杭建雄，黃 岳，顏欣欣，劉云秋，趙 琪，何 龍，冉榮坤，李 秀，劉菊枚，李國清

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510640)

鉤蟲病是一類被忽視的重要人畜共患寄生蟲病，錫蘭鉤蟲是唯一一種可在人體內(nèi)發(fā)育為成蟲并能引起人的腹瀉、貧血等癥狀的動物源性鉤蟲[1]。定期服用驅(qū)蟲藥是目前治療鉤蟲病的主要方法，但由于鉤蟲的反復(fù)感染以及長期用藥后對藥物產(chǎn)生的抗藥性，導(dǎo)致藥物防治未能取得良好效果[2]。因此，迫切需要探索控制鉤蟲感染的新方法。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase，GSTs)是與細(xì)胞解毒與抗氧化有關(guān)的一種多功能酶，也是蠕蟲主要解毒酶之一。GSTs 不僅對內(nèi)源性或宿主產(chǎn)生的有毒產(chǎn)物發(fā)揮重要的解毒作用，而且還可作為抗寄生蟲感染的疫苗候選分子或藥物靶標(biāo)[3-4]。據(jù)報道，美洲板口線蟲GSTs可參與吸血過程中血紅素的解毒，用GSTs重組蛋白免疫金黃倉鼠可對鉤蟲的攻擊感染產(chǎn)生保護(hù)性免疫，其中Na-GST-1已被遴選為抗人類鉤蟲感染的候選疫苗[5]。目前，在錫蘭鉤蟲成蟲腸道轉(zhuǎn)錄組中共鑒定出13種GSTs，其中編號為ANCCEY-00737的GST與Na-GST-1的相似性最高[6]，具有較高的研究價值，但近幾年國內(nèi)外卻鮮有相關(guān)的報道。本研究旨在對該蛋白編碼基因進(jìn)行克隆表達(dá)與序列分析，并研究其對昆明小鼠的免疫原性，以便了解錫蘭鉤蟲GST分子的致病作用和免疫學(xué)特性，為該病疫苗候選分子或藥物靶標(biāo)的篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲體及菌株蟲體采自廣州華南農(nóng)業(yè)大學(xué)外科實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)犬，根據(jù)FU等[7]的方法鑒定蟲種后置于RNA樣品保存液中-20℃保存。大腸桿菌DH5α和克隆載體pMD18-T購自大連TaKaRa公司；大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自上海Sangon生物工程公司；表達(dá)載體pET-32a由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲教研室保存。

1.2 主要試劑限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ為大連TaKaRa公司產(chǎn)品；弗氏佐劑為上海Sangon生物工程公司產(chǎn)品；犢牛血清、刀豆蛋白、RPMI 1640培養(yǎng)基、細(xì)胞篩均購自廣州市凱閣生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計根據(jù)GenBank上錫蘭鉤蟲GST基因序列(ANCCEY_00737)設(shè)計1對特異性引物，GST-AF(5′-GGATCCATGAGTAA GCGACATCAAGC-3′)和GST-AR(5′-GAATTCTCAGAAGGT GGAGCTCGGT-3′)，下劃線部分分別為BamHⅠ與EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。

1.4 錫蘭鉤蟲GST基因擴(kuò)增與重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建采用Omega microElute Total RNA Kit試劑盒提取錫蘭鉤蟲成蟲總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成GST cDNA第1鏈。以GST-AF/GST-AR為引物，RT-PCR擴(kuò)增錫蘭鉤蟲GST基因。將PCR產(chǎn)物插入pET-32a表達(dá)載體，轉(zhuǎn)至E.coliDH5α中，涂布于含有氨芐青霉素(50 mg/L)的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，按照質(zhì)粒抽提試劑盒抽提重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定，陽性克隆送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序。

1.5 錫蘭鉤蟲GST基因的序列分析利用DNAMAN6.0.3.99軟件翻譯錫蘭鉤蟲Ace-GST基因的氨基酸序列；利用MegAlign7.1.0軟件將Ace-GST與其他GST氨基酸序列進(jìn)行同源性比對；利用MEGA5.05將Ace-GST氨基酸序列與從NCBI下載的13個GST氨基酸序列(圖2)采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 重組蛋白的表達(dá)與純化將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21中于37℃振搖培養(yǎng)至D600為0.6～0.8，加IPTG(1.0 mmoL/L)培養(yǎng)6 h。菌液經(jīng)超聲破碎，分別收集上清與沉淀，用SDS-PAGE分析重組蛋白在菌體中的分布。收集超聲破碎上清，采用鎳柱純化法純化重組蛋白。

1.7 抗GST多克隆抗體的制備30只6周齡昆明小鼠隨機(jī)均分為重組蛋白組(A組)和佐劑對照組(B組)。A組注射重組蛋白Ace-GST，抗原與佐劑乳化后，腹腔多點(diǎn)注射，每次免疫劑量為100 μg/只，間隔2周1次，共3次。B組以PBS代替免疫抗原，同法免疫小鼠。小鼠于免疫前、每次免疫后2周、4周眼緣靜脈采血，每組5只，血樣 37°C放置 1 h 后，轉(zhuǎn)移 4°C冰箱過夜靜置析出血清，5 000 r/min 離心 10 min，收集血清，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 重組蛋白的Western blot分析取10 μg重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳；電泳后分別用His-Tag小鼠單克隆抗體(1∶5 000)、免疫鼠血清(1∶1 000)進(jìn)行Western blot分析。并使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.9 免疫鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)(MTT法)末次采血后，小鼠脫頸處死，無菌取脾，制備脾淋巴細(xì)胞懸液。參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行MTT試驗(yàn)，計算淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(試驗(yàn)孔D490值/對照孔D490值)，采用SAS 9.0統(tǒng)計軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 GST基因的擴(kuò)增及重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，在468 bp左右呈現(xiàn)1條特異性條帶(圖1)，與預(yù)期片段大小相符。重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Ace-GST的雙酶切鑒定結(jié)果顯示，在468 bp處有目的條帶(圖2)，與預(yù)期片段大小一致。

