張艷，王晨菲，王思瑤，羅荔

新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，烏魯木齊830011

糖尿病是一種代謝紊亂的慢性疾病，我國(guó)成人糖尿病的發(fā)病率逐年上升[1]。糖尿病的直接誘因是胰島素分泌不足[2]。胰島β細(xì)胞的數(shù)量減少與功能障礙均可導(dǎo)致胰島素分泌不足[3]，因此胰島β 細(xì)胞的數(shù)量減少貫穿于整個(gè)糖尿病發(fā)病的過(guò)程[4,5]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)是一類多功能激酶，可調(diào)控細(xì)胞周期各環(huán)節(jié)的起始與進(jìn)程，在細(xì)胞增殖、分化中發(fā)揮調(diào)控作用[6]。CDK的活性失調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。作為新的治療靶點(diǎn)，CDK抑制劑的研究成為目前抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)[7]。近年來(lái)，CDK在胰島β細(xì)胞的損傷以及胰島素分泌中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。CDK可參與胰島β細(xì)胞的各種代謝過(guò)程，如抑制CDK4表達(dá)的小鼠胰島β細(xì)胞中Kir6.2基因表達(dá)下降，胰島素分泌功能受損和葡萄糖不耐癥，促進(jìn)糖尿病的發(fā)生、發(fā)展[8]。具有胰島β細(xì)胞特異性遺傳缺失CDK2小鼠線粒體功能受損、胰島素分泌降低，可導(dǎo)致小鼠對(duì)葡萄糖耐量降低[9]。但CDK4在糖尿病發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制目前尚不明確。2019年5月～2020年1月，我們觀察了抑制CDK8表達(dá)的胰島β細(xì)胞的增殖及胰島素分泌情況，探討其可能作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器 MIN6小鼠胰島β細(xì)胞株購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心ATCC。本試驗(yàn)所用主要試劑包括：胎牛血清(德國(guó)PAN-Biotech公司)，β-巰基乙醇、鏈霉素、青霉素、DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，CCK8試劑盒、胰島素分泌測(cè)定ELISA試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，TRIpureReagent試劑(北京艾德萊生物科技有限公司)，Prime ScriptTM RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM II(日本Takara公司)，RIPA裂解液、BCA蛋白測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，抗人CDK8 單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling公司)，兔抗人GAPDH、Cyclin D1、PCNA、PPARγ抗體(英國(guó)Abcam公司)。CDK8 siRNA 重組慢病毒(可抑制CDK8表達(dá))與siRNA-NC慢病毒(陰性對(duì)照)由上海吉滿生物科技有限公司構(gòu)建。

1.2 細(xì)胞分組及CDK8 siRNA轉(zhuǎn)染方法 將MIN6細(xì)胞加入含15%胎牛血清、2.5 mM β-巰基乙醇、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度80%～90%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，無(wú)菌PBS清洗，0.25%胰蛋白酶消化5 min，傳代培養(yǎng)。將培養(yǎng)細(xì)胞接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，分為3組，每組6個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M不給予任何干預(yù)，陰性組轉(zhuǎn)染siRNA-NC慢病毒液，觀察組轉(zhuǎn)染siRNA-CDK8慢病毒液，方法為用含5 μg/mL Polybrene的新鮮培養(yǎng)基稀釋慢病毒原液，將慢病毒液添加到培養(yǎng)孔中，每孔1 μg/mL，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，棄病毒液，加入完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h備用。

1.3 各組細(xì)胞增殖情況觀察 采用CCK8法。取各組細(xì)胞，1×105/孔接種到96孔板內(nèi)，每組12個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，取各組細(xì)胞，每孔中添加10 μL的CCK8工作液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，按照CCK-8試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上450 nm處檢測(cè)各孔細(xì)胞的光密度OD值，以O(shè)D值代表各組細(xì)胞增殖活性。

1.4 各組細(xì)胞周期分布觀察 采用流式細(xì)胞儀。取各組細(xì)胞，PBS洗滌2次，預(yù)冷的75%乙醇重懸細(xì)胞，-20 ℃下固定24 h，棄乙醇，PBS洗滌2次重懸，每組取450 μL細(xì)胞懸液，加入2 μL的 RNase，37 ℃孵育10 min，加入500 μL碘化丙啶，37 ℃避光孵育30 min，過(guò)300 目篩網(wǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期分布。

1.5 各組細(xì)胞上清液胰島素檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)胰島素水平。取各組細(xì)胞，棄原有培養(yǎng)基，加入500 μL無(wú)糖KRBH溶液，37 ℃孵育1 h，棄無(wú)糖 KRBH 溶液，分別換用500 μL含5 mmol/L、 20 mmol/L Glucose的KRBH 溶液，37 ℃孵育 1 h，4 ℃離心 20 min，收集細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)各組細(xì)胞上清液胰島素。重復(fù)3次，取平均值。

