPS 刺激離體奶牛子宮內(nèi)膜組織，分別培養(yǎng) 2,4,8,12,24 h，應(yīng)用 RT-q PCR 技術(shù)評估組織中的 IL-6 m RNA 的相對表達(dá)量。

1.5 藥物處理把培養(yǎng)5 d的子宮內(nèi)膜組織的培養(yǎng)基換成無雙抗的的DMEM/F-12培養(yǎng)基，試驗(yàn)分為8組，分別為空白對照組、LPS組、LPS與α-7nAChR激動劑組(PUN-282987，5，10，15 mmol/L)，激動劑試驗(yàn)組分別設(shè)立 5 μmol MLA抑制劑組，共7個試驗(yàn)組，每組6個重復(fù)，分別培養(yǎng)12 h，收集樣品，進(jìn)行COX-2 和m PGES-1基因及蛋白表達(dá)及PGE2的檢測。

1.6 總 RNA 提取及 cDNA 合成將各試驗(yàn)組組織稱取40 mg，應(yīng)用組織勻漿機(jī)進(jìn)行研磨，按照說明書提供的方法使用總RNA提取試劑盒提取組織總RNA，通過酶標(biāo)儀檢測總RNA的吸光度，D260 nm/D280 nm值在1.9～2.0，濃度在500～1 000 mg/L之間可進(jìn)行下一步試驗(yàn)；將總RNA濃度調(diào)整到500 mg/L，然后按照說明書提供的方法使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.7 RT-q PCRRT-qPCR 反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ROX 0.4 μL，cDNA 2 μL，水6.8 μL，總計20 μL；反應(yīng)條件為：95℃ 預(yù)變性30 s；95℃ 變性15 s，58℃ 退火34 s；72℃ 延伸30 s，共40個循環(huán)。RT-qPCR 反應(yīng)中所用的引物序列表見1。

表1 引物序列信息表

1.8 總蛋白提取及濃度測定將各試驗(yàn)組組織稱取 40 mg，應(yīng)用組織勻漿機(jī)進(jìn)行研磨，按照說明書提供的方法使用總蛋白提取試劑盒提取組織總蛋白，按照BCA試劑盒操作說明建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定各試驗(yàn)組蛋白濃度，以最低濃度的蛋白質(zhì)樣品為基準(zhǔn)，調(diào)整所有蛋白質(zhì)樣品的濃度一致后，按1∶5比例混合的6×蛋白質(zhì)上樣緩沖液， 置于100℃的金屬加熱器中5 min使蛋白質(zhì)變性。

1.9 SDS-PAGE電泳和Western blot檢測按照SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒說明書，配制12% 的分離膠和5% 濃縮膠，將蛋白樣品依次上樣，在80V電壓下進(jìn)行電泳。根據(jù)預(yù)染Marker選擇截取目的蛋白所在區(qū)域，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)印后的聚偏氟乙烯膜置入封閉液中2 h，一抗4℃ 孵育14 h，TBST液洗膜，10 min /次，共3次；二抗室溫孵育1 h，TBST液洗膜，10 min /次，共3次；然后加入顯色液進(jìn)行顯色，在成像系統(tǒng)中調(diào)節(jié)圖像參數(shù)一致，使用 Image 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.10 ELISA 檢測 PGE2奶牛子宮內(nèi)膜組織培養(yǎng)液10 000 r/min 離心10 min，取上清液，按照 PGE2ELISA 試劑盒操作步驟測定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品D值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算樣品D值相應(yīng)的 PGE2濃度。

2 結(jié)果

2.1 奶牛子宮內(nèi)膜組織LPS炎癥模型時間優(yōu)化由圖1可知，LPS處理奶牛子宮內(nèi)膜組織之后IL-6 mRNA相對表達(dá)水平在12 h最高，并在12 h達(dá)峰值，因此本研究選擇 12 h作為組織 LPS 刺激炎癥模型作用時間。

圖1 LPS不同作用時間IL-6 mRNA相對表達(dá)水平 不同小寫字母間表示差異顯著(P<0.05)

2.2 COX-2 和mPGES-1 基因及蛋白表達(dá)結(jié)果由圖2可知，LPS 刺激奶牛子宮內(nèi)膜組織12 h能夠顯著上調(diào)COX-2 mRNA和蛋白的表達(dá)，α-7nAChR特異激動劑PNU-282987 5，10，15 mmol/L均能顯著抑制COX-2的表達(dá)，α-7nAChR特異抑制MLA能夠明顯抑制激動劑效應(yīng)；LPS 刺激奶牛子宮內(nèi)膜組織 12 h 能夠顯著上調(diào)mPGES-1 mRNA和蛋白表達(dá)，α-7nAChR特異激動劑PNU-282987 5，10，15 mmol/L 均能顯著抑制mPGES-1 mRNA的表達(dá)，α-7nAChR特異抑制MLA可逆轉(zhuǎn)激動劑效應(yīng)，但僅有5 mmol/L試驗(yàn)組差異顯著，激動劑均可抑制mPGES-1蛋白表達(dá)，且抑制劑均可顯著抑制該效應(yīng)，均差異顯著。