圖1 Ace-GST基因的擴(kuò)增圖 M.DL2000 Marker；1.目的基因

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定 M.DL2000 Marker；1.重組質(zhì)粒

2.2 Ace-GST基因序列分析錫蘭鉤蟲Ace-GST基因全長為468 bp，編碼155個氨基酸。犬源錫蘭鉤蟲Ace-GST基因所編碼的氨基酸序列與錫蘭鉤蟲 ANCCEY_00737(EPB80182.1)的同源性為100%。進(jìn)化樹顯示，犬源錫蘭鉤蟲Ace-GST與ν類GSTs聚為同一分支，其他不同亞家族的GSTs各自聚成不同類群(圖3)。

圖3 不同物種GST以NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹 ●為目的蛋白

2.3 重組蛋白的表達(dá)產(chǎn)物與免疫原性分析重組蛋白的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測的結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示在約36 000(pET32a載體蛋白大小約為20 000)處可見明顯條帶，與預(yù)期蛋白分子質(zhì)量一致；可溶性分析結(jié)果顯示，該蛋白主要存在于裂解物的沉淀中。250 mmol/L咪唑溶液洗脫時，在36 000 左右處獲得了大量重組蛋白，蛋白濃度為0.521 g/L。Western blot結(jié)果顯示，該重組蛋白抗原均能被His-Tag 鼠單克隆抗體和抗重組蛋白免疫血清所識別(圖4)。經(jīng)ELISA檢測，免疫后小鼠IgG抗體效價高達(dá)1∶204 800。

圖4 重組蛋白的SDS-PAGE M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)重組菌pET32a-Ace-GST表達(dá)產(chǎn)物；2.誘導(dǎo)重組菌pET32a-Ace-GST上清；3.誘導(dǎo)重組菌pET32a-Ace-GST沉淀；4.純化的pET32a-Ace-GST蛋白

2.4 昆明鼠淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)(MTT)免疫小鼠淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，免疫組平均刺激指數(shù)2.60±0.06明顯高于PBS對照組1.05±0.03(P<0.05)，表明該重組蛋白顯著刺激免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖。

圖5 Western blot分析 M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.與His-Tag鼠單克隆抗體反應(yīng)；2.與抗重組蛋白免疫血清反應(yīng)

表1 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果(D490 nm)

3 討論

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)是由多個基因編碼、具有多種功能的同工酶，廣泛分布于各種生物體內(nèi)[3]。GSTs不僅可以作為酶類催化一系列有毒分子與谷胱甘肽反應(yīng)，參與白細(xì)胞三烯的轉(zhuǎn)化、H2O2降解、Michael(邁克爾)加成反應(yīng)，還可作為配體結(jié)合蛋白俘獲有毒物質(zhì)[9-10]。游離血紅素是吸血寄生蟲血紅蛋白消化過程的終末產(chǎn)物，對其蟲體具有潛在毒性。鉤蟲與其他吸血寄生蟲(如瘧原蟲)類似，也已進(jìn)化出對游離血紅素的解毒機(jī)制，即通過表達(dá)線蟲特有的ν類GSTs，使其對過氧化氫酶的親和力相對于其他種類的GSTs降低，但結(jié)合游離血紅素的能力提高[11]。本研究首次克隆表達(dá)錫蘭鉤蟲Ace-GST基因，序列分析表明Ace-GST與Na-GST-1和Ac-GST-1類似，同屬于ν類GSTs。

研究表明，美洲板口線蟲Na-GST-1與佐劑Alhydrogel配伍的疫苗具有一定的免疫保護(hù)效果[ 12 ]。其作用機(jī)制可能是誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG可阻斷鉤蟲GST的解毒作用，從而導(dǎo)致游離血紅素的積累而損害蟲體。當(dāng)用重組GSTs免疫時，宿主產(chǎn)生相應(yīng)的中和抗體，干擾蟲體GSTs對血紅素的解毒，導(dǎo)致蟲體死亡或降低其繁殖能力。據(jù)報道，用犬鉤蟲Ac-GST-1免疫犬可產(chǎn)生明顯的免疫保護(hù)作用，腸道寄生的蟲體及糞便中蟲卵數(shù)量均顯著減少[13]。此外，Na-GST-1還可誘導(dǎo)金黃倉鼠產(chǎn)生抗鉤蟲感染的保護(hù)性免疫，其減蟲率可達(dá)40%[5]。本研究用弗氏佐劑乳化的Ace-GST免疫昆明小鼠，對免疫鼠獲得的抗血清進(jìn)行ELISA測定，結(jié)果顯示抗血清效價高達(dá)1∶204 800，IgG水平明顯升高，表明該重組蛋白抗原可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體，具有較好的免疫原性。淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)( MTT) 是反映細(xì)胞免疫功能的傳統(tǒng)方法，其刺激指數(shù)大于1.5時，判定為有效刺激;數(shù)值越大,說明所免疫細(xì)胞群體的反應(yīng)能力和免疫功能越強(qiáng)。在本研究中，免疫組昆明小鼠淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)均大于1.5(2.6左右)，且明顯高于對照組(P<0.05)，表明該重組蛋白能夠促進(jìn)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖。上述結(jié)果表明，Ace-GST可誘導(dǎo)昆明小鼠產(chǎn)生特異性抗體和致敏淋巴細(xì)胞，提示Ace-GST蛋白可能是一種具有抗鉤蟲疫苗潛力的候選分子。