1.6 各組細(xì)胞CDK8、胰島素合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(PDX1、INS2和MAFA)、胰島素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)因子GLUT2 mRNA檢測(cè) 采用熒光定量PCR法。取各組細(xì)胞，根據(jù)TRIpureReagent試劑說(shuō)明提取總RNA，核酸蛋白檢測(cè)儀Nanodrop測(cè)定RNA濃度和純度。按照Prime ScriptTM RT reagent Kit說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作獲得cDNA，根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ說(shuō)明書進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA 2 μL、SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5 μL、無(wú)酶水補(bǔ)足25 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，65 ℃ 45s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH 作為內(nèi)參，以2-ΔΔCt代表目的 mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物由上海吉滿生物科技有限公司合成，具體引物序列見表1。

表1 qRT-PCR法各基因引物序列表

1.6 各組細(xì)胞CDK8、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)、過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體γ(PPARγ)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。采用RIPA裂解液抽提各組MIN6細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。以每孔30 μg上樣進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，分離的蛋白切膠并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別添加兔抗人 CDK8 單克隆抗體(1∶10 000)、GAPDH(1∶5 000)、Cyclin D1(1∶10 000)、PCNA(1∶1 000)、PPARγ(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，次日使用TBST漂洗，并加入辣根過(guò)氧化物酶山羊抗兔二抗(1∶2 000)，再次TBST漂洗，在暗室用ECL發(fā)光液檢測(cè)，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)顯影，用ProtParam軟件對(duì)灰度值進(jìn)行分析。以目的蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白灰度值之比為最終目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。重復(fù)3次,取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖活性比較 培養(yǎng)24 h時(shí)，觀察組、對(duì)照組及空白組細(xì)增殖活性分別為0.38±0.02、0.40±0.03、0.41±0.04，培養(yǎng)48 h時(shí)，觀察組、對(duì)照組及空白組細(xì)增殖活性分別為0.55±0.06、0.64±0.06、0.66±0.07，培養(yǎng)72 h時(shí)，觀察組、對(duì)照組及空白組細(xì)增殖活性分別為0.72±0.07、1.24±0.11、1.30±0.13，培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，與空白組及對(duì)照比較，觀察組細(xì)胞增殖活性降低(P均<0.05)。

2.2 各組細(xì)胞周期分布比例比較 觀察組、對(duì)照組及空白組G0/G1期細(xì)胞比例分別為60.58%±1.17%、49.42%±2.45%、50. 89%±2.53%，與對(duì)照組及空白組比較，觀察組G0/G1期細(xì)胞比例升高(P均<0.05)；觀察組、對(duì)照組及空白組S期細(xì)胞比例分別為26.64±1.08%、39.52%±1.03%、44.69%±2.23%，與對(duì)照組及空白組比較，觀察組S期細(xì)胞比例降低(P均<0.05)；觀察組、對(duì)照組及空白組G2期細(xì)胞比例分別為12.78%±1.40%、5.89%±0.68%、9.59%±1.01%，與對(duì)照組及空白組比較，觀察組G2期細(xì)胞比例升高(P均<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞上清液胰島素水平比較 5 mM Glucose的KRBH溶液刺激各組細(xì)胞后， 觀察組、對(duì)照組及空白組細(xì)胞上清液胰島素水平分別為(212.56±19.89)、(362.01±21.22)、(367.12±23.78)pg/mg，與對(duì)照組及空白組比較，觀察組細(xì)胞上清液胰島素水平降低(P均<0.05)；20 mM Glucose的KRBH溶液刺激各組細(xì)胞后， 觀察組、對(duì)照組及空白組細(xì)胞上清液胰島素水平分別為(546.27±31.35)、(790.45±35.86)、(788.37±45.56)pg/mg，與對(duì)照組及空白組比較，觀察組細(xì)胞上清液胰島素水平降低(P均<0.05)。

2.4 各組細(xì)胞CDK8、PDX1、INS、MAFA、GLUT2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 見表2。

表2 各組細(xì)胞CDK8、PDX1、INS、MAFA、GLUT2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.5 各組細(xì)胞CDK8、Cyclin D1、PCNA、PPARγ蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 見表3、圖1。

3 討論

糖尿病已被認(rèn)為是最普遍和最嚴(yán)重的代謝疾病[3]。由于體內(nèi)產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞僅來(lái)源于胰腺及胰島移植，因此尋找誘導(dǎo)胰島素產(chǎn)生的細(xì)胞和方法對(duì)于糖尿病的治療十分重要。細(xì)胞和組織經(jīng)過(guò)特定處理后可以誘導(dǎo)胰島素的產(chǎn)生[2]。從胰島產(chǎn)生到胰島素分泌的過(guò)程對(duì)于維持機(jī)體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)起到了至關(guān)重要的作用，CDK參與調(diào)節(jié)體內(nèi)胰島β細(xì)胞增殖和胰島素分泌[8]。