圖2 LPS作用奶牛子宮內(nèi)膜組織12 h 及不同濃度藥物處理COX-2和mPGES-1的基因和蛋白相對表達(dá)水平 1.對照組;2.LPS;3.5 mmol/L PNU-282987;4.5 mmol/L PNU-282987+5 mmol/L MLA;5.10 mmol/L PNU-282987;6.10 mmol/L PNU-282987+5 mmol/L MLA;7.15 mmol/L PNU-282987;8.15 mmol/L PNU-282987+5 mmol/L MLA

2.3 PGE2的分泌結(jié)果由圖3可知，與對照組相比較， LPS 刺激奶牛子宮內(nèi)膜組織 12 h 能夠顯著促進(jìn)上清液中PGE2的分泌量，α-7nAChR 特異性激動劑 PNU-282987 5，10，15 mmol/L 均能顯著抑制PGE2的分泌，α-7nAChR 特異性拮抗劑 MLA 均可抑制激動劑效應(yīng)，但只有5，10 mmol/L組差異顯著。

圖3 LPS 作用奶牛子宮內(nèi)膜組織12 h及不同濃度藥物處理 PGE2分泌水平 1.對照組;2.LPS;3.5 mmol/L PNU-282987;4.5 mmol/L PNU-282987+5 mmol/L MLA;5.10 mmol/L PNU-282987;6.10 mmol/L PNU-282987+5 mmol/L MLA;7.15 mmol/L PNU-282987;8.15 mmol/L PNU-282987+5 mmol/L MLA

3 討論

奶牛子宮內(nèi)膜炎是產(chǎn)后奶牛高發(fā)疾病，革蘭陰性菌感染是產(chǎn)后奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要病因， LPS可被子宮上皮細(xì)胞模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)識別，從而激活胞內(nèi)信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌促進(jìn)炎癥發(fā)生[14]，因此本研究采用LPS建立體外組織炎癥模型。IL-6 是評價炎癥模型常用的細(xì)胞因子[15]，由圖 1 可知，LPS 處理奶牛子宮內(nèi)膜組織 12 h IL-6 mRNA 的相對表達(dá)量最高且達(dá)峰值，因此本研究選擇 12 h作為 LPS 處理組織時間點(diǎn)。

前期研究表明， LPS 能誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜組織中單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞COX-2和mPGES-1的表達(dá)升高促進(jìn)PGE2合成，相同的研究結(jié)果在奶牛輸卵管上皮中也有報道[16]。PGE2具有重要的生理及病理作用，在生殖系統(tǒng)中，小劑量的PGE2在機(jī)體排卵，受精、著床及組織再生等生理功能中發(fā)揮重要作用，而較大劑量時則對子宮有直接刺激作用[17]。COX-2是機(jī)體生成PGE2的限速酶，在生理狀態(tài)下表達(dá)量很少，在病理狀態(tài)下當(dāng)機(jī)體細(xì)胞受到炎性刺激時開始表達(dá)。在各種腫瘤和慢性炎癥中均可見COX-2的過量表達(dá)。COX-2在炎癥反應(yīng)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和滑膜細(xì)胞)中大量表達(dá)，促進(jìn) PGE2的生成而參與炎癥反應(yīng)[18]。mPGES-1與炎癥的關(guān)系非常密切，其在體外可被炎癥因子(LPS、TNF-a、IL-1β)誘導(dǎo)而大量表達(dá)，mPGES-1 是 PGE2合成的終末限速酶，與 COX-2 一起參與 PGE2的合成[19]。

抑制COX-2表達(dá)及PGE2分泌具有抗炎抗氧化的作用，臨床上據(jù)此開發(fā)多種有效藥物，如阿司匹林[20]。激活免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的 α-7nAChR 可以調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)。在人星形膠質(zhì)細(xì)胞中，α-7nAChR可能通過調(diào)節(jié)PGE2合成發(fā)揮抗炎作用[10]，但相關(guān)研究較少，α-7nAChR是否通過調(diào)節(jié)PGE2合成發(fā)揮抗炎作用有待證實(shí)。在本研究中，LPS刺激奶牛子宮內(nèi)膜組織可明顯上調(diào)COX-2及mPGES-1表達(dá)并促進(jìn)PGE2釋放，該結(jié)果與前期研究結(jié)果一致。不同濃度α-7nAChR特異激動劑PNU-282987預(yù)處理奶牛子宮組織均可抑制LPS刺激效應(yīng)，顯著降低了COX-2及mPGES-1表達(dá)并抑制PGE2釋放，對于COX-2，α-7nAChR特異阻斷劑MLA均可顯著抑制PNU-282987激動效應(yīng)；mPGES-1雖在mRNA 水平上只有5 mmol/L試驗(yàn)組MLA可逆轉(zhuǎn)激動劑效應(yīng)，但在蛋白水平上各組織抑制效應(yīng)均顯著；PGE2釋放基本與α-7nAChR介導(dǎo)的COX-2及mPGES-1表達(dá)一致。上述結(jié)果表明，奶牛子宮內(nèi)膜組織 α-7nAChR 可通過調(diào)控 PGE2的合成途徑參與炎癥反應(yīng)。

研究結(jié)果表明，奶牛子宮內(nèi)膜組織α-7nAChR激動劑可抑制LPS上調(diào)COX-2 和mPGES-1表達(dá)及PGE2分泌效應(yīng)，證明奶牛子宮內(nèi)膜組織α-7nAChR介導(dǎo)PGE2合成途徑發(fā)揮抗炎效應(yīng)。