表3 各組細(xì)胞CDK8、Cyclin D1、PCNA、PPAR-γ 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖1 各組細(xì)胞Cyclin D1、PCNA及PPARγ表達(dá)情況

CDK8作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶家族中的關(guān)鍵成員，可通過(guò)大亞基的C末端結(jié)構(gòu)域與RNA聚合酶Ⅱ直接相互作用，以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。CDK8作用較廣泛，可調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、增殖、分化以及啟動(dòng) DNA 合成等，并在血清和缺氧反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)以及多種信號(hào)通路等中均發(fā)揮作用[10,11]。CDK8表達(dá)的改變與一些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有直接關(guān)系，其在異常表達(dá)時(shí)導(dǎo)致正常細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)失常，引發(fā)癌癥的發(fā)生與發(fā)展[12]。本研究以CDK8做為靶基因，采用 RNA 干擾技術(shù)沉默胰島β細(xì)胞的CDK8基因表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及胰島素分泌的影響，并分析其相關(guān)機(jī)制。本研究研究結(jié)果表明，干擾CDK8能夠抑制MIN6細(xì)胞的增殖活性，并使細(xì)胞阻滯于G0/G1期。為了探索干擾CDK8對(duì)MIN6細(xì)胞胰島素分泌的影響，我們研究了在5 mM或20 mM Glucose 刺激下胰島素的分泌水平，研究結(jié)果顯示出在20 mM Glucose 高糖刺激下細(xì)胞分泌胰島素的量較5 mM Glucose刺激下明顯增加，但在兩種濃度下干擾CDK8 時(shí)胰島素分泌量均下降，這表明干擾CDK8 表達(dá)后能明顯抑制MIN6細(xì)胞分泌胰島素的功能。

本研究結(jié)果顯示，在MIN6細(xì)胞中干擾CDK8時(shí)，INS2的mRNA被下調(diào)，PDX1、MAFA以及GLUT2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均下降。PDX1和MAFA是胰島素轉(zhuǎn)錄促進(jìn)因子，GLUT2與葡萄糖運(yùn)轉(zhuǎn)相關(guān)[13]。PDX1在胰島β細(xì)胞分化、胰島β細(xì)胞功能維持、胰島發(fā)育以及胰島素基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，PDXl的下調(diào)會(huì)引起胰島素分泌減少、β細(xì)胞功能衰退，進(jìn)一步加重糖脂代謝紊亂，此外，體外研究表明PDXl可以激活各種β細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，例如GLUT2和GCK[14]。MAFA僅在胰島β細(xì)胞中表達(dá)，并充當(dāng)胰島素基因轉(zhuǎn)錄的有效激活劑，MAFA表達(dá)發(fā)生變化時(shí)會(huì)影響血糖含量的變化，從而影響胰島素基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程[15]。GLUT2作為重要的葡萄糖傳感器，是肝臟、胰腺、腎臟、腸和腦中的促進(jìn)性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，胰島β細(xì)胞中的GLUT2可使葡萄糖迅速吸收到細(xì)胞中，在Glucose刺激胰島β細(xì)胞分泌過(guò)程中，Glucose通過(guò)GLUT2轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，從而與葡糖激酶一起參與磷酸化過(guò)程[16]。本研究結(jié)果表明干擾CDK8會(huì)導(dǎo)致胰島素基因轉(zhuǎn)錄因子和GSIS通路相關(guān)基因表達(dá)水平的下調(diào)。

Cyclin是調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程主要因子之一，其中Cyclin D1在細(xì)胞周期G1～S期進(jìn)展中起著重要的作用，可使細(xì)胞停留于G1期[17]，而PCNA是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子之一[18]。PPARγ具有調(diào)節(jié)葡萄糖代謝、抑制炎癥反應(yīng)的作用[19]，已有研究表明，激活PPARγ后，通過(guò)與特定PPARγ反應(yīng)元件序列相結(jié)合來(lái)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，增加組織對(duì)葡萄糖的利用，從而通過(guò)改善胰島素介導(dǎo)的葡萄糖分解能力來(lái)降低血糖[20]。本研究結(jié)果顯示，在MIN6細(xì)胞中干擾CDK8的表達(dá)可下調(diào)Cyclin D1、PCNA和PPAR-γ蛋白表達(dá)水平，這提示CDK8可能與Cyclin D1、PCNA以及PPAR-γ協(xié)同作用，參與了GSIS過(guò)程。

綜上所述，在MIN6細(xì)胞小鼠胰島β細(xì)胞內(nèi)干擾CDK8 會(huì)抑制細(xì)胞的增殖活性，使細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，影響葡萄糖刺激下細(xì)胞分泌胰島素的水平，抑制與胰島素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)因子GLUT2 及胰島素合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PDX1、INS2和MAFA，機(jī)制可能與Cyclin D1、PCNA及PPARγ表達(dá)下降有關(guān)。因此，下調(diào)CDK8可能是糖尿病的發(fā)病機(jī)理之